生長抑制因子5逆轉Warburg效應抑制腫瘤增殖的研究

劉新利++++張鴻飛+++張旭濤+++孟瑾+++張峰

[摘要] 目的 研究生長抑制因子5（ING5）對肺癌A549 細胞Warburg效應的影響。 方法 肺癌A549 ING5過表達細胞系通過慢病毒轉染GV218-EGFP-ING5（吉凱基因）構建，空質粒轉染為對照細胞系A549-control。Western blot驗證ING5的表達；增殖和克隆形成實驗觀察ING5對A549細胞增殖和克隆形成的影響；乳酸脫氫酶（LDH）活性和乳酸（LD）分泌檢測實驗觀察ING5對A549細胞Warburg效應的影響。 結果 Western blot結果表明，A549-ING5-OE的ING5表達顯著高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。增殖和克隆形成實驗結果表明，A549-ING5-OE的增殖和克隆形成能力較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。LDH活性和LD分泌檢測實驗結果表明，A549-ING5-OE的LDH活性和LD分泌較對照組明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 ING5通過逆轉肺癌A549細胞的Warburg效應抑制其增殖。

[關鍵詞] 肺癌細胞；生長抑制因子5；Warburg效應；增殖；克隆形成

[中圖分類號] R730.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0004-04

代謝重組是誘導腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[1-2]。腫瘤組織在有氧條件下主要依賴糖酵解獲能的代謝方式稱為“Warburg效應”[3]。Otto Warburg首次發(fā)現(xiàn)并認為這種代謝方式的轉變是促進癌變的主要誘因[4]。生長抑制因子（inhibitor of growth，INGs）是近年來發(fā)現(xiàn)的重要抑癌基因家族[5-7]，該家族包含ING1～5五個成員。INGs家族蛋白高度保守，由C端結構域、中央區(qū)和N端結構域三部分組成[8-9]。ING5是該家族新成員，研究發(fā)現(xiàn)ING5與P53相互作用能夠抑制細胞生長和誘導細胞凋亡[10]。此外，有研究報道ING5能夠抑制腫瘤增殖和上皮間質轉化（EMT）[11]，同時誘導細胞周期阻滯，促進細胞分化、自噬和凋亡[12]。

目前關于ING5的研究報道較少，其抑癌作用及機制尚無突破性進展。本文擬研究肺癌A549細胞ING5過表達對Warburg效應及增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞（上海中科院細胞庫），GV218載體（上海吉凱基因化學技術有限公司），G418（美國Gibco公司），高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液（美國HyClone公司），青鏈霉素混合液（北京Solarbio公司），BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、裂解液（西安碧云天科技生物有限公司），蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司），ING5抗體（美國Proteintech），ECL化學發(fā)光試劑盒（美國Advansta公司），兔二抗（英國Abcam公司），4%多聚甲醛溶液（西安科昊生物技術有限公司）。

1.2 肺癌A549-ING5-OE細胞株的構建

含ING5 cDNA的慢病毒載體和對照載體為吉凱公司構建。0.25%的胰酶消化293T細胞后計數(shù)并調整密度為6×105個/mL接種于培養(yǎng)皿，37℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)至密度約80%進行轉染。轉染前2 h換無血清DMEM，加入轉染復合物繼續(xù)培養(yǎng)8 h后棄掉上清液，PBS清洗后加入10% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液1000 r/min離心3 min，所得上清液為病毒顆粒濃縮液。取對數(shù)生長期肺癌A549細胞，用上述病毒顆粒濃縮液進行感染12 h后觀察細胞狀態(tài)，無明顯細胞毒副作用則繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換新培養(yǎng)液，感染3 d后觀察EGFP基因的表達。感染后的A549細胞計數(shù)并調整密度為300個/孔接種于6孔板內繼續(xù)培養(yǎng)。用5 μg/mL的G418篩選，每隔24 h更換新培養(yǎng)液，篩選3 d后用熒光顯微鏡觀察細胞克隆，挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)至所需細胞量。

1.3 Western blot檢測ING5的表達

取對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞，0.25%的胰酶消化，4℃預冷的PBS洗滌、離心后加入適量裂解液混勻冰上裂解30 min。細胞裂解液組成：0.1%SDS、150 mmol/L NaCl、0.5%脫氧膽酸、1%NP-40和50 mmol/L Tris（pH 8.0），裂解前加入蛋白酶抑制劑（1∶25），低溫離心機離心30 min后所得上清為細胞總蛋白，BCA試劑盒定量。采用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制10%分離膠和6%濃縮膠，上樣后開始電泳（濃縮膠100 V，30 min，分離膠130 V，1 h），轉膜（100 V，1.5 h），后取出NC膜，10%麗春紅染液染色30 s可見清晰的紅色條帶，裁剪目的條帶用PBST洗脫殘余染液，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后孵育一抗ING5（1∶1000）、Actin（1∶1000），4℃過夜。次日，回收一抗，PBST清洗目的條帶3次，7 min/次。山羊抗兔或鼠二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，PBST清洗目的條帶3次，7 min/次?；瘜W發(fā)光儀檢測目的蛋白的表達。

1.4 細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞，0.25%胰酶消化計數(shù)后，10% FBS的DMEM配成單細胞懸液，以每孔2×103個/200 μL接種于96孔板中培養(yǎng)，6個復孔。細胞貼壁開始計時24、48、72、96、120 h每孔加MTT溶液（5 mg/mL，PBS配制）20 μL繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加150 μL DMSO，震蕩儀振蕩10 min使結晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm測定OD值，以時間為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.5 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞，0.25%的胰酶消化計數(shù)后，10% FBS的DMEM配成單細胞懸液，以每孔300個/2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)，3個復孔。細胞貼壁生長5 d后每孔加500 μL FBS繼續(xù)培養(yǎng)并觀察克隆形成情況，待肉眼觀察菌落形成后（14 d左右），棄上清，PBS清洗3次，加1 mL 4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min。棄固定液，PBS清洗3次，加0.1%結晶紫染液室溫染色15 min。棄染液，PBS清洗3次，室溫風干后計數(shù)超過50個細胞的克隆。

1.6 乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測實驗

取對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞，0.25%的胰酶消化、4℃預冷的PBS洗滌、離心后加適量裂解液混勻冰上裂解30 min，低溫離心機離心30 min，所得上清液為細胞總蛋白，BCA試劑盒定量。根據(jù)OD值及線性回歸方程計算初始蛋白初濃度，裂解液調整蛋白終濃度為3 μg/μL。按照說明書進行實驗操作，酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm讀取OD值，每組3復孔，重復3次獨立實驗。

1.7 乳酸（LC）分泌檢測實驗

取對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞，0.25%的胰酶消化計數(shù)后，10% FBS的DMEM配成單細胞懸液，以每孔4×105個/mL接種于6孔板中培養(yǎng)，24 h后收集上清液。按照說明書進行實驗操作，酶聯(lián)免疫檢測儀530 nm讀取OD值，每組3個復孔，重復3次獨立實驗。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測ING5的表達

Western blot結果表明：與A549-control相比，A549-ING5-OE的ING5表達明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。

2.2 ING5抑制A549細胞的增殖

增殖實驗結果表明：與A549-control相比，A549-ING5-OE的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。

2.3 ING5抑制A549細胞的克隆形成

克隆形成實驗結果表明：與A549-control相比，A549-ING5-OE的克隆形成能力顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。

2.4 ING5抑制A549細胞的LDH活性

LDH活性檢測結果表明：A549-ING5-OE的LDH OD450值為（0.268±0.013），較A549-control的OD450值（0.333±0.015）明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。

2.5 ING5抑制A549細胞的LD分泌

LD分泌實驗結果表明：A549-ING5-OE的LD分泌OD530值為（0.257±0.016），較A549-control的OD530值（0.302±0.012）明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。

3 討論

腫瘤在有氧條件下以糖酵解獲能的代謝特征稱為Warburg效應[13]。Warburg認為代謝的異常導致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。此外，Warburg效應導致的局部酸性微環(huán)境與腫瘤的浸潤轉移有明顯的相關性[15-16]。Flaveny等[17]研究發(fā)現(xiàn)逆轉Warburg效應可阻斷癌癥發(fā)展。

近年來INGs蛋白家族在腫瘤中的作用及機制受到高度重視。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)，ING5與HAT酶Tip60相互作用后誘導凋亡基因Bax和GADD45轉錄激活促進細胞凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細胞癌[19]、胃癌[20]、乳腺癌[21]和結直腸癌[22]等多種腫瘤中，ING5 mRNA和蛋白水平均顯著降低。

本文擬研究ING5過表達對肺癌A549細胞Warburg效應及增殖能力的影響。結果表明，ING5過表達能夠顯著抑制細胞增殖和克隆形成，同時，首次發(fā)現(xiàn)其能夠抑制細胞LDH活性和LD分泌抑制糖酵解。提示ING5能夠逆轉Warburg效應并為肺癌代謝治療提供新的依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Hanahan D，Weinberg RA. Hallmarks of cancer：the next generation [J]. Cell，2011，144（5）：646-674.

[2] Han T，Kang D，Ji D，et al. How does cancer cell metabolism affect tumor migration and invasion？[J]. Cell Adh Migr，2013， 7（5）：395-403.

[3] Warburg O. On the origin of cancer cells [J]. Science，1956， 123（3191）：309-314.

[4] Neumann HP，de Herder W. Energy and metabolic alterations in predisposition to pheochromocytomas and paragangliomas：the so-called Warburg（and more） effect，15 years on [J]. Endocr Relat Cancer，2015，22（4）：E5-E7.

[5] Aguissa-Toure AH，Wong RP，Li G. The ING family tumor suppressors：from structure to function [J]. Cell Mol Life Sci，2011，68（1）：45-54.

[6] Piche B，Li G. Inhibitor of growth tumor suppressors in cancer progression [J]. Cell Mol Life Sci，2010，67（12）：1987-1999.

[7] Coles AH，Jones SN. The ING gene family in the regulation of cell growth and tumorigenesis [J]. J Cell Physiol，2009， 218（1）：45-57.

[8] He GH， Helbing CC，Wagner MJ，et al. Phylogenetic analysis of the ING family of PHD finger proteins [J]. Mol Biol Evol，2005，22（1）：104-116.

[9] Russell M，Berardi P，Gong W，et al. Grow-ING，Age-ING and Die-ING：ING proteins link cancer，senescence and apoptosis [J]. Exp Cell Res，2006，312（7）： 951-961.

[10] Hitosugi T，Chen J. Post-translational modifications and the Warburg effect [J]. Oncogene，2014，33（34）：4279-4285.

[11] Zhang F，Zhang X，Meng J，et al. ING5 inhibits cancer aggressiveness via preventing EMT and is a potential prognostic biomarker for lung cancer [J]. Oncotarget，2015， 6（18）：16239-16252.

[12] Gou WF，Shen DF，Yang XF，et al. ING5 suppresses proliferation，apoptosis，migration and invasion，and induces autophagy and differentiation of gastric cancer cells：a good marker for carcinogenesis and subsequent progression [J]. Oncotarget，2015，6（23）：19552-19579.

[13] Warburg O，Wind F，Negelein E. The metabolism of tumors in the body [J]. J Gen Physiol，1927，8（6）：519-530.

[14] Warburg O. On respiratory impairment in cancer cells [J]. Science，1956，124（3215）：269-270.

[15] Estrella V，Chen T，Lloyd M，et al. Acidity generated by the tumor microenvironment drives local invasion [J]. Cancer Res，2013，73（5）：1524-1535.

[16] Ibrahim HA，Cornnell HH，Coelho RML，et al. Reduction of metastasis using a non-volatile buffer [J]. Clin Exp Metastasis，2011，28（8）：841-849.

[17] Flaveny CA，Griffett K，El-Gendy B，et al. Broad Anti-tumor Activity of a Small Molecule that Selectively Targets the Warburg Effect and Lipogenesis [J]. Cancer Cell，2015，28（1）：42-56.

[18] Liu N，Wang J，Wang J，et al. ING5 is a Tip60 cofactor that acetylates p53 in response to DNA damage [J]. Cancer Res，2013，73（12）：3749-3760.

[19] Cengiz B，Gunduz E，Gunduz M，et al. Tumor-specific mutation and downregulation of ING5 detected in oral squamous cell carcinoma [J]. Int J Cancer，2010，127（9）：2088-2094.

[20] Xing YN，Yang X，Xu XY，et al. The altered expression of ING5 protein is involved in gastric carcinogenesis and subsequent progression [J]. Hum Pathol，2011，42（1）：25-35.

[21] Zhao QY，Ju F，Wang ZH，et al. ING5 inhibits epithelial-mesenchymal transition in breast cancer by suppressing PI3K/Akt pathway [J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（9）：15498-15505.

[22] Zheng HC，Xia P，Xu XY，et al. The nuclear to cytoplasmic shift of ING5 protein during colorectal carcinogenesis with their distinct links to pathologic behaviors of carcinomas [J]. Hum Pathol，2011，42（3）：424-433.

（收稿日期：2016-11-10 本文編輯：程 銘）