生物合成7-脫氫膽甾醇酵母底盤(pán)的初探

蘇　皖，劉　悅，周　曉，王　穎

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

維生素D3是人體生長(zhǎng)與維持所必需的重要微量元素之一[1]，其代謝產(chǎn)物1,25-二羥維生素D3是人體內(nèi)激素的活性形式，參與調(diào)節(jié)多種代謝反應(yīng)[2]。人體中的維生素D3主要來(lái)自于2個(gè)方面：一是直接從食物中獲得，一是皮膚接受紫外線(xiàn)照射而以7-脫氫膽甾醇為底物合成[3]。7-脫氫膽甾醇可以在無(wú)細(xì)胞體系中通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)生成維生素D3[4]，因此合成7-脫氫膽甾醇是生產(chǎn)維生素D3的關(guān)鍵步驟。

圖1　人體內(nèi)維生素D3的攝取與代謝Fig.1　Vitamin D3 intake and metabolism in human body

目前，合成7-脫氫膽甾醇的技術(shù)主要分為化學(xué)合成[5]和生物轉(zhuǎn)化[6]，化學(xué)合成副產(chǎn)物多、條件難控制、環(huán)境污染嚴(yán)重。生物轉(zhuǎn)化原料成本較高、酶來(lái)源相對(duì)有限，都無(wú)法適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。合成生物學(xué)的興起，為重要醫(yī)藥產(chǎn)品的合成與清潔能源的生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)保證，為變革醫(yī)藥生產(chǎn)方式和轉(zhuǎn)變能源供應(yīng)模式提供了無(wú)限的空間和可能[7]。在工程學(xué)思想地指導(dǎo)下，結(jié)合代謝工程的基礎(chǔ)理論，將基因元件有機(jī)組織起來(lái)，構(gòu)成功能模塊或生物網(wǎng)絡(luò)。選擇適宜的底盤(pán)生物，通過(guò)對(duì)微生物固有代謝路徑的改造和利用，協(xié)調(diào)外源基因的表達(dá)與內(nèi)源代謝路徑的平衡，賦予生物細(xì)胞以嶄新的生命功能，實(shí)現(xiàn)多種醫(yī)藥產(chǎn)品[8-9]和新型能源[10-11]的異源合成?！霸⒛K、底盤(pán)”這一統(tǒng)一的整體，必須協(xié)調(diào)運(yùn)作，才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。

作為合成生物學(xué)的基礎(chǔ)，底盤(pán)細(xì)胞的選擇至關(guān)重要，它承載著所有人工設(shè)計(jì)的生物零件，并且它的穩(wěn)定性必須足以保證復(fù)雜的生物系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)并發(fā)揮功能[12]。釀酒酵母是一種常見(jiàn)的工業(yè)微生物，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種各樣的次級(jí)代謝物。同時(shí)，因?yàn)獒劸平湍甘鞘讉€(gè)被全基因組測(cè)序的真核生物，它也成為分子生物學(xué)研究中的典型的模式生物?；趯?duì)釀酒酵母基因信息的了解，大量分子生物學(xué)的工具被開(kāi)發(fā)，使得異源基因在釀酒酵母中得以穩(wěn)定的表達(dá)[13-14]。解脂酵母作為產(chǎn)油脂模式酵母菌，能利用多種碳水化合物和脂肪為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，對(duì)于甘油酯和烷烴類(lèi)均有較強(qiáng)的代謝能力，這使得它非常適合于工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。根據(jù)合成生物學(xué)的指導(dǎo)思想，通過(guò)引入人源的C24還原酶基因dhcr24，構(gòu)建能夠異源合成7-脫氫膽甾醇的工程酵母[15]。通過(guò)比較生長(zhǎng)、產(chǎn)量、進(jìn)一步改造的潛力，分析兩種底盤(pán)對(duì)于異源表達(dá)7-脫氫膽甾醇的優(yōu)劣。

1　材料與方法

1.1　菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基

本研究所使用的大腸桿菌(Escherichiacoli)BMDH5α 購(gòu)買(mǎi)于博邁德公司，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742以及在此基礎(chǔ)上敲除erg5基因的單基因缺失株ΔERG5均由本實(shí)驗(yàn)室保存，解脂酵母(Yarrowialipolytica)野生型CIBTS0949和缺陷型CIBTS0996菌株由上海工業(yè)技術(shù)研發(fā)中心楊晟老師饋贈(zèng)。

表1　本研究所用的酵母菌株

本研究所使用的大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒pRS425為本實(shí)驗(yàn)室保存。

使用LB培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和保藏，具體成分為：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1；固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉。篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子時(shí)向LB培養(yǎng)基中加入100 μg·mL-1的氨芐青霉素。酵母菌發(fā)酵使用YPD培養(yǎng)基，具體成分為：酵母提取物10 g·L-1，細(xì)菌蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1。重組酵母菌株篩選用SC drop-out培養(yǎng)基，具體成分為：酵母氮源6.7 g·L-1，氨基酸缺省粉末混合物2 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1；固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉。

1.2　基因元件的獲得與菌株構(gòu)建

C24還原酶基因dhcr24編碼一個(gè)依賴(lài)于FAD的氧化還原酶，催化甾體類(lèi)物質(zhì)24位雙鍵的還原[16]。釀酒酵母與解脂酵母的密碼子偏好性相差較大，根據(jù)Genbank中人源C24還原酶的氨基酸序列(GI:114155130)，分別根據(jù)釀酒酵母與解脂酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，由金唯智公司全合成該基因。

以釀酒酵母BY4742的基因組為模版，PCR獲得啟動(dòng)子ENO2p和終止子ADH1t，用重疊延伸PCR的方法將啟動(dòng)子、基因和終止子拼接成1個(gè)大片段，用限制性?xún)?nèi)切酶PstI和BamHI消化該片段，之后連接至用相同的酶消化后的載體pRS425上，得到pSW01，測(cè)序保證其序列的正確性。將pSW01分別導(dǎo)入釀酒酵母BY4742和ΔERG5中，得到SyBE_Sc01100001和SyBE_Sc01100002。

克隆含有解脂酵母TEF啟動(dòng)子、Lip2t終止子以及200bp非解脂酵母內(nèi)源序列t1、t2的質(zhì)粒pYL(t1-TEFp-LIP2t-t2)，啟動(dòng)子和終止子之間有兩個(gè)背向BsmBI酶切位點(diǎn)，可使人源的dhcr24基因無(wú)痕連入啟動(dòng)子和終止子之間，得到C24基因表達(dá)盒t1-TEFp-dhcr24-LIP2t-t2。200 bp非解脂酵母內(nèi)源序列t1和t2的作用是為避免因?yàn)榕c基因組其他區(qū)域有較強(qiáng)的同源性而發(fā)生錯(cuò)誤整合。由于解脂酵母中尚未發(fā)現(xiàn)天然質(zhì)?？晒┯糜诘鞍妆磉_(dá)，我們將C24基因表達(dá)盒整合到解脂酵母中rDNA位點(diǎn)。以解脂酵母CIBTS0949的基因組為模版，擴(kuò)增獲得整合位點(diǎn)上游片段rDNA(up)、下游片段rDNA(down)和篩選標(biāo)記URA，從質(zhì)粒pYL上擴(kuò)增獲得200 bp非解脂酵母內(nèi)源序列t1和t2，用重疊延伸PCR和酶切連接的方式獲得rDNA(up)-URA-t1片段和 t2-rDNA(down)片段。將3個(gè)大片段同時(shí)導(dǎo)入解脂酵母中，利用同源重組將dhcr24基因表達(dá)盒整合到rDNA簇上(圖2)，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，得到SyBE_YL01100001～SyBE_YL01100004。

圖2　解脂酵母中dhcr24基因整合策略Fig.2　Genome integration for dhcr24 in Y.lipolytica

表2　本研究所用的引物

注：酶切位點(diǎn)用斜體+下劃線(xiàn)表示和同源臂用下劃線(xiàn)標(biāo)出。

1.3　酵母轉(zhuǎn)化方法

采用醋酸鋰法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化[17]，具體步驟如下：1)挑取酵母單菌落，接入4 mL適宜的培養(yǎng)基中，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。2)取適量菌液轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，初始OD為0.1，30 ℃培養(yǎng)5 h，OD達(dá)到0.5左右。3)4 000 r/min離心5 min收集菌體，無(wú)菌水洗2遍，0.1 mol/L醋酸鋰洗1遍，置于冰上，得到感受態(tài)細(xì)胞。4)99.9 ℃煮ssDNA 10 min，迅速置于冰上靜置5 min。5)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體系，見(jiàn)表3。6)將轉(zhuǎn)化體系加入感受態(tài)中，渦旋混勻，30 ℃孵育30 min。7)42 ℃水浴中熱擊20 min。8)4 000 r/min離心5 min，丟棄上層清液，用無(wú)菌水洗1遍。9)用100 μL無(wú)菌水重懸菌體，涂在適宜的SC drop-out固體培養(yǎng)基上。30 ℃培養(yǎng)2～4 d。

表3　酵母轉(zhuǎn)化體系

1.4　搖瓶發(fā)酵條件

挑取酵母單菌落，接入4 mL培養(yǎng)基中，30 ℃ 220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，OD600達(dá)到4左右，轉(zhuǎn)接至50 mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取二級(jí)種子接入100 mL YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始OD600為0.2，30 ℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。

1.5　產(chǎn)物提取方法[18]

5 000 r/min離心5 min，丟棄上層清液，收集菌體，用無(wú)菌水洗掉細(xì)胞表面的培養(yǎng)基成分。液氮冷凍并充分研磨，將細(xì)胞粉末加入干凈的離心管中，稱(chēng)取細(xì)胞濕重。向研磨后的細(xì)胞中加入5 mL 1.5 mol/L KOH-甲醇溶液，80 ℃皂化90 min。加入2 mL正己烷，渦旋10 min萃取產(chǎn)物。5 000 r/min離心2 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，冷凍干燥約30 min。用400 μL正己烷溶解產(chǎn)物，再次凍干(大于4 h)。加入200 μL衍生化試劑MSTFA, 37 ℃反應(yīng)2 h。

1.6　GC-TOF-MS檢測(cè)方法[19]

用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。

分析條件如下：電離方式為電子轟擊電離EI+，電子束能量為70 eV，離子化電流為40 μA。質(zhì)譜掃描范圍在m/z50～800，離子源溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，氦氣(99.9995%)作為載氣，91 kPa恒壓模式下操作。柱溫的變化情況為：首先在70 ℃維持2 min，之后以30 ℃·min-1的速度升至250 ℃，再以10 ℃·min-1的速度升到280 ℃并維持15 min，最后以5 ℃·min-1的速度升到290 ℃，并維持5 min。

圖3　7-脫氫膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3　Standard curve of 7-dehydrocholesterol

2　結(jié)果與分析

2.1　釀酒酵母底盤(pán)中7-脫氫膽甾醇的合成

2.1.1野生型釀酒酵母底盤(pán)中7-脫氫膽甾醇的合成

將含有dhcr24基因的質(zhì)粒pSW01導(dǎo)入釀酒酵母BY4742菌株中得到重組酵母菌株SyBE_Sc01100001，以野生型釀酒酵母BY4742作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以考察引入dhcr24基因后，菌體的生長(zhǎng)以及7-脫氫膽甾醇的合成情況。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量發(fā)酵液在不同發(fā)酵時(shí)間于波長(zhǎng)600 nm處的吸光度，得到菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。如圖4所示，SyBE_Sc01100001和野生型BY472，生長(zhǎng)趨勢(shì)上無(wú)明顯差別。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到10～12 h時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)短暫的平臺(tái)期，隨后進(jìn)入二次生長(zhǎng)，60 h后進(jìn)入平臺(tái)期，最終生物量OD600達(dá)到19左右(圖4)。

圖4　釀酒酵母菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4　Growth curves for S.cerevisiae

當(dāng)SyBE_Sc01100001和對(duì)照組BY4742同時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期后(72 h)，離心收集細(xì)胞，提取酵母細(xì)胞中的總固醇，并用GC-TOF-MS對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。7-脫氫膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的分析結(jié)果表明，其出峰時(shí)間為20.83 min，質(zhì)譜的碎片有325、351和366 3個(gè)特征峰。但是SyBE_Sc01100001的GC-TOF-MS分析結(jié)果并沒(méi)有保留時(shí)間為20.83 min的峰，而是與BY4742的結(jié)果幾乎完全一致，在21.46 min出現(xiàn)1個(gè)較高的峰，通過(guò)質(zhì)譜分析，該物質(zhì)為麥角固醇(圖5)。這表明，在釀酒酵母中，麥角固醇合成路徑制約了7-脫氫膽甾醇的合成。

圖5　釀酒酵母菌株GC-TOF-MS分析結(jié)果Fig.5　GC-TOF-MS analysis for S.cerevisiae

2.1.2麥角固醇缺陷型釀酒酵母底盤(pán)中7-脫氫膽甾醇的合成

為了實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中合成7-脫氫膽甾醇，內(nèi)源的麥角固醇合成路徑需要被抑制或阻斷。我們選擇了缺失erg5基因的BY4742菌株(ΔERG5)作為底盤(pán)，將含有dhcr24基因的質(zhì)粒pSW01導(dǎo)入后，獲得了1株重組酵母SyBE_Sc01100002。從生長(zhǎng)曲線(xiàn)上來(lái)看，缺失erg5基因的ΔERG5菌株在對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)情況與BY4742類(lèi)似，但是12 h之后沒(méi)有二次生長(zhǎng)。人源的dhcr24基因?qū)ΖRG5的生長(zhǎng)沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響(圖4)。由于7-脫氫膽甾醇不會(huì)降解亦不會(huì)被釀酒酵母利用，為了便于與BY4742和SyBE_Sc01100001菌株比較，在分析ΔERG5和SyBE_Sc01100002的產(chǎn)物時(shí)，選擇72 h作為發(fā)酵終點(diǎn)。SyBE_Sc01100002在保留時(shí)間為20.82 min 的峰為7-脫氫膽甾醇的峰，搖瓶發(fā)酵SyBE_Sc01100002得到的7-脫氫膽甾醇的產(chǎn)量為2.62 mg·L-1。ΔERG5和SyBE_Sc01100002在22.58 min都有1個(gè)較高的峰，通過(guò)質(zhì)譜分析，該物質(zhì)為fecosterol，也是麥角固醇合成路徑上的中間體，為酵母固醇被ERG6催化所得的產(chǎn)物(圖5)。

2.2　解脂酵母底盤(pán)中7-脫氫膽甾醇的合成

為了尋找更適于生產(chǎn)7-脫氫膽甾醇的底盤(pán)酵母，將dhcr24基因整合到解脂酵母CIBTS0996基因組的rDNA簇位點(diǎn)上，得到SyBE_YL01100001～SyBE_YL01100004 4株工程酵母，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，每隔3 h取樣測(cè)定OD600，得到生長(zhǎng)曲線(xiàn)(圖6)。0～6 h為延滯期，隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 h后幾乎同時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。雖然同為dhcr24整合菌株，但是彼此之間的生長(zhǎng)有差異，SyBE_YL01100002最終生物量OD600只有5左右，SyBE_YL01100001略高有7左右，SyBE_YL01100003 和SyBE_YL01100004最終OD600達(dá)到8左右。

發(fā)酵24 h后收集全部細(xì)胞，用GC-TOF-MS對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析(圖7)。解脂酵母中，保留時(shí)間為20.82 min的峰為7-脫氫膽甾醇的峰，21.46 min的峰為麥角固醇的峰，這說(shuō)明麥角固醇合成途徑?jīng)]有影響dhcr24在解脂酵母中的表達(dá)。在同樣的整合策略下獲得的幾株能夠生產(chǎn)7-脫氫膽甾醇的解脂酵母菌株彼此生長(zhǎng)有差異，產(chǎn)物組成相同，但是目標(biāo)產(chǎn)物7-脫氫膽甾醇的產(chǎn)量有明顯差異，對(duì)應(yīng)于菌株SyBE_YL01100001～SyBE_YL01100004的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量分別是19.04、16.97、27.91 和25.89 mg·L-1。

圖6　解脂酵母菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.6　Growth curves for Y.lipolytica

圖7　解脂酵母GC-TOF-MS分析結(jié)果Fig.7　GC-TOF-MS analysis for Y.lipolytica

3　結(jié)論與討論

1)為了解除微生物自身代謝物對(duì)外源產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，需要對(duì)微生物天然合成路徑進(jìn)行改造，而改造的難度與該代謝物對(duì)微生物生長(zhǎng)的重要性有直接的關(guān)系。7-脫氫膽甾醇的合成與酵母內(nèi)源麥角固醇的合成擁有許多相似的步驟。酵母中麥角固醇的合成是一個(gè)多酶參與的復(fù)雜過(guò)程[20]，根據(jù)不同酶編碼的基因?qū)湍干L(zhǎng)和代謝的影響程度可以將麥角固醇合成途徑上的基因分為必需基因和非必需基因[21]。從酵母固醇到麥角固醇，需要ERG6、ERG2、ERG3、ERG5和ERG4這5個(gè)酶的催化，編碼這5個(gè)酶的基因均為非必需基因[22]。敲除erg5基因能緩解麥角固醇對(duì)7-脫氫膽甾醇的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但是ΔERG5菌株的生物量遠(yuǎn)低于野生型BY4742，這表明麥角固醇的缺失對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的影響。通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化改善麥角固醇缺失菌株的生長(zhǎng)狀況，有利于7-脫氫膽甾醇的合成。副產(chǎn)物fecosterol的出現(xiàn)說(shuō)明可以通過(guò)敲除其他非必需基因而進(jìn)一步抑制麥角固醇合成路徑，避免有限的碳源被浪費(fèi)。

2)在內(nèi)源的代謝路徑未被改造的情況下，通過(guò)基因整合首次實(shí)現(xiàn)了在解脂酵母中生產(chǎn)7-脫氫膽甾醇，其生物量與釀酒酵母ΔERG5菌株相當(dāng)，但是產(chǎn)量具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。解脂酵母細(xì)胞內(nèi)有油滴，油滴的大小和數(shù)量明顯大于釀酒酵母。解脂酵母中使用不同的碳源時(shí)油滴的大小會(huì)發(fā)生變化：采用葡萄糖和甘油等普通碳源時(shí)，顯微鏡下觀測(cè)不到明顯的油滴，但是采用油脂類(lèi)的物質(zhì)作為碳源時(shí)，油滴的數(shù)量多且大小明顯[23]。油滴是由中性脂質(zhì)構(gòu)成的，所以對(duì)于一些疏水性或者極性較弱的物質(zhì)溶解性好，在生產(chǎn)甾醇類(lèi)物質(zhì)的時(shí)候會(huì)減小細(xì)胞的負(fù)擔(dān)。由于在解脂酵母中rDNA簇進(jìn)行基因整合屬于多位點(diǎn)整合[24]，所以外源基因的拷貝數(shù)不同可能是幾株7-脫氫膽甾醇生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)量存在差異的原因。

3)任何與次級(jí)代謝相關(guān)的基因改造都會(huì)對(duì)7-脫氫膽甾醇的產(chǎn)量造成影響。例如，過(guò)表達(dá)甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因可以提高7-脫氫膽甾醇的前體供應(yīng)，發(fā)現(xiàn)酵母內(nèi)源合成路徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，從而有目的地進(jìn)行底盤(pán)菌株的改造。釀酒酵母遺傳背景清晰，適用于釀酒酵母的遺傳操作工具常見(jiàn)易得，未來(lái)進(jìn)一步的基因改造的空間巨大。雖然整合策略帶來(lái)了較高的產(chǎn)量，但是適用于解脂酵母的分子操作工具有限，可以開(kāi)發(fā)更多的工具，使得對(duì)解脂酵母的分子操作變得簡(jiǎn)單易行。例如，除本研究使用的TEF啟動(dòng)子之外，EXP、GPD、GPAT、YAT、XPR2和FBA都是解脂酵母中常見(jiàn)的啟動(dòng)子[25]。

4)解脂酵母具有釀酒酵母所不具備的多種碳源的利用能力，大分子被細(xì)胞分泌的甲殼素打散成小分子顆粒，進(jìn)入解脂酵母內(nèi)。脂類(lèi)先被解脂酵母分泌出的脂肪酶分解為甘油三磷酸和脂肪酸，甘油三磷酸轉(zhuǎn)化為甘油三酰，脂肪酸一方面經(jīng)過(guò)β氧化最終轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，另一方面也會(huì)為甘油三酰的合成提供底物。烷烴類(lèi)物質(zhì)被打散進(jìn)入細(xì)胞后變成脂肪醇，進(jìn)而被氧化成為脂肪酸，通過(guò)β氧化最終轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A[26-27]，解脂酵母對(duì)于甾醇類(lèi)物質(zhì)生產(chǎn)而言具有廣泛的應(yīng)用前景。

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