中華石蝴蝶組織培養(yǎng)及試管開花誘導(dǎo)

王一諾++李翠++肖冬++李林軒++韋瑩++王曉峰++韋坤華

摘要：以中華石蝴蝶（Petrocosmea sinensis Oliv.）的幼嫩葉片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，研究植物生長調(diào)節(jié)劑多因素組合對中華石蝴蝶繼代增殖和生根培養(yǎng)的影響，并誘導(dǎo)獲得的無菌苗在試管中開花。結(jié)果顯示，不同的生長調(diào)節(jié)劑配比對中華石蝴蝶繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的影響不同，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA利于芽繼代增殖，MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭適于誘導(dǎo)生根獲得再生植株，MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA利于試管苗開花，持續(xù)繼代可抑制中華石蝴蝶的試管開花。

關(guān)鍵詞：中華石蝴蝶；組織培養(yǎng)；繼代增殖；生根培養(yǎng)；試管開花

中圖分類號： S682.1+90.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0098-03

中華石蝴蝶（Petrocosmea sinensis Oliv.）為苦苣苔科石蝴蝶屬多年生草本植物，產(chǎn)于云南北部、四川和湖北西部，生于低山陰處的石上。目前，苦苣苔科（Gesneriaceae）植物在全世界約有140屬2 000余種，中國有58屬（其中28屬特產(chǎn)中國）463種，從遼寧到海南均有分布，多數(shù)屬、種分布于云南、廣西、廣東等省（區(qū)）熱帶及亞熱帶石灰?guī)r的陡崖上[1]。苦苣苔植物很多品種花色艷麗，極具觀賞價值。此外，芒毛苣苔屬、非洲紫苣苔屬、大巖桐屬，中國產(chǎn)的吊石苣苔、螞蟥七、牛耳朵等具有藥用價值[2]。由于許多苦苣苔科植物分布區(qū)域狹窄，對生長條件要求苛刻，加上民間的過度采挖，使許多苦苣苔科植物的野生資源瀕臨絕種[3]。

中華石蝴蝶不僅花色美麗，可作為觀賞花卉，同時也是一種中藥材，以全草入藥，具有清熱解表、健脾和胃等功效，可用于治療感冒、小兒疳積等癥狀[4]。本研究通過對中華石蝴蝶組織培養(yǎng)的技術(shù)研究，探索行之有效的中華石蝴蝶繁殖技術(shù)并通過仿生栽培，可以對其野生資源進(jìn)行有效保護(hù)。試管開花是利用組織培養(yǎng)技術(shù)使組培植物在離體環(huán)境下開花的一種現(xiàn)象，不受季節(jié)的限制，可以通過控制相應(yīng)的條件，讓組培植物進(jìn)入開花時期[5]。中華石蝴蝶的試管開花可為人們對鮮花日益增長的需求提供廣闊的市場。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對中華石蝴蝶進(jìn)行培養(yǎng)并對其試管開花作初步探究，研究其開花機(jī)制，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價值。本研究在中華石蝴蝶組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行無菌苗的試管開花誘導(dǎo)，可為研究其花期生理和調(diào)控提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

中華石蝴蝶采取廣西壯族自治區(qū)藥用植物園科研基地內(nèi)健壯無病害的植株，選取其幼嫩的葉片為外植體。

1.2外植體消毒

將采回的外植體在流水下緩慢沖洗，并用軟毛刷輕輕擦拭去除表面的污垢，放入燒杯中，用適量濃度洗潔精溶液浸泡15 min后，再用流水沖洗10 min。將材料移至超凈工作臺上，用75%乙醇表面消毒15 s后用無菌水沖洗2次，再用0.1%氯化汞溶液浸泡8 min，最后用無菌水浸泡沖洗5次，將氯化汞溶液徹底洗出。在無菌器皿中將外植體與消毒液接觸的傷口切除，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)出的叢生芽作為試驗(yàn)材料。

1.3繼代增殖

取無菌中華石蝴蝶叢生芽，接入添加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA、IAA的MS+30 g/L蔗糖+4.0 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為5.8，設(shè)置其培養(yǎng)條件為平均光照度1 500～2 200 lx，光照時間12 d/h，培養(yǎng)溫度（25±3） ℃，考察不同培養(yǎng)配方對中華石蝴蝶繼代的影響。

1.4生根培養(yǎng)

挑取繼代培養(yǎng)得到的增殖苗，單切叢生芽為單芽，接入添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA的MS+蔗糖 30 g/L+瓊脂4.0 g/L培養(yǎng)基中，另一部分接入添加1 mg/L活性炭的上述培養(yǎng)基中生根，設(shè)置其平均培養(yǎng)條件為光照度1 500～2 200 lx，光照時間12 d/h，培養(yǎng)溫度（25±3） ℃，考察不同培養(yǎng)基配方對中華石蝴蝶生根率的影響。

1.5植物生長調(diào)節(jié)劑對中華石蝴蝶誘導(dǎo)開花的影響

選取繼代增殖的無菌苗，接種到MS培養(yǎng)基以及添加6-BA、NAA的MS培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基中含有30 g/L蔗糖、4.0 g/L 瓊脂，培養(yǎng)條件為平均光照度1 500～2 200 lx，光照時間12 d/h，培養(yǎng)溫度（25±3） ℃，在培養(yǎng)期間觀察植物的生長情況并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.6繼代培養(yǎng)對中華石蝴蝶試管開花的影響

設(shè)計1組繼代試驗(yàn)，中華石蝴蝶試管苗每40 d轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1次，比較連續(xù)繼代、只繼代1次對中華石蝴蝶試管開花的影響。

2結(jié)果與分析

2.1繼代增殖

切取誘導(dǎo)出的芽，將其接種在不同外源激素配比的繼代增殖培養(yǎng)基中，每天觀察接入芽發(fā)生的微小變化，大概10 d后開始有新芽出現(xiàn)，一段時間后芽苗的數(shù)量慢慢增多，于60 d后統(tǒng)計芽的增殖系數(shù)。表1表明，MS+1.0 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基中華石蝴蝶的長勢最好，增殖倍數(shù)高，芽粗壯，葉色翠綠，部分出現(xiàn)幼根但比較弱。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，中華石蝴蝶的增殖率會受到6-BA含量的影響，在0～1.0 mg/L范圍內(nèi)，在低含量時芽的生長速度相對較慢；隨著6-BA含量的增大，芽的增殖倍數(shù)不斷增大，有效芽苗的數(shù)量也不斷增加；但當(dāng)6-BA含量大于 1.0 mg/L，達(dá)到1.5 mg/L時，芽苗相對長勢比較弱，部分出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，有效的芽苗數(shù)量減少，表明6-BA含量過高反而抑制了中華石蝴蝶的生長。較好的芽苗生長情況見圖1。

2.2生根培養(yǎng)

將繼代培養(yǎng)得到的增殖苗單切叢生芽為單芽接入不同植物生長調(diào)節(jié)劑含量的生根培養(yǎng)基中，一部分接入添加 1.0 mg/L 活性炭的上述培養(yǎng)基中。表2結(jié)果表明，中華石蝴蝶在上述培養(yǎng)基中均能生根，但在MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭培養(yǎng)基上生根效果最好，植株長勢較好，平均的生根數(shù)為18條/株，平均根長3.62 cm，生根率達(dá)到100%，生根苗相對粗壯，利于試管苗的移栽。其中IBA影響苗的生長，當(dāng)培養(yǎng)基中只添加IBA時生根數(shù)較少，根較細(xì)、弱，質(zhì)量不好。NAA、活性炭對生根有促進(jìn)作用，兩者同時配合使用時，生根效果最好（圖2），但NAA含量過高，對生根也會產(chǎn)生抑制作用。

2.3不同植物生長調(diào)節(jié)劑對中華石蝴蝶試管開花的影響

以MS培養(yǎng)基為空白對照，剪取長勢良好的中華石蝴蝶無菌試管苗，接種于研究試管開花的培養(yǎng)基中，比較在基本培養(yǎng)[CM（25]基中添加6-BA、NAA激素對中華石蝴蝶試管開花的影響。表3表明，中華石蝴蝶在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中能夠正常生長，但不能進(jìn)行試管內(nèi)開花，培養(yǎng)一段時間后，試管苗會出現(xiàn)黃化的現(xiàn)象；在MS培養(yǎng)基中分別添加激素6-BA、NAA，試管內(nèi)開花率明顯高于對照培養(yǎng)基MS，在只添加激素6-BA的基本培養(yǎng)基中，花序比較纖細(xì)、幼弱，而當(dāng)同時添加2種激素時，中華石蝴蝶試管開花率最高，花開得更大、更伸展，花色相對艷麗（圖3）。結(jié)果說明，6-BA、NAA激素配合使用，對中華石蝴蝶的試管開花有促進(jìn)作用。

2.4繼代培養(yǎng)對中華石蝴蝶試管開花的影響

設(shè)計1組試驗(yàn)，比較不同繼代培養(yǎng)次數(shù)對中華石蝴蝶試管開花的影響。分別剪取中華石蝴蝶持續(xù)繼代、只繼代1次的無菌試管苗，接種在利于試管開花的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)3個月，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，減少繼代培養(yǎng)的次數(shù)利于試管開花，繼代1次的中華石蝴蝶的開花率明顯高于持續(xù)繼代的，表明持續(xù)繼代會抑制中華石蝴蝶的試管開花。

3討論與結(jié)論

在組織培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基中不同生長調(diào)節(jié)劑的配比是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生芽、根的關(guān)鍵因素[6]。不同的植物在組織培養(yǎng)中所需要激素的種類和含量是不同的，同大多數(shù)苦苣苔科植物一樣，培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素、生長素的含量和配比對中華石蝴蝶組織培養(yǎng)中芽的增殖和生根起著決定性的作用。6-BA 是目前使用廣泛的細(xì)胞分裂素，其含量在合適的范圍內(nèi)才有利于植物的生長，過高會抑制植物生長而出現(xiàn)玻璃化，過低則不利于芽苗增殖。IAA是促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長的內(nèi)源性激素，在中華石蝴蝶的組織培養(yǎng)過程中，添加6-BA的同時配合NAA、IAA使用，并使其達(dá)到合適的比例，才能達(dá)到較為理想的效果。在本試驗(yàn)中，中華石蝴蝶的繼代增殖在MS+10 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基中較好，增殖倍數(shù)高，芽苗粗壯且顏色翠綠。在培養(yǎng)基中添加活性炭可有效防止褐變，提供生根的暗環(huán)境，降低培養(yǎng)基中的鹽離子濃度或吸附利于生根的物質(zhì)[7]。中華石蝴蝶在添加活性炭的MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭培養(yǎng)基中生根率達(dá)到100%。

中華石蝴蝶在MS培養(yǎng)基中可以生長但不能進(jìn)行試管開花，說明激素是中華石蝴蝶開花所需要的條件，在培養(yǎng)基中加入6-BA可以促進(jìn)開花，因?yàn)橹参镌陂_花分化時，細(xì)胞分裂素是必不可少的[8]。當(dāng)培養(yǎng)基中只添加單一的激素時，誘導(dǎo)試管開花率相對都比較低，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，6-BA配合使用一定量的生長激素NAA時能使試管開花率提高。這也進(jìn)一步說明細(xì)胞分裂素與生長素的組合使用可產(chǎn)生更利于中華石蝴蝶試管開花的交互作用效果。本試驗(yàn)成功誘導(dǎo)了中華石蝴蝶試管開花，但開花率仍需要進(jìn)一步提高，關(guān)于其開花的調(diào)控機(jī)制尚須深入研究。

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