基于CO1基因的漁山列島厚殼貽貝遺傳資源評估

袁文斌, 李長保, 焦海峰, 林志華, 包永波

(1. 浙江萬里學院, 浙江 寧波 315100; 2. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院, 浙江 寧波 315012)

厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)屬于雙殼綱(Bivalvia),翼形亞綱(Pteriomorphia), 貽貝目(Mytioida)。也稱淡菜, 海紅, 中國古書上還稱之為“東海夫人”[1], 主要分布于黃、渤海和東海沿岸[2], 野生厚殼貽貝多分布在外側(cè)海島低潮線下至 20 m之間的海底礁巖上[3],厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)是漁山列島重點保護的貝類資源之一, 也是當?shù)刂攸c采捕的種類之一, 由于其世代更替速度較慢, 大規(guī)模、高強度的采捕勢必造成貽貝資源的減少。本文運用CO1基因分析對漁山列島代表性潮間帶生物厚殼貽貝進行遺傳學研究,對五個地理群體(漁山、山東、大連、舟山、南麂)進行遺傳多樣性和單倍性分析等, 構(gòu)建反映群間體關(guān)系的系統(tǒng)進化樹, 觀察不同群體的遺傳多樣性,探討野生群體遺傳多樣性之間的差異, 從分子水平了解漁山列島厚殼貽貝遺傳背景。通過本課題的研究, 為漁山列島其他海洋生物的恢復和保護提供了借鑒。

1　材料與方法

1.1　實驗材料來源

貽貝: 5個地點的野生厚殼貽貝: 漁山列島、大連獐子島、南麂列島、山東南隍城鄉(xiāng)、舟山嵊泗。以上厚殼貽貝采集后活體運送至實驗室, 取閉殼肌放于無水乙醇中, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　實驗步驟

1.2.1基因組DNA的提取

用酚-氯仿法抽提各樣品DNA。檢測DNA完整性后, 放入–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增

采用常規(guī)PCR, 反應體系為25 μL, 其中12.5 μL taq master mix, 9 μL 雙蒸水, 1.5 μL 模板, 上下引物各1 μL。PCR程序為: 94℃預變性10 min; 循環(huán)過程為: 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 90 s, 35 個循環(huán); 72℃延伸10 min, 引物序列為: CO1-F(5′-GGTCAACAAA TCATAAAGATATTGG-3′), CO1-R(5′-TAAACTTCA GGGTGACCAAAAAATCA-3′)。

1.2.3PCR產(chǎn)物鑒定

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖中電泳檢測, 700 bp處出現(xiàn)單一亮條帶則證明擴增成功。

表1　5個厚殼貽貝群體樣品信息Tab. 1 Messages for sample collection

1.2.4擴增產(chǎn)物純化及序列測定

本部分工作由上海桑尼公司完成。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

使用Bioedit, Cexpress等軟件進行序列比對, 并輔以人工校對, 并抹平單堿基差異。使用 DnaSP軟件分析堿基組成、單倍型狀況和遺傳多樣性指數(shù), 使用MEGA7.0軟件分析遺傳距離, 使用MEGA7.0軟件的 NJ方法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹, 計算系統(tǒng)分支遺傳差異程度。使用DnaSP轉(zhuǎn)換格式后使用Network軟件輔以人工繪制單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖, 繪出堿基差異數(shù)圖。

2　結(jié)果與分析

測序結(jié)果通過 Cexpress與 MEGA軟件處理后,獲得用于分析的序列, 漁山列島群體 30條, 大連獐子島群體26條, 南麂列島群體39條, 山東南隍城鄉(xiāng)群體16條, 舟山嵊泗群體45條, 共156條序列, 統(tǒng)一截取576 bp的CO1序列。

在 mtDNACO1基因同源片段上共檢測到了 39個多態(tài)位點, 其中 39個簡約信息位點, 無單突變位點, 構(gòu)成40個單倍型, 其中16個共享單倍型, 24個特有單倍型(表 2), Network繪制的堿基不配對分析圖中可以看到每個單倍型間的核苷酸差異數(shù)(圖1), 5個群體總的單倍型多樣性為 0.888±0.014, 核苷酸多樣性為 0.00558±0.00049, 兩兩對比的堿基差異度為3.216±1.669。基因片段中的A+T含量(60.5%)明顯大于C+G的含量(39.5%)。

基于mtDNACO1基因同源性片段獲得的遺傳多樣性結(jié)果顯示, 40個單倍型中, 有4個單倍型為5個群體的共享單倍型, 特有單倍型居多, 單倍型共享率為 40.0%。就核苷酸多樣性指數(shù)和兩兩對比的堿基差異度而言, 漁山群體(π=0.00890±0.00193, k=5.126±2.556)> 山 東 群 體 (π=0.00535±0.00062, k=3.083±1.691)>大連群體(π=0.00503±0.00051, k=2.895±1.571)>舟山群體(π=0.00442±0.00038, k=2.547±1.395)>南麂群體(π=0.00427±0.00028, k=2.459±1.359); 但是單倍型多樣性卻是山東群體(h=0.942±0.048)>漁山群體(h=0.929±0.023)>南麂群體(h=0.883±0.031)>大連群體(h=0.868±0.042)>舟山群體(h=0.855±0.033)。

表2　厚殼貽貝5個群體的單倍型頻率分布Tab. 2 Distribution of haplotypes in five Mytiluscoruscus populations

圖1　 厚殼貽貝單倍型間堿基不配對分析圖Fig. 1 Mismatch distributions analyses of the nucleotide of CO1 gene for Mytiluscoruscus haplotypes

基于mtDNACO1基因片段的群體間遺傳距離構(gòu)建了5個群體之間的NJ系統(tǒng)樹(圖2), 看到漁山列島群體與其他 4個群體的遺傳差異較大, 山東群體與大連群體間的關(guān)系較近, 漁山群體與南麂群體, 舟山群體的關(guān)系較近。表 4中可以看出群體內(nèi)遺傳距離為: 漁山(0.0089)>山東(0.0054)>大連(0.0050)>舟山(0.0044)>南麂(0.0043)(表 4)結(jié)果顯示漁山與其他四個群體間的遺傳距離較大。

基于 mtDNACO1基因同源性片段用 MEGA7.0軟件構(gòu)建了單倍型NJ系統(tǒng)樹, 系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示, 5個群體內(nèi)存在三個顯著分化的單倍型類群 A、B、C, 其中A類群含15個單倍型, B類群含23個單倍型, C類群含2個單倍型(均為漁山列島的樣品), 其中漁山列島在上述三個類群中都有分布。使用Network軟件繪制的單倍型中介連接網(wǎng)絡關(guān)系圖與 MEGA7.0構(gòu)建的NJ樹結(jié)果一致(圖3-4)。類群間的遺傳距離為0.0099~0.0268(A/B=0.0099, A/C=0.0268, B/C=0.0208)(圖 3)。

表3　厚殼貽貝5個群體的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 3 Molecular diversity indices of five Mytiluscoruscus populations

表4　基于CO1基因片段序列的5個厚殼貽貝群體間遺傳距離(對角線下)、群體內(nèi)遺傳距離(粗體顯示)和群體間平均凈遺傳距離(對角線上)Tab. 4 Genetic distances between populations (below diagonal), genetic distances within populations (in bold values), and genetic net distance between populations (above the diagonal) of the five Mytiluscoruscus populations based on CO1 gene

圖2　基于5個群體間遺傳距離的NJ系統(tǒng)樹Fig. 2 Neighbor-joining tree of five Mytiluscoruscus populations based on genetic distance

基于厚殼貽貝 CO1基因的分歧速率為(0.7%~2.4%/MY)[4]。計算所有單倍型類群的分化時間: A/B的凈遺傳距離為0.0052, A/C的凈遺傳距離為0.0149,B/C的凈遺傳距離為0.0088; 類群A/B的分化事件發(fā)生于21~74萬年前, 類群A/C的分化事件發(fā)生于62~212萬年前, 類群 B/C的分化事件發(fā)生于 36.67~125.7萬年前。上述分化事件的發(fā)生主要集中在更新世晚中期。

3　討論

圖3　基于CO1基因的各個單倍型NJ系統(tǒng)樹Fig. 3 Neighbor-joining tree of haplotypes for Mytiluscoruscus from CO1 gene

線粒體DNA是一種共價閉合的, 環(huán)狀的雙鏈分子由于具有高拷貝數(shù), 高置換率和母系遺傳等特點,在近十年間已經(jīng)成為研究動物遺傳多樣性的重要工具[5-9]。最近有關(guān)人類線粒體 DNA的研究文獻也屢見不鮮[10]。目前對貽貝的研究方向主要在人工養(yǎng)殖或者遺傳學分析[11]上, 也有少許分析形態(tài)[12], 研究藥理病理[13-14]的方向。研究表明, 海洋貝類的遺傳多樣性水平的高低受多種因素的影響, 比如洋流, 溫度等等。此外, 海洋貝類的自身生活史特征也會印象其遺傳多樣性。因此, 加大對海洋貝類種群遺傳多樣性的監(jiān)測及遺傳多樣性分布格局的分析, 對于海洋貝類遺傳多樣性的保護和合理的資源利用有意義。

在多態(tài)位點的研究中, 漁山群體擁有較多的多態(tài)位點, 有較為豐富的遺傳變異。單倍型多樣性(h),核苷酸多樣性(π), 兩兩比較的堿基差異度(k)是衡量種群遺傳多樣性水平的重要參數(shù)[15]。本研究中, 漁山群體的核苷酸多樣性與兩兩比較的堿基差異度值要顯著大于大連、山東、舟山和南麂群體。而單倍型多樣性卻是山東群體更高, 可能因為山東群體的個體數(shù)較少導致。大連獐子島與山東南隍城鄉(xiāng)地同處渤海黃海交界處附近, 地理位置相隔不遠, 南麂列島、漁山列島、舟山嵊泗同處浙江沿海, 漁山列島距大陸最遠, 群體 NJ系統(tǒng)樹的結(jié)果也發(fā)現(xiàn): 漁山列島群體與其他四個群體之間的遺傳距離較遠, 相對來說漁山列島群體與舟山群體以及南麂群體的遺傳距離較近; 山東群體與大連群體之間遺傳距離較近。推測群體間遺傳距離的遠近可能與各群體間的相對地理位置的遠近有關(guān)。綜上所述, 雖然漁山列島不僅與大陸的距離較遠, 而且與其他群體之間的遺傳距離也較遠, 但是卻具有較為豐富的遺傳多樣性水平,可能與漁山列島厚殼資源豐富, 群體數(shù)量較大, 種子資源狀況較好有關(guān)。

Zuckerkandl和 Pauling[16]提出分子鐘假說認為對于任意給定的大分子(蛋白質(zhì)或DNA分子)在其所有的進化譜系中核苷酸替代速率是近似恒定的。對于 5個群體的各個單倍型做系統(tǒng)發(fā)育分析后顯示,厚殼貽貝被分為 3個較為明顯的類群 A、B、C。4個類群間的凈遺傳距離為 0.0052~0.0149。采用0.7%~2.4%的分歧速率計算獲得 4個類群的分化時間在大概一百萬年之前。而那時候的海平面下降的非常劇烈, 海平面下降了120~140 m[17], 邊緣海的面積和結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化, 從而導致了許多海洋生物的分布范圍經(jīng)歷了收縮和擴張, 并在遺傳信息上留下明顯的印跡[18]。厚殼貽貝是群體附著生長的雙殼類, 而且生長于近海, 受此次海洋的大變動的影響應該很大。從而導致了A、B群體和C群體的分化。C群體的兩個單倍型是漁山群體的樣本, 而其他漁山的單倍型在A、B兩個類群里都有滲透, 推測可能是漁山列島群體在一百萬年前隔離后又與其他群體重新擴張混合。

圖4　厚殼貽貝單倍型中介連接網(wǎng)絡關(guān)系圖Fig. 4 The median joining network of Mytiluscoruscus haplotypes

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