長牡蠣可溶性黑色素的脫鹽研究

何 成, 于文超, 蔡忠強(qiáng), 魏 磊, 陳 軍, 李佳榮, 蓋超偉, 姜秋云,孫 杰, 王曉安, 郭 文, 王曉通

(1. 魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 山東 煙臺 264025; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長島增殖實(shí)驗(yàn)站, 山東 長島 265800; 3. 魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺 264025; 4. 山東省海洋生物研究院, 山東 青島 266104)

牡蠣(Ostrea gigas)作為世界上養(yǎng)殖量最大的貝類, 含豐富的蛋白和多糖類營養(yǎng)物質(zhì), 產(chǎn)量高, 已成為海洋貝類各方面研究的重要對象[1]。近幾年, 牡蠣全基因組測序完成[2], 使得牡蠣研究方向更為廣泛[3]。貝類色素作為天然生物色素的良好研究材料, 一直以來都是科研實(shí)驗(yàn)室的重要研究對象, 尤其是近年來許多色素的生物功效得到證實(shí)使得貝類色素研究更被認(rèn)可[4-6]。本課題組人員從牡蠣貝殼色素入手,選取的天然長牡蠣(Crassostrea gigas)黑色素為研究對象, 先后提取出了天然長牡蠣黑色素粗制品[7], 并利用超聲波破碎技術(shù)制得了可溶性的長牡蠣黑色素粉末及溶液[8]。但由于技術(shù)限制以及黑色素本身的理化特性, 需要在進(jìn)行超聲破處理過程中加入氫氧化鈉和鹽酸, 因而過程中會產(chǎn)生雜質(zhì)鹽 NaCl, 該過程又是溶解性處理中不可避免的一部分, 而NaCl是普通方法難以去除的。

為了獲得高純度的可溶性長牡蠣黑色素, 利用差離子濃度擴(kuò)散原理, 選用半通透的納濾膜為分離材料, 對所得的可溶性黑色素溶液進(jìn)行離子透析[9],再對處理后的黑色素進(jìn)行干燥即可得到所需產(chǎn)品。該研究是對黑色素制取方法的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探究。更純凈的長牡蠣黑色素具有更廣泛的應(yīng)用和研究價(jià)值, 該研究的產(chǎn)物可更方便地投入天然色素的功能研究中, 可減少由于雜質(zhì)引起的干擾, 使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)樣品

可溶性長牡蠣黑色素溶液: 每組樣品取2 g天然長牡蠣黑色素粗制品[7], 溶解于0.5 mol/L的100 mL氫氧化鈉溶液中。利用超聲波破碎法對其進(jìn)行處理,然后調(diào)節(jié)pH至7并離心取上清得到的黑色素溶液,進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)試劑主要有碳酸氫鈉、EDTA、溴化鉀等。實(shí)驗(yàn)儀器包括電子數(shù)顯式鹽度計(jì)、TU-1810紫外分光光度計(jì)、傅里葉紅外光譜儀、電熱套、乙酸纖維素納濾膜(相對分子量MW=500)及配套止水夾等。

1.3　納濾膜的預(yù)處理

將乙酸纖維素納濾膜裁剪為 10 cm長的小段,使之能夠投入1 000 mL燒杯而不存在折疊。

將裁剪后的透析膜置于1 000 mL的2%(W/V)碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min; 用去離子水徹底清洗透析膜, 后在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析膜煮沸10 min。

待冷卻后取出透析膜浸泡于1 000 mL的去離子水中, 存放于4℃環(huán)境待用。

1.4　離子置換透析

將可溶性長牡蠣黑色素溶液分裝注入處理好的納濾透析膜中(每份可裝兩只), 用止水夾嚴(yán)密封口并檢漏, 后置于1 000 mL燒杯中, 加入去離子水1 000 mL(如圖1), 并重復(fù)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組以減小實(shí)驗(yàn)誤差。

圖1　脫鹽處理裝置Fig. 1 Appliance used for melanin desalination

第一階段, 從透析第一天起, 每隔 24 h使用鹽度計(jì)測量一次燒杯中去離子水的鹽度并記錄數(shù)值,直至鹽度維持恒定為止。第二階段, 將透析袋取出,用去離子水沖洗干凈后在新燒杯中換入新的去離子水, 重復(fù)以上測量和記錄, 直至數(shù)值恒定為0。

將透析膜中的黑色素溶液轉(zhuǎn)移至小口徑的燒杯中, 后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱, 設(shè)置干燥條件為70℃、48h, 干燥結(jié)束后, 將固體結(jié)晶剝離, 并用電子天平稱質(zhì)量記錄, 并置于密閉離心管封存; 所得固體質(zhì)量與原料質(zhì)量的比值即為脫鹽處理的產(chǎn)率。

1.5　脫鹽后黑色素的鑒定

取少量處理后的黑色素用去離子水完全溶解,利用紫外分光光度計(jì)在190~500 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描, 結(jié)果用Excel作圖。

取微量處理后的黑色素固體與 KBr干粉混合,研磨均勻后壓片, 測定 500~4 000 cm–1的紅外光譜,結(jié)果用Excel作圖。

2　結(jié)果

2.1　鹽度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對脫鹽處理期間的鹽度測量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 整理如表1、表2。

表1　3組脫鹽處理組第一階段鹽度測量數(shù)值統(tǒng)計(jì)Tab. 1 The salinity change in the three desalination groups in the first stage

表2　3組脫鹽處理組第二階段鹽度測量數(shù)值統(tǒng)計(jì)Tab. 2 The salinity change in the three desalination groups in the second stage

由以上數(shù)據(jù)可知, 透析處理到第 5天左右即可趨于穩(wěn)定, 在處理第二階段既可達(dá)到鹽度析出濃度為 0的恒定狀態(tài)。為了更直觀地顯示脫鹽的效率趨勢, 將表 1中的數(shù)據(jù)用 Excel制作脫鹽效率趨勢圖,如圖2。

2.2　脫鹽后的黑色素固體

經(jīng)過納濾膜脫鹽處理后的黑色素干燥后, 得到純黑色有光澤的長牡蠣黑色素固體, 如圖 3, 從外觀特征來看, 脫鹽后, 黑色素純度比較高, 干燥稱質(zhì)量后, 黑色素結(jié)晶平均產(chǎn)量為0.2041g。

2.3　脫鹽后的黑色素鑒定結(jié)果

圖2　脫鹽效率趨勢Fig. 2 The trend of desalination efficiency

圖3　黑色素粗制品與脫鹽處理后的對比Fig. 3 The comparison between crude melanin and desalinated melanin

圖4　脫鹽處理后黑色素的紫外光譜Fig. 4 UV absorption spectra: The melanin of desalinated treatment

脫鹽后黑色素的紫外光譜如圖4, 圖中脫鹽后的黑色素在210 nm~220nm之間存在最大吸收峰, 且從最大吸收波長至500nm吸光值逐漸降低。該趨勢與脫鹽處理前黑色素紫外光譜趨勢一致。

在圖 5顯示的紅外光譜中, 在 1 630 cm–1和3 400 cm–1波段仍然存在兩處的吸收峰, 與脫鹽處理前的趨勢和峰值大致相同。

3　討論

3.1　脫鹽后黑色素的理化性質(zhì)分析

黑色素可分為真黑素和褐黑素, 從紫外和紅外的掃描結(jié)果來看, 脫鹽處理后的黑色素與之前未處理的黑色素趨勢一致[8], 可證明脫鹽后的黑色素仍然存在處理前真黑素的有效官能基團(tuán)[10-12], 脫鹽處理并未將黑色素脫除而是只脫去了溶解鹽。與長牡蠣黑色素粗制品相比, 透析脫鹽后的黑色素是深黑色、具有光澤的固體結(jié)晶, 區(qū)別于未脫鹽處理的摻有白色固體雜質(zhì)的產(chǎn)物。

圖5　脫鹽處理后黑色素的紅外光譜Fig. 5 IR spectra: The melanin of desalinated treatment

3.2　脫鹽量分析

長牡蠣黑色素粗品是不可溶的, 為了得到可溶性的黑色素, 作者酸堿粗提配合超聲破碎法制取了可溶性長牡蠣黑色素, 但該過程中引入了 NaOH和HCl, 根據(jù)方程式 NaOH+HCl=NaCl+H2O, 相當(dāng)于引入了 NaCl, 所以需要進(jìn)行脫鹽處理, 才能保證黑色素的純度。

已知用鹽酸滴定超聲后的溶液pH調(diào)整為7時(shí),原溶液里的氫氧化鈉是完全反應(yīng)的, 配置渾濁液時(shí)原體系加入了2 g氫氧化鈉即0.05 moL, 按照化學(xué)方程式質(zhì)量守恒定律可得反應(yīng)所得氯化鈉鹽2.925 g。進(jìn)而可以計(jì)算得出黑色素脫鹽率, 由表1、表2可知,第一階段脫鹽至平衡鹽度為 2.9×10–3、2.8×10–3、2.9×10–3kg/L即各組分含鹽量分別為2.9、2.8、2.9 g計(jì)算與理論所得鈉鹽 2.925 g可得平均脫鹽率為(2.9+2.8+2.9)÷2.925=98.0%; 而第二階段鹽度數(shù)據(jù)均為0,即表明第二階段幾乎未脫出鹽份, 也就表明, 原黑色素溶液中鈉鹽已達(dá)到最大脫除量。從圖2來看, 該方法脫鹽速率并不平均, 而是隨時(shí)間增長逐漸遞減,且理論上速率無限接近零, 脫鹽量無限接近2.925 g。該曲線趨勢大致符合反正切函數(shù)方程[13-14], 可總結(jié)脫鹽率方程式為:

3.3　脫鹽效率分析

由表1、表2中的數(shù)據(jù)可知, 脫鹽透析期間的脫鹽速率并不是恒定不變的, 而是先快后慢, 在處理到一定時(shí)間后達(dá)到某臨界值而鈉鹽幾乎不再脫出。從表1數(shù)據(jù)可知, 處理到第5天, 鹽度計(jì)所能測得的數(shù)值已不再變化?？梢酝茰y, 在此之后, 并不是鈉鹽不再脫出, 而是數(shù)值過小, 效率過低, 使得鹽度計(jì)無法捕獲到數(shù)值。因此, 在脫鹽處理實(shí)驗(yàn)過程中, 在實(shí)驗(yàn)的前5天速率較高, 之后的速率可以忽略不計(jì)。因而從總的處理效率來說, 脫鹽速率平均每天 19.6%,也就相當(dāng)于平均每天脫出NaCl鹽0.57 g左右。

4　結(jié)論

本研究成功完成了黑色素溶液的脫鹽處理, 并獲得了純度更高、質(zhì)量更優(yōu)的黑色素結(jié)晶, 該脫鹽方法的研究是天然長牡蠣黑色素提取工藝的進(jìn)一步拓展, 在貝類黑色素的生理功能研究和高值化利用方面具備潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn):

[1] Deepalakshmi K, Mirunalini S.Pleurotus ostreatus: an oyster mushroom with nutritional and medicinal properties[J]. Journal of Biochemical Technology, 2014, 5(2):718-726.

[2] Zhang G, Fang X, Guo X, et al. The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation[J]. Nature, 2012, 490(7418): 49-54.

[3] Hao S, Hou X, Wei L, et al. Correction: extraction and identification of the pigment in the adductor muscle scar of Pacific oyster Crassostrea gigas[J]. Plos One,2016, 11(2): e0148704.

[4] Rao A V, Rao L G. Carotenoids and human health (Review)[J]. Pharmacological Research, 2007, 55(3): 207-216.

[5] Maiani G, Castón M J, Catasta G, et al. Carotenoids:actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans[J].Molecular Nutrition & Food Research, 2009, 53(S2):194-218.

[6] 霍培, 季靜, 王罡, 等.植物類胡蘿卜素生物合成及功能[J]. 中國生物工程雜志, 2011, 31(11): 107-113.Huo Pei, Ji Jing, Wang Gang, et al. Biosynthesis and function of carotenoid in plante[J]. China Biotechnology, 2011, 31(11): 107-113.

[7] 于文超, 何成, 武長路, 等. 長牡蠣(Crassostrea gigas)貝殼與外套膜中黑色素的提取和鑒定[J]. 海洋與湖沼, 2015, 46(4): 909-914.Yu Wenchao, He Cheng, Wu Changlu, et al. Extraction and identification of melanin in shell and mantle of pacific oyster Crassostrea gigas[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(4): 909-914.

[8] 何成, 于文超, 蔡忠強(qiáng), 等. 酸堿粗提配合超聲破碎法制取可溶性長牡蠣(Crassostrea gigas)黑色素的研究[J]. 海洋與湖沼, 2017, 48(3): 634-639.He Cheng, Yu Wenchao, Cai Zhongqiang, et al. The preparation of soluble Pacific oyster melanin using the ph-shift processing and ultrasonic-assisted procedure[J].Oceanologia et Limnologia Sinica, 2017, 48(3): 634-639.

[9] 張賽男, 李林福, 陳毅勇.超濾、納濾膜技術(shù)分離濃縮玫瑰茄花青素研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(23):143-147.Zhang Sainan, Li Linfu, Chen Yiyong. Research of separation and concentration of roselle anthocyanins by ultrafiltration-nanofiltration membrane[J]. Science and Technology of Food Industry, 2015, 36(23): 143-147.

[10] 李文, 鄧衛(wèi)東, 毛華明, 等. 烏骨綿羊黑色素的研究進(jìn)展[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 28(3): 1-5.Li Wen, Deng Weidong, Mao Huaming, et al. Advance on melanin in the black bone sheep[J]. Acta Ecologiae Animalis Domastici, 2007, 28(3): 1-5.

[11] 李華, 邱祥聘, 龍繼蓉, 等.烏骨雞黑色素的研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2002, 34(8): 33-35.Li Hua, Qiu Xiangpin, Long Jirong, et al. Research advances on melatonin in silkies[J]. Animal Husbandry& Veterinary Medicine, 2002, 34(8): 33-35.

[12] 郭欣, 陳士國, 薛長湖, 等.超聲降解法制備可溶性魷魚墨黑色素及其抗氧化性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2013, 37(7):1113-1120.Guo Xin, Chen Shiguo, Xue Changhu, et al. Ultrasound-assisted degradation for preparing soluble melanin from squid ink and its anti-oxidant activity[J].Journal of Fisheries of China, 2013, 37(7): 1113-1120.

[13] Rajan S, Wang S, Inkol R, et al.Efficient approximations for the arctangent function[M]. New York: John Wiley & Sons, Inc, 2007: 265-276.

[14] 藺濤. 反正切函數(shù)回歸模型方法及其應(yīng)用[C]//中國現(xiàn)場統(tǒng)計(jì)研究會第十二屆學(xué)術(shù)年會論文集. 煙臺:中國現(xiàn)場統(tǒng)計(jì)研究會學(xué)術(shù)年會, 2005.Lin Tao. Inverse tangent function regression model method and its application[C]// Proceedings of the 12th annual academic annual conference of China statistical research institute. Yantai: Academic Annual Conference Held By Chinese Association Of Applied Statistics, 2005.