離子對色譜法測定鹽酸達克羅寧中的雜質

劉明明，張根元，王浦海

(1.南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800； 2.江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇南京211800)

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離子對色譜法測定鹽酸達克羅寧中的雜質

劉明明1，張根元2，王浦海2

(1.南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800； 2.江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇南京211800)

采用Kromasil C18色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(稱取辛烷磺酸鈉2.34 g及KH2PO46.8 g，加H2O 1 L使溶解，用H3PO4調節(jié)pH至3.0)：甲醇(體積比40∶ 60)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長282 nm，柱溫25 ℃。雜質A、B與鹽酸達克羅寧在0.05～0.5 μg/mL范圍內線性關系良好。雜質A、B的平均回收率分別為99.66%和105.1%，相對標準偏差(RSD)分別為2.12%和4.17%。本方法為鹽酸達克羅寧雜質的檢查提供了科學依據(jù)。

鹽酸達克羅寧；離子對色譜法；雜質

鹽酸達克羅寧(Dyclonine hydrochloride，1)，化學名為1-(4-丁氧基苯)-3-(1-哌啶基)-1-丙酮鹽酸鹽，是一種起效快且安全性高的局部麻醉藥[1-2]。中國藥典尚未收載本品，美國藥典第35版規(guī)定以L13柱測定其含量，國內也有采用C18柱進行測定的報道，但這些方法均是用有機相-磷酸二氫鉀[4-7]或有機相-三乙胺[8-9]體系作為流動相，且鮮見其相關雜質檢測的報道。根據(jù)本品的結構特征及合成工藝路線[10]，推測最終產(chǎn)品中可能存在的工藝雜質包括：4-羥基苯乙酮(起始原料，雜質A)和4-丁氧基苯乙酮(中間體，雜質B)；降解雜質包括：1-(4-丁氧基苯基)-2-丙烯-1-丙酮(雜質C)和1-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-丙酮(雜質D)，見圖1。

1—鹽酸達克羅寧；A—4-羥基苯乙酮；B—4-丁氧基苯乙酮；C—1-(4-丁氧基苯基)-2-丙烯-1-丙酮；D—1-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-丙酮圖1 鹽酸達克羅寧(1)及相關雜質Fig.1 Structures of dyclonine hydrochlorido (1) and its related substances

在有機相的體系下色譜檢測鹽酸達克羅寧的主峰峰形拖尾嚴重，且相關雜質分離不佳。為了彌補現(xiàn)有方法的不足，本文建立了一種新的離子對色譜法，在流動相中引入離子對試劑辛烷磺酸鈉，使主峰峰形及主成分與雜質的分離度均得到極大改善。該方法專屬性強、靈敏度高，可適用于鹽酸達克羅寧相關雜質的檢查?？紤]到本品中實際存在A、B兩個已知雜質，雜質C、D僅在強制降解條件下出現(xiàn)，故本研究在新的離子對色譜條件下僅對雜質A、B進行方法學研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽酸達克羅寧(1)對照品(中國生物制品藥品檢定研究院，批號20150402， 含量99.94%)，鹽酸達克羅寧(1)樣品(江蘇省藥物研究所有限公司，批號20150803，20150901，20150903)；有關物質A(江蘇省藥物研究所有限公司，批號：BH-AB02993-150302，含量：99.71% )；有關物質B(江蘇省藥物研究所有限公司，批號：20150701，含量：99.56%)；辛烷磺酸鈉(分析純)，德國默克公司；KH2PO4(分析純)，南京化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司；H3PO4(分析純)，南京化學試劑有限公司；水為自制超純水。

LC-2010A型高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；Micromass ZQ型液質聯(lián)用儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測波長的選擇

取1及有關物質A、B適量，分別用流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 μg的溶液，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2015年版通則0401)測定，在200～400 nm波長范圍內掃描，結果1及有雜質A、B 均在282 nm左右的波長處有最大吸收，故選擇282 nm作為本品雜質的檢測波長。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18硅烷鍵合硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(稱取辛烷磺酸鈉2.34 g及KH2PO46.8 g，加水1 L使溶解，用H3PO4調節(jié)pH至3.0，搖勻)-甲醇(體積比為40∶ 60)；檢測波長282 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

1.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的配制

精密稱取1 10 mg，置50 mL量瓶中，加適量流動相溶解，置水浴中加熱4 h，取出后放冷，加流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.4 雜質混合溶液的配制

精密稱取A、B各10 mg，置于100 mL量瓶中，流動相定容，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.5 雜質對照溶液的配制

精密量取有關物質混合溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.6 供試品溶液的配制

精密稱取1 20 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相適量溶解，并加流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.7 對照溶液的配制

精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

2 結果與討論

2.1 分離度

取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖2所示。由圖2可知：1與相關雜質的分離度均大于2.0，理論板數(shù)以1計算，大于4 000。

1—1；2—雜質A；3—雜質B；4—雜質C；5—雜質D圖2 系統(tǒng)適用性試驗溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the system suitability test solution

2.2 專屬性試驗

取樣品1 10 mg，共6份，各置50 mL量瓶中，振搖使其溶解，分別進行強酸、強堿、氧化、光照和高溫破壞試驗，另一份不作破壞，作對照試驗，其中強酸、強堿樣品進樣前須中和，結果見圖3。由圖3可知：在上述色譜條件下，降解產(chǎn)物與1分離良好，且經(jīng)苛刻條件下破壞后的主峰峰純度符合要求(純度因子大于峰純度閾值)。

圖3 專屬性試驗色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of forced specificity test

由圖3可知：本品1在高溫條件下不穩(wěn)定，降解出了2個主要雜質C和D，該2個主要雜質在已有文獻報道的檢測方法中與主成分難以分離，而在本文色譜條件下與主成分分離良好，說明本色譜條件對本品與相關雜質的分離效果有極大改善。

2.3 線性試驗及校正因子測定

精密稱取1及雜質A、B對照品適量，用流動相溶解并定量稀釋制成濃度為0.05～0.5 μg/mL的1及A、B的混合對照品溶液，作為線性測定系列濃度溶液，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。并以濃度ρ為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線。同時根據(jù)1及雜質A、B線性方程的斜率，計算A、B的校正因子，結果見表1。

表1 線性試驗結果

2.4 重復性試驗

取樣品1，平行配制供試品溶液及對照溶液6份，取20 μL分別進樣，記錄色譜圖。按加校正因子自身對照法計算有關物質，結果6份樣品有關物質A含量的RSD為0.69%、有關物質B含量的RSD為1.48%、單個雜質的相對標準偏差(RSD)為1.22%、總雜質的RSD為1.08%。

2.5 回收率試驗

分別精密稱取1 10 mg共9份，各置50 mL量瓶中，分別精密加入有關物質混合溶液0.5、1.0和1.5 mL，即得50%、100%和150%雜質限度的混合液，各3份，分別進樣測定，計算回收率。結果有關物質A、B的平均回收率為99.66%和105.1%，RSD分別為2.12%和4.17%(n=9)。

2.6 精密度與穩(wěn)定性試驗

取 1及有關物質對照溶液，分別連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算得1及有關物質A、B峰面積的RSD分別為0.85%、1.35%和1.40%。

取1供試品溶液，分別配制后于0、2、4、6、8、12和24 h進樣，記錄色譜圖及峰面積，結果有關物質A、B及1峰面積的RSD分別為0.97%、1.46%和0.80%，未見其他雜質出現(xiàn)，說明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

2.7 樣品測定

取3批樣品1供試品、對照溶液，分別進樣，記錄色譜圖。按加校正因子的自身對照法計算相關雜質，結果見表2。

表2 相關雜質測定結果

由表2可知：鹽酸達克羅寧樣品的相關雜質都被有效檢測出來。因為本品1為一含堿性氮原子的極性化合物，在反相色譜條件下與固定相相互作用較強，導致其拖尾嚴重，峰型差柱效低，且與相鄰雜質分離不佳。反離子對試劑辛烷磺酸鈉的引入，與本品結構中的堿性氮原子相結合形成中性分子的離子對化合物，使得其疏水性增強，與固定相的作用減弱，很好地改善了峰型，極大地提高了柱效，與相關雜質的分離度明顯增加，從而解決了已有文獻報道的方法中鹽酸達克羅寧峰拖尾嚴重、分離度差的問題。

3 結論

本文在參考國內外已報道的鹽酸達克羅寧檢測方法文獻的基礎上，對色譜條件進行了改善，建立了測定本品雜質更為合理、科學的離子對色譜檢測法。通過調整離子對試劑種類、用量、溶液pH及有機相比例，經(jīng)優(yōu)化篩選，最終確立了本方法，為鹽酸達克羅寧雜質的檢查提供了科學依據(jù)。

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(責任編輯 周曉薇)

Determination of impurities in Dyclonine hydrochloride by ion pair chromatography

LIU Mingming1,ZHANG Genyuan2,WANG Puhai2

(1.College of Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800,China;2.Jiangsu Provincial Institute of Material Medica Co.Ltd., Nanjing 211800,China)

A C18column was used,with the mobile phase of phosphate buffer (dissolved octane sulfonic acid sodium salt 2.34 g and KH2PO46.8 g in 1 L water, pH adjusted to 3.0 by H3PO4)：methanol (V/V=40∶ 60) with flow rate 1.0 mL/min at 25 ℃ with the detection wavelength of 282 nm.It was linear for the related substances A,B and Dyclonine hydrochloride in the concentration ranges of 0.05-0.5 μg/mL.The average recoveries of A and B were 99.66% and 105.12%,with RSDs of 2.12% and 4.17%,respectively. This mothod provides a scientific basis for the determination of the Dyclonine hydrochloride substances.

Dyclonine hydrochloride；ion pair chromatography；related substances

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.008

2016-05-12

劉明明(1991—)，女，江蘇南京人，研究方向：藥物制劑及分析；張根元(聯(lián)系人)，副研究員，E-mail：zhanggenyuan63@126.com

R927.1

A

1672-3678(2017)02-0045-04