枯草芽孢桿菌頭孢菌素C脫乙?；ッ冈诖竽c桿菌中的誘導(dǎo)及組成型表達(dá)

朱 穎，馬曉強(qiáng)，楊勝利，魏東芝，蘇二正,2

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室魯華生物技術(shù)研究所，上海200237；2.南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，南京210037)

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枯草芽孢桿菌頭孢菌素C脫乙酰基酯酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)及組成型表達(dá)

朱 穎1，馬曉強(qiáng)1，楊勝利1，魏東芝1，蘇二正1,2

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室魯華生物技術(shù)研究所，上海200237；2.南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，南京210037)

本研究構(gòu)建了8種誘導(dǎo)型質(zhì)粒和16種組成型質(zhì)粒，試圖實(shí)現(xiàn)枯草芽孢桿菌頭孢菌素C脫乙酰基酯酶(CAH)基因在大腸桿菌中的高效異源表達(dá)。經(jīng)過篩選，最終選擇帶有pUC19上的起始位點(diǎn)、SIL3基因、trp啟動(dòng)子以及間隔序列為B1的組成型表達(dá)質(zhì)粒pB1-SIL3-K為最佳表達(dá)質(zhì)粒。將PB1-SIL3-K轉(zhuǎn)入EscherichiacoliDH5α，重組菌在37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，其OD值達(dá)到5.4，酶活達(dá)到了138.61 U/mL。進(jìn)一步通過培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、放大過程等優(yōu)化，在7 L發(fā)酵罐上，CAH最高酶活達(dá)到1 340 U/mL，為目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道最高水平。

頭孢菌素C脫乙?；ッ?；誘導(dǎo)型表達(dá)；組成型表達(dá)；3′-脫乙酰基-7-氨基頭孢烷酸

頭孢菌素類抗生素是抗生素家族的一個(gè)重要分支，它與青霉素同屬β內(nèi)酰胺類抗生素，具有較低的毒性、廣泛的抗菌譜、高效的抗菌作用等優(yōu)點(diǎn)。7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是頭孢菌素類抗生素的重要中間體，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造可以合成一系列的頭孢菌素C(CPC)衍生物。當(dāng)前，以7-ACA為中間體半合成的頭孢菌素類抗生素已發(fā)展到了第四代，其抗菌活性變得更強(qiáng)，抗菌譜也變得更加廣泛。

脫去7-ACA的3′位上的乙?；蟮玫降膸в新懵读u基的化合物為3′-脫乙?；?7-氨基頭孢烷酸(D-7-ACA)，是一種新型的頭孢菌素類抗生素中間體。由于7-ACA的3′位是酯基，半合成時(shí)不易反應(yīng)，而D-7-ACA 的3′位是裸露的羥基，反應(yīng)活性高，易受到親核試劑的進(jìn)攻，因此方便轉(zhuǎn)化，可以添加不同的官能團(tuán)從而得到不同類型的頭孢類衍生物。所以，對(duì)第二、三、四代以及將要到來的第五代頭孢菌素類抗生素的生產(chǎn)來說，D-7-ACA的開發(fā)是一種新的選擇。

D-7-ACA的制備方法分為化學(xué)法與酶法。化學(xué)法一般在-40～-30 ℃下，加入高濃度的強(qiáng)堿對(duì)7-ACA進(jìn)行水解，從而得到D-7-ACA。這種方法能耗高、成本高，得到的D-7-ACA產(chǎn)品含有較多雜質(zhì)且底物的損失近20%～30%，所以導(dǎo)致收率也較低。而酶法可以避免化學(xué)法的上述缺點(diǎn)。酶法分為兩步酶法與一步酶法：兩步酶法是以脫乙?；^孢菌素C(D-CPC)為原料，用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；?GL-7-ACA酰化酶)兩步水解制備D-7-ACA。一步酶法可以D-CPC作為底物，在固定化CPC酰化酶的作用下，一步水解制備D-7-ACA；也可以7-ACA為原料，在固定化脫乙酰基酯酶的作用下，一步水解制備D-7-ACA。不論是兩步酶法還是一步酶法，乙酰基的脫除都需要固定化脫乙?；ッ傅拇呋狻?/p>

脫乙?；ッ?EC3.1.1.41，cephalosporin-C deacetylase(CAH))是酯酶的一種，廣泛存在于許多生物體中，例如柑桔皮、放射土壤農(nóng)桿菌[7-8]、真菌[9-10]、枯草芽孢桿菌[11-14]、紅冬孢酵母[15]、黏紅酵母[16]中。在有水的環(huán)境里，它可以催化CPC與7-ACA酯鍵的水解，從而脫去乙?；兂蒁-CPC與D-7-ACA,同時(shí)生成乙酸。根據(jù)文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道，來源于枯草芽孢桿菌的CAH具有良好的催化性能和穩(wěn)定性，對(duì)底物7-ACA和CPC的親和力高，是制備D-7-ACA的最佳CAH。

本文中，筆者嘗試將不同枯草芽孢桿菌來源的CAH在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)及組成型表達(dá)，以期獲得高表達(dá)CAH的重組大腸桿菌工程菌，為CAH高效、低成本發(fā)酵制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌1.107購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,枯草芽孢桿菌XSA12、YIS和SIL3保藏于華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、JM109，質(zhì)粒pMD19-T、pET-24a、pET-28a、pUC 19、pKK 233-2保藏于生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 工具酶、試劑及藥品

限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、BstEII、PstI、HindIII、NdeI、BamHI與T4 DNA連接酶，F(xiàn)ermentas公司；DNA Marker DL2000、DL5000、DL10000以及PCR用的Premix Taq DNA 聚合酶、Prime STAR HS DNA聚合酶，TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒，北京莊盟國(guó)際生物公司；質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒與DNA凝膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；酵母浸出粉和胰蛋白胨，OXOID公司。其他試劑藥品均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏0.5 g/L；115 ℃濕熱滅菌20 min，用于枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)。

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L；121 ℃濕熱滅菌15 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入15 g/L的瓊脂粉；121 ℃濕熱滅菌15 min。

M9培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，安琪酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L； 115 ℃濕熱滅菌20 min，加入已滅菌的M9基礎(chǔ)鹽(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)。

氨芐青霉素：配制質(zhì)量濃度為100 mg/mL，濾膜無菌過濾后分裝到1.5 mL離心管內(nèi)，-20 ℃冷凍保藏。使用終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

卡那霉素：配制質(zhì)量濃度為100 mg/mL，濾膜無菌過濾后分裝到1.5 mL離心管內(nèi)，-20 ℃冷凍保藏。使用終質(zhì)量濃度為25 μg/mL。

1.1.4 引物

本研究所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因組提取、質(zhì)粒提取、酶切、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、核酸電泳分析、SDS-PAGE蛋白分析等操作均參照文獻(xiàn)`[17]方法。

1.2.1 CAH基因的克隆

根據(jù)已知的來源于枯草芽孢桿菌的脫乙?；ッ傅谋Ｊ匦蛄?，設(shè)計(jì)引物CAH-NdeI和CAH-XhoI，分別以枯草芽孢桿菌1.107、XSA12、YIS和SIL3的基因組作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得4個(gè)枯草芽孢桿菌的CAH基因。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)熱10 min后，以94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min作為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳回收后，與pMD19-T質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，在含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。挑選菌落進(jìn)行菌落PCR,將通過PCR結(jié)果篩選出來的陽性菌保種并送至華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.2 CAH誘導(dǎo)型表達(dá)菌株的構(gòu)建、表達(dá)、純化及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

誘導(dǎo)型菌株構(gòu)建：將經(jīng)過測(cè)序鑒定的克隆菌株E.coliDH5α接種于含有氨芐抗性的新鮮液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h后，收集菌體提取質(zhì)粒DNA。將含有酯酶基因的pMD19-T質(zhì)粒進(jìn)行NdeI與XhoI雙酶切，與同時(shí)用NdeI與XhoI酶切處理過的表達(dá)質(zhì)粒pET-24a、pET-28a進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET24a-1.107、pET24a-XSA12、pET24a-YIS、 pET24a-SIL3和pET28a-1.107、pET28a-XSA12、pET28a-YIS、 pET28a-SIL3。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液均勻涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。挑選菌落進(jìn)行菌落PCR,將通過PCR結(jié)果篩選出來的陽性菌保種并送至華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

重組CAH的表達(dá)：將驗(yàn)證過的誘導(dǎo)型工程菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，取500 μL接種于50 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，至OD處于0.6～1.0之間，加入25 μL 1 moL/L的IPTG開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度選擇20 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)20 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，用0.1 moL/L pH 8.0的磷酸鈉緩沖液重懸菌體，超聲破碎。破碎液在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，使上清酶液與細(xì)胞碎片和包涵體充分分離。上清液進(jìn)行CAH酶活測(cè)定，純化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，同時(shí)，將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

CAH的純化：上述上清液利用鎳(Ni)柱進(jìn)行親和純化。純化好的酶液通過透析12 h除去咪唑等離子，保存待用。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：將透析好的CAH溶液稀釋成同等蛋白濃度的純酶溶液，用0.1 moL/L磷酸鈉鹽配制15 mmoL/L、pH 8.0的7-ACA和CPC溶液100 mL，稀釋成濃度分別2、3、5、8、10和12 mmoL/L的底物溶液，按照測(cè)酶活的方法，加入等量體積的純酶溶液，精確反應(yīng)5 min。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，以0.1 moL/L、pH 8.0的磷酸鈉鹽緩沖液作為空白，高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)反應(yīng)速率隨著底物濃度的變化。根據(jù)液相測(cè)定結(jié)果制作Y(1/V)-X(1/cs)圖，從而計(jì)算得到酶的Km值與最大反應(yīng)速率Vmax。

1.2.3 CAH組成型表達(dá)菌株的構(gòu)建與表達(dá)

組成型質(zhì)粒構(gòu)建：選擇高拷貝的pUC 19質(zhì)粒進(jìn)行改造。首先，將pUC19的氨芐青霉素抗性替換為卡那霉素的抗性；然后，加入強(qiáng)終止子5S rrnT1T2，考察終止子的有無對(duì)菌株表達(dá)以及酶活的影響；利用重疊PCR技術(shù)，將trp啟動(dòng)子與CAH通過重疊PCR方法直接連接。同時(shí)在重疊區(qū)域設(shè)計(jì)不同的堿基組合，可以考察間隔序列堿基不同對(duì)菌種表達(dá)以及酶活的影響。

Kan抗性替代：以pUC 19-XhoI和pUC 19-BstEII為引物，pUC 19質(zhì)粒為模板反向PCR擴(kuò)增，去除其Amp基因部分，并引入了XhoI和BstEII兩個(gè)酶切位點(diǎn);同時(shí)以Kan-XhoI和Kan-BstEII為引物，以pET-28a質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到Kan抗性基因，并引入了XhoI和BstEII兩個(gè)酶切位點(diǎn)。將上述兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，純化后用XhoI和BstEII在37 ℃酶切3 h，回收后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到含有kan抗性的大腸桿菌E.coliDH5α，篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒，將其命名為kan-19。

終止子加入：以Ter-PstI與Ter-HindIII為引物，pKK 233-2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到強(qiáng)終止子5S rrnT1T2序列，回收后與之前提取的kan-19質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行PstI和HindIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，并進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliDH5α，菌落PCR篩選得到含有強(qiáng)終止子5S rrnT1T2序列陽性菌落，并提取質(zhì)粒并命名為kan19-R。

CAH與trp啟動(dòng)子的重疊PCR：以T1-NdeI與T1-B1為引物，大腸桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到尾端帶有序列B1的trp啟動(dòng)子；同樣的，以T1-NdeI與T2-B2，大腸桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到尾端帶有序列B2的trp啟動(dòng)子。以CAH-B1-T1與CAH-BamHI為引物，pET28a-1.107、pET28a-XSA12、pET28a-YIS和pET28a-SIL3為模板，擴(kuò)增前端帶有序列B1的1.107、XSA12、YIS、SIL34種酯酶基因。同理，以CAH-B2-T2與 CAH-BamHI為引物，pET28a-1.107、pET28a-XSA12、pET28a-YIS和pET28a-SIL3為模板，擴(kuò)增前端帶有序列B2的1.107、XSA12、YIS和SIL3這4種酯酶基因。以T1-NdeI與CAH-BamHI為引物，通過重疊PCR的方法，擴(kuò)增得到帶有間隔序列分別為B1和B2的trp啟動(dòng)子與4種基因組合的8個(gè)長(zhǎng)片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切膠回收后連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選陽性克隆后送至華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序，經(jīng)驗(yàn)證正確后保種并提取質(zhì)粒保存待用。

重疊片段與組成型質(zhì)粒的連接：上述獲得的包含有不同組合的8種重疊片段的T載體質(zhì)粒與之前構(gòu)建的kan-19與kan19-R兩種組成型質(zhì)粒同時(shí)用NdeI與BamHI酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選陽性克隆后送至華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序。最終構(gòu)建獲得了16種質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)化不同的宿主：將上述16種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliJM109和E.coliDH5α，得到32株備選工程菌株。其中組成型菌株的表達(dá)使用M9培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 CAH酶活的測(cè)定

以7-ACA或CPC為底物測(cè)定脫乙酰酯酶酶活的方法：用0.1 moL/L、pH 8.0的磷酸鈉緩沖液將底物7-ACA或CPC配成濃度為150 mmoL/L的溶液，取2 mL底物溶液加入到25 mL三角瓶?jī)?nèi)，放置于30 ℃水浴搖床內(nèi)預(yù)熱5 min，加入稀釋好的酶液1 mL，反應(yīng)開始。精確反應(yīng)5 min，取200 μL反應(yīng)液迅速加入到800 μL乙腈中，終止反應(yīng)。用乙腈稀釋10倍后，12 000 r/min離心10 min，取700 μL加入到液相小瓶中，用高效液相色譜法對(duì)5 min內(nèi)產(chǎn)物D-7-ACA或D-CPC的生成量進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相(體積分?jǐn)?shù))：15%甲醇、7.5%乙腈以及77.5%的1.29%乙酸溶液。使用反向柱 XDB C-8 column (Zorbax,4.6 mm×150 mm)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol D-7-ACA或D-CPC所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 4株枯草芽孢桿菌CAH的克隆

根據(jù)已知的來源于枯草芽孢桿菌的脫乙?；ッ富蛐蛄?，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增用的特異性引物CAH-NdeI與CAH-XhoI。以枯草芽孢桿菌1.107、XSA12、YIS和SIL3的基因組作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見圖1。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行電泳結(jié)果的觀察與目的條帶的切膠回收。由圖1可知：4個(gè)樣品泳道都在1 000 bp左右處出現(xiàn)清晰單一的條帶，與已知的脫乙?；ッ富?957 bp)大小相符，證明4株枯草芽孢桿菌的基因組中都含有脫乙酰酯酶的基因。

M為DL 5 000 Marker;1為CAH-1.107；2為CAH-XSA12；3為CAH-YIS； 4為CAH-SIL3圖1 PCR獲得脫乙酰基酯酶基因Fig.1 PCR product of CAH gene

對(duì)目的基因進(jìn)行膠回收?；厥占兓钠闻c擴(kuò)增質(zhì)粒pMD19-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α。轉(zhuǎn)化成功后，利用藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選陽性重組子，經(jīng)PCR鑒定后送至華大基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：4種目的基因大小都是957 bp，兩端都含有NdeI與XhoI酶切位點(diǎn)，但基因DNA序列的個(gè)別堿基略有不同。考慮到密碼子存在兼并性，將4種酯酶基因的DNA序列翻譯為氨基酸后，再與日本鹽野義公司的枯草芽孢桿菌SHS 0133所表達(dá)的脫乙?；ッ高M(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)，結(jié)果如表2所示。由表2可知：本研究獲得的4種不同枯草芽孢桿菌來源的CAH基因所表達(dá)的蛋白都不相同，但是差異不大，且差異位點(diǎn)皆不是其活性位點(diǎn)。與鹽野義公司的CAH序列相似度在98%～99%之間，其中XSA12與SIL3與之差異最小，只有3個(gè)氨基酸的差異。將上述4種CAH基因提交GenBank 獲得相應(yīng)的登錄號(hào)：JX036322～JX036325。

表2 4種CAH與鹽野義公司CAH的氨基酸序列差異

注：括號(hào)中為鹽野義公司CAH的氨基酸。

2.2 4種CAH在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

提取含有酯酶CAH基因的pMD19-T質(zhì)粒，與誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pET-24a、pET-28a一起用限制性內(nèi)切酶NdeI與XhoI進(jìn)行雙酶切。將酶切后的CAH基因片段與pET-24a、pET-28a酶切片段進(jìn)行回收純化，連接后轉(zhuǎn)入克隆型菌株大腸桿菌E.coliDH5α中。菌落PCR法分別篩選出8株陽性克隆并保種，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)型菌株大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)中。利用菌落PCR的方法，對(duì)轉(zhuǎn)化后涂布的8個(gè)LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行陽性克隆的篩選。將8株P(guān)CR驗(yàn)證過的陽性克隆菌送去華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：誘導(dǎo)型菌株全部構(gòu)建成功，分別得到了CAH前端不含His標(biāo)簽的誘導(dǎo)型工程菌E.coliBL21/pET24a-1.107、E.coliBL21/pET24a-XSA12、E.coliBL21/pET24a-YIS、E.coliBL21/pET24a-SIL3；CAH前端帶有His標(biāo)簽的誘導(dǎo)型工程菌E.coliBL21/pET28a-1.107、E.coliBL21/pET28a-XSA12、E.coliBL21/pET28a-YIS、E.coliBL21/pET28a-SIL3。

將上述8株工程菌接種于LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在IPTG的誘導(dǎo)下，20 ℃培養(yǎng)20 h，菌體OD為2.0～2.5。離心收集菌體后清洗2次，最后加入0.1 mmoL/L、pH 8.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行破碎。破碎后全部進(jìn)行聚丙烯酰胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)，驗(yàn)證8株工程菌的目的蛋白的表達(dá)情況。蛋白電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：4種基因與pET-24a、pET-28a質(zhì)粒組合的8株工程菌都在3.5×104左右出現(xiàn)明顯的目的條帶(與推測(cè)蛋白大小3.6×104基本相符)，說明經(jīng)過誘導(dǎo)，它們都正常地表達(dá)了目的蛋白CAH。從基因差別上分析，XSA12與SIL3基因表達(dá)的活性蛋白量都要多于YIS與1.107基因，YIS基因表達(dá)量雖然較多，但多為無活性的包涵體，上清中的活性目的蛋白條帶不明顯；從質(zhì)粒的角度上來看，pET-28a質(zhì)粒對(duì)目的基因的表達(dá)情況都要略好于pET-24a質(zhì)粒。

M為蛋白Marker；1為E.coli BL21/pET24a-1.107菌體破碎后的上清與沉淀；2為E.coli BL21/pET28a-1.107菌體破碎后的上清與沉淀；3為E.coli BL21/pET24a-XSA12菌體破碎后的上清與沉淀； 4為E.coli BL21/pET28a-XSA12菌體破碎后的上清與沉淀；5為E.coli BL21/pET24a-YIS菌體破碎后的上清與沉淀；6為E.coli BL21/pET28a-YIS菌體破碎后的上清與沉淀；7為E.coli BL21/pET24a-SIL3菌體破碎后的上清與沉淀；8為E.coli BL21/pET28a-SIL3菌體破碎后的上清與沉淀圖2 8株誘導(dǎo)型菌株的CAH表達(dá)Fig.2 CAH expression of 8 inducible strains

將8株工程菌表達(dá)的CAH粗酶酶活測(cè)定結(jié)果列于表3中。由表3可以看出：不論是pET-24a質(zhì)粒還是pET-28a質(zhì)粒，XSA12與SIL3基因表達(dá)的CAH酶活都比另外2種基因要高，且SIL3的酶活最高，其中表達(dá)酶活最低的是YIS基因所表達(dá)的CAH。結(jié)合圖2的電泳結(jié)果可以看出：雖然YIS基因的表達(dá)量不小，但多為無活性的包涵體；總體上看，誘導(dǎo)型質(zhì)粒pET-28a對(duì)目的基因的表達(dá)情況也要優(yōu)于pET-24a質(zhì)粒，這與蛋白電泳圖一致。綜上所述，表達(dá)量與酶活最高的為工程菌E.coliBL21/pET28a-SIL3，其酶活為45.89 U/mL。

表3 4種CAH基因不同重組菌表達(dá)酶活的比較

注：*以7-ACA作為底物測(cè)定酶活。

2.3 4種CAH的純化及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

因?yàn)檎T導(dǎo)型工程菌E.coliBL21/pET28a-1.107、E.coliBL21/pET28a-XSA12、E.coliBL21/pET28a-YIS和E.coliBL21/ pET28a-SIL3表達(dá)的CAH前端帶有His標(biāo)簽，所以可以利用Ni柱進(jìn)行純化。對(duì)洗脫濃度進(jìn)行了一系列的優(yōu)化后，確定了用洗脫液NPI 20洗滌與Ni柱結(jié)合的雜蛋白、用洗脫液NPI 150洗脫Ni柱結(jié)合的目的蛋白的純化方法，最終得到了4種較純的目的蛋白CAH。進(jìn)行蛋白電泳，結(jié)果如圖3所示。由圖3發(fā)現(xiàn)，純化后的蛋白較為純凈，雜帶不明顯，可以用于后續(xù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究。

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1為CAH-1.107；2為CAH-XSA12；3為CAH-YIS；4為CAH-SIL3圖3 4種重組CAH的純化Fig.3 Purification of the four kinds of recombinant CAH

通過比較4種純酶的Km值，可以比較其催化性能的優(yōu)劣。因?yàn)镃AH也可用于CPC轉(zhuǎn)化為D-CPC的反應(yīng)，所以分別測(cè)定了4種純酶對(duì)7-ACA、CPC的Km值。經(jīng)過多次重復(fù)與平行試驗(yàn)，最終得到對(duì)7-ACA、CPC的Km值與Vmax值，結(jié)果如表4所示。

表4 4種CAH對(duì)底物7-ACA、CPC的Km值與Vmax值

由表4可知:在4種基因中，SIL3基因所表達(dá)的CAH對(duì)7-ACA、CPC的Km值都是最低值，分別為9.88和17.6，說明它對(duì)7-ACA、CPC都有最佳的親和力，可以高效地與底物結(jié)合，進(jìn)而催化底物7-ACA、CPC轉(zhuǎn)化成D-7-ACA、D-CPC。日本鹽野義制藥公司枯草芽孢桿菌SHS 0133 CAH對(duì)7-ACA、CPC的Km值分別為7.90 和24.0[13]。而SIL3基因所表達(dá)的CAH對(duì)7-ACA的Km值略高于鹽野義公司CAH，對(duì)CPC的Km值低于鹽野義公司CAH。因此，SIL3基因所表達(dá)的CAH也具有工業(yè)化開發(fā)的潛力。

2.4 4種CAH在大腸桿菌中的組成型表達(dá)

構(gòu)建的8株誘導(dǎo)型菌株在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，20 h后菌體密度最大也只能達(dá)到2.5左右，且誘導(dǎo)型菌株需要誘導(dǎo)劑的加入和低溫條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)備要求高、成本高，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，有必要構(gòu)建一種適用于CAH在大腸桿菌中高效表達(dá)的組成型表達(dá)系統(tǒng)。啟動(dòng)子序列、質(zhì)粒拷貝數(shù)以及SD序列與起始密碼子ATG的間隔序列的長(zhǎng)度、堿基組成都能對(duì)蛋白的表達(dá)造成重要影響。為此，按照1.2.3節(jié)的方法，本研究構(gòu)建了16種CAH組成型表達(dá)質(zhì)粒(表5)，并考察了它們CAH基因的表達(dá)情況。

表5 16種質(zhì)粒的組成情況

2.4.1 間隔序列堿基組成對(duì)CAH表達(dá)的影響

為了考察SD序列與起始密碼子ATG之間的間隔序列堿基組成對(duì)CAH表達(dá)的影響，選用同樣是不含終止子序列的B1-XSA12-K、B1-SIL3-K與B2-XSA12-K、B2-SIL3-K兩組質(zhì)粒，對(duì)其工程菌進(jìn)行培養(yǎng)并考察發(fā)酵24 h后的CAH的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出：SD序列與ATG的間隔序列的堿基差異對(duì)于基因的表達(dá)有很大影響。與間隔序列為B2的工程菌相比，間隔序列為B1的工程菌的酶活都更高，蛋白電泳圖中可以看出目的蛋白條帶更粗、雜帶更少。酶活測(cè)定結(jié)果表明(數(shù)據(jù)未顯示)：當(dāng)間隔序列為B1時(shí)，XSA12、SIL3的酶活達(dá)到110.22和114.71 U/mL，分別是對(duì)應(yīng)間隔序列為B2的1.89倍與1.67倍。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定SD序列與起始密碼子ATG的間隔序列的堿基組成對(duì)基因表達(dá)的確起著重要的影響。在本研究中，當(dāng)間隔序列為B1時(shí)更適合于CAH的表達(dá)。推測(cè)原因可能是以B1作為間隔序列時(shí)，能使SD序列與起始密碼子ATG之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，并能將SD序列與起始密碼子拉到最適距離，并通過將起始密碼子ATG放于莖環(huán)結(jié)構(gòu)突出的環(huán)形“頭部”，使與SD序列結(jié)合的核糖體小亞基更快地識(shí)別出起始密碼子并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始。而以B2作為間隔序列時(shí)，可能形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)沒有間隔序列B1那么穩(wěn)定，所以在轉(zhuǎn)錄效率上略低一些。

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1、2分別為E.coli DH5α/B1-XSA12-K破碎后的上清與沉淀；3、4分別為E.coli DH5α/B1-SIL3-K破碎后的上清與沉淀；5、6分別為E.coli DH5α/B2-XSA12-K破碎后的上清與沉淀；7、8分別為E.coli DH5α/B2-SIL3-K破碎后的上清與沉淀圖4 間隔序列堿基組成對(duì)CAH表達(dá)的影響Fig.4 Effects of the spacing sequence composition on the CAH expression

2.4.2 終止子有無對(duì)CAH表達(dá)的影響

為了考察終止子的有無對(duì)基因表達(dá)的影響，選用同樣含有SD序列與ATG的間隔序列為B1的B1-XSA12-K、B1-XSA12-R與B1-SIL3-K、B2-SIL3-R兩組質(zhì)粒，對(duì)其工程菌進(jìn)行培養(yǎng)并測(cè)定發(fā)酵24 h后的OD、酶活與比酶活，結(jié)果見表6。由表6可以看出，終止子的有無對(duì)于基因的表達(dá)有很大影響。與對(duì)應(yīng)的不含終止子序列的工程菌相比，含有終止子序列的工程菌的菌濃與酶活都偏低，約為前者的30%～40%，但比酶活水平基本一致。推測(cè)原因是由于終止子的存在，使得細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)錄的監(jiān)控更加嚴(yán)密，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢而導(dǎo)致蛋白表達(dá)量低。

表6 終止子序列對(duì)重組菌株表達(dá)CAH的影響

2.4.3 不同CAH基因的組成表達(dá)

雖然2.3節(jié)中研究了不同CAH對(duì)底物CPC與7-ACA的催化能力，但是由于質(zhì)粒的更換以及各基因調(diào)控元件的變化，可能對(duì)各基因本身的蛋白表達(dá)水平造成了不同的影響。為了選擇最優(yōu)的CAH基因與質(zhì)粒的組合從而得到最佳工程菌，需要研究與新載體組合后各基因的蛋白表達(dá)能力。選用同樣不含終止子序列、SD序列與ATG的間隔序列為B1的B1-1.107-K、B1-XSA12-K和B1-YIS-K、B1-SIL3-K 4種質(zhì)粒，對(duì)其工程菌進(jìn)行培養(yǎng)并測(cè)定發(fā)酵24 h后的OD、酶活與比酶活，結(jié)果見表7。由表7可以看出：相對(duì)于1.107、YIS基因，SIL3與XSA12基因的蛋白表達(dá)水平和蛋白產(chǎn)物對(duì)底物CPC與7-ACA的催化能力更高。其中，SIL3基因表達(dá)出來的CAH蛋白對(duì)底物CPC與7-ACA表現(xiàn)出最高的酶活與比活，而YIS雖然得到表達(dá)，但多為包涵體形式，酶活、比酶活較低，這些都與誘導(dǎo)型質(zhì)粒的表達(dá)情況基本一致。

2.4.4 宿主對(duì)CAH表達(dá)的影響

不同宿主對(duì)組成型質(zhì)粒的表達(dá)也具有很大的影響。選用同樣不含終止子序列、SD序列與ATG的間隔序列為B1的B1-1.107-K、B1-XSA12-K、B1-YIS-K、B1-SIL3-K這4種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入不同的宿主E.coliDH5α和E.coliJM109中，研究宿主不同對(duì)基因表達(dá)的影響，結(jié)果見表8。由表8可以看出：在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，含有相同質(zhì)粒的以E.coliJM109為宿主菌的工程菌比以E.coliDH5α為宿主菌的工程菌生長(zhǎng)慢，表達(dá)的酶活低，所以選擇E.coliDH5α作為宿主來進(jìn)行CAH的表達(dá)。

表7 不同CAH基因的組成型表達(dá)情況

表8 不同宿主菌對(duì)CAH表達(dá)的影響

通過對(duì)上述幾個(gè)因素的考察，最終選擇帶有pUC19上的起始位點(diǎn)、SIL3基因、trp啟動(dòng)子以及間隔序列為B1的組成型表達(dá)質(zhì)粒pB1-SIL3-K為最佳表達(dá)質(zhì)粒，以E.coliDH5α為最佳宿主菌。重組菌E.coliDH5α/pB1-SIL3-K在37 ℃培養(yǎng)24 h，酶活達(dá)到了138.61 U/mL。以E.coliDH5α/pB1-SIL3-K為工程菌株，對(duì)其培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、放大過程等進(jìn)一步做了優(yōu)化，在7 L發(fā)酵罐上，培養(yǎng)24 h后CAH最高酶活達(dá)到1 340 U/mL，此表達(dá)水平高于鹽野義公司的報(bào)道值[12]，為目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平。

3 結(jié)論

從不同枯草芽孢桿菌中克隆CAH基因，并嘗試在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)，以期獲得最佳的CAH大腸桿菌重組表達(dá)工程菌，為CAH高效、低成本發(fā)酵制備奠定基礎(chǔ)。論文主要結(jié)論如下：

1)從4株枯草芽孢桿菌中克隆得到4個(gè)不同CAH基因序列1.107、XSA12、YIS、SIL3。

2)4個(gè)CAH基因通過兩種誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒(pET-24a與pET-28a)重組表達(dá)，酶活最高的誘導(dǎo)型工程菌為E.coliBL21/pET28a-SIL3，培養(yǎng)24 h，酶活達(dá)到45.89 U/mL。

3)SIL3基因所表達(dá)的CAH對(duì)7-ACA、CPC的Km值都是最低值，分別為9.88 mmoL/L和17.60 mmoL/L。

4)SD序列與起始密碼子ATG的間隔序列的堿基組成、終止子、CAH基因差異、宿主菌差異對(duì)CAH的組成型表達(dá)均有影響。

5)E.coliDH5α/pB1-SIL3-K為最佳的組成型表達(dá)菌株，培養(yǎng)24 h，OD可以達(dá)到5.40，以7-ACA為底物測(cè)定酶活達(dá)到138.61 U/mL。經(jīng)過優(yōu)化及放大，培養(yǎng)24 h后CAH最高酶活達(dá)到1 340 U/mL。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Inducible and constitutive expression of cephalosporin-Cdeacetylase fromBacillussubtilisinEscherichiacoli

ZHU Ying1,MA Xiaoqiang1,YANG Shengli1,WEI Dongzhi1,SU Erzheng1,2

(1.New World Institute of Biotechnology,State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Enzyme and Fermentation Technology Laboratory,College of Light Industry Science and Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

In this work,8 inducible plasmids and 16 constitutive plasmids were constructed to fulfil the high-level heterogenous expression of cephalosporin-C deacetylase (CAH) gene inEscherichiacoli. A constitutive expression plasmid pB1-SIL3-K,with a replication origin derived from pUC19 and B1 sequence between theSIL3gene andtrppromoter,was selected as the most efficient expression plasmid.The OD and CAH activity expressed byE.coliDH5α/pB1-SIL3-K attained 5.4 and 138.61 U/mL when cultivating at 37 ℃ for 24 h.Furthermore, 1 340 U/mL of CAH activity was obtained in a 7-L fermenter by optimizing the medium components,culture conditions and scale-up process,which is the highest CAH activity reported to date.

cephalosporin-C deacetylase; inducible expression; constitutive expression; 3′-deacetyl-7-aminocephalosporanic acid

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.004

2016-06-27

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB721003)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA022206B)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金；生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

朱 穎(1987—)，女，山東聊城人，研究方向：酶工程；魏東芝(聯(lián)系人)，教授，dzhwei@ecust.edu.cn；蘇二正(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:ezhsu@njfu.edu.cn

TQ925

A

1672-3678(2017)02-0021-09