根霉透析膜培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用

張素琴，司會(huì)

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008）

在舊時(shí)制曲中，根霉的培養(yǎng)多采用固體傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，根霉接種在含水量不超過(guò)60%的固體基質(zhì)上進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，固體基質(zhì)既是根霉生長(zhǎng)代謝的碳源，又是微生物生長(zhǎng)的微環(huán)境[1]。這種方法雖然工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備可因陋就簡(jiǎn)，在我國(guó)已沿襲千年之久，但生產(chǎn)效率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。20世紀(jì)70年代，上海工業(yè)微生物研究所和上海藕粉廠聯(lián)合推出液體培養(yǎng)根霉，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化、連續(xù)化生產(chǎn)，但液體深層發(fā)酵工藝要求高，操作尤其嚴(yán)格，設(shè)備投資一次性較大，難以掌握推廣[2]。20世紀(jì)80年代，蘇州市第二米廠采用液、固結(jié)合法培養(yǎng)根霉，節(jié)省了菌種，擴(kuò)大了生產(chǎn)規(guī)模。為提高生產(chǎn)效率，克服根霉在固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)中的不足，借鑒無(wú)土栽培蔬菜的原理，經(jīng)過(guò)不斷探索和試驗(yàn)，提出了根霉透析膜培養(yǎng)技術(shù)，該方法兼具固、液體培養(yǎng)各自的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又避免它們的某些缺陷，實(shí)際上是固態(tài)培養(yǎng)、液態(tài)培養(yǎng)的折中法[3]。所謂透析培養(yǎng)是通過(guò)透析膜調(diào)節(jié)物質(zhì)轉(zhuǎn)移而進(jìn)行的微生物培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)單菌種時(shí)，則在兩相的一方培養(yǎng)微生物，另一方則作為培養(yǎng)基貯槽，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散和生物量的累積是在兩相之間的透析膜上進(jìn)行的，其優(yōu)點(diǎn)是可以增加生物量的積累，達(dá)到很高的細(xì)胞密度，同時(shí)可節(jié)省培養(yǎng)基原料，提高菌體收率。微生物的透析膜培養(yǎng)技術(shù)在國(guó)外已有數(shù)十年歷史，在我國(guó)還鮮有報(bào)道，尚未有專題研究，現(xiàn)將根霉透析膜培養(yǎng)技術(shù)試驗(yàn)成果和應(yīng)用價(jià)值報(bào)道如下。

1 根霉培養(yǎng)特性的研究

根霉在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行無(wú)性繁殖過(guò)程，孢子發(fā)芽長(zhǎng)出芽管，接著伸出絮狀菌絲，在營(yíng)養(yǎng)豐富的麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，菌絲沿斜面表面蔓延伸展，匍匐菌絲粗壯發(fā)達(dá)，形成較厚的膜層，菌落初為白色透明，老熟后仍呈白色。在菌絲布滿斜面后，在沿試管壁靠近培養(yǎng)基處，會(huì)有少許菌絲沿管壁攀爬伸展，因此可以推斷在試管壁上能夠沿伸生長(zhǎng)的菌絲體，是依靠扎根在培養(yǎng)基內(nèi)的基內(nèi)菌絲輸送營(yíng)養(yǎng)。

根霉在液體培養(yǎng)基內(nèi)是由兩個(gè)生理上不同而且有一定親和力的菌絲結(jié)合在一起，形成初生配子囊，吸收養(yǎng)分，逐漸成熟形成結(jié)合體新細(xì)胞，再進(jìn)行繁殖，即為有性繁殖。此外，初生菌絲體延長(zhǎng)，被攪拌斷裂后又延伸生長(zhǎng)，液體培養(yǎng)收率高，生物量高于固體培養(yǎng)，但工藝要求高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在三角搖瓶液體振蕩培養(yǎng)中，因振蕩被甩到瓶壁上的菌液仍能沿瓶壁生長(zhǎng)，形成菌膜。

通過(guò)以上兩個(gè)試?yán)梢粤私飧咕z體在固體表面上生長(zhǎng)迅速，有較強(qiáng)的攀爬延伸能力，形成菌絲體膜層，這就為透析膜培養(yǎng)打下基礎(chǔ)，應(yīng)用透析膜培養(yǎng)技術(shù)可以將固、液體培養(yǎng)整合在一起，放在一個(gè)環(huán)境中進(jìn)行。

2 根霉透析膜培養(yǎng)原理

利用透析膜將兩相隔開(kāi)，方法是在液體培養(yǎng)基上放置一塊透析膜，微生物點(diǎn)種在透析膜上，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散滲透至透析膜，而微生物通過(guò)透析膜吸取營(yíng)養(yǎng)，在膜固體表面上生長(zhǎng)延伸，累積生物量，即營(yíng)養(yǎng)依靠液體輸運(yùn)，而菌的培養(yǎng)生長(zhǎng)則在膜固體表面上進(jìn)行，將液、固培養(yǎng)有機(jī)結(jié)合。

3 根霉透析膜培養(yǎng)方法

3.1 材料

根霉M101（上海工業(yè)微生物研究所）、麥芽汁（自制，大麥發(fā)芽，搗碎，糖化，去渣，過(guò)濾沉清，調(diào)整濃度為14°Bé）、再生纖維素透析膜、500 mL克氏瓶。

3.2 方法

另裁剪一塊比克氏瓶底面積稍大的纖維素膜作為透析膜，取500 mL克氏瓶，裝液量約60 mL作為培養(yǎng)基貯槽，高壓滅菌后備用，滅菌后將其平鋪在滅菌的克氏瓶培養(yǎng)液表面，然后將根霉菌點(diǎn)接種在透析膜上，共接5個(gè)點(diǎn)（平均分布），塞上棉塞，此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以擴(kuò)散方式滲透通過(guò)透析膜供微生物生長(zhǎng)需要。

3.3 培養(yǎng)

置32 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)36 h，菌絲布滿整個(gè)透析膜，培養(yǎng)結(jié)束。

3.4 菌絲收率的檢測(cè)

取一塊濾紙稱重，記錄原始重量（a），收集刮下附在透析膜上的菌絲體，放在濾紙上，稱重，記錄此時(shí)重量值（b），然后置在80 ℃的干燥箱中烘干至恒重，記錄此時(shí)的重量值（c）菌體濕重=重量b-重量a，菌體干重=重量c-重量a。

4 結(jié)果

培養(yǎng)8 h后可見(jiàn)在原接種點(diǎn)上有微小菌絲長(zhǎng)出，之后逐漸長(zhǎng)大，菌絲呈放射狀沿膜表面伸展蔓延，菌落呈白色，至28 h后，原5個(gè)接種點(diǎn)長(zhǎng)成的菌落彼此被聯(lián)在一起，形成較厚的膜層，此時(shí)根霉生長(zhǎng)處恒定期，生物量達(dá)最大，可以收獲。菌絲經(jīng)洗刮，稱重，干燥處理，可得50 mL培養(yǎng)液菌體濕重10 g，干重2 g。

5 應(yīng)用

5.1 直接用于釀酒

將菌絲體搗碎，以0.1%的接種量，拌入蒸熟的米飯中，32 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，36 h后釀物成熟，釀成的甜酒釀口感鮮甜，露汁清亮，糖度均可達(dá)34°～36°。

5.2 作為種子使用，用于制曲

菌絲體搗碎兌水拌入滅菌的米粉中，按制曲工藝流程，制成的塊曲、散曲產(chǎn)品質(zhì)量都可達(dá)到和超過(guò)傳統(tǒng)工藝方法制成的曲。

5.3 制成純根霉制品

菌絲體加入填充料直接干燥脫水制成純根霉菌體，塑料袋包裝，在常溫下貯藏半年，經(jīng)檢驗(yàn)根霉菌活力仍能保持原樣，并未有減退。

6 討論

6.1 透析膜的作用與選擇

透析膜除可作為隔開(kāi)相鄰兩相，以及調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移輸送之外，也是根霉菌絲體賴依在固體基質(zhì)上生長(zhǎng)沿伸的支撐基料，是一種固體基質(zhì)，膜的選擇應(yīng)考慮不被微生物分解和能耐蒸汽滅菌，因此膜應(yīng)有一定的強(qiáng)度并且廉價(jià)易得。

6.2 麥芽培養(yǎng)基濃度的影響與作用

依據(jù)根霉的培養(yǎng)特性，有些根霉在老熟后會(huì)產(chǎn)生濃密的黑孢子，這對(duì)釀酒會(huì)產(chǎn)生負(fù)面的觀感，因此應(yīng)盡量選用產(chǎn)黑孢子少的菌種[4]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)提高麥芽汁培養(yǎng)基的濃度，可以防止根霉黑孢子的產(chǎn)生，這點(diǎn)可以在生產(chǎn)中推廣、應(yīng)用。

6.3 透析膜培養(yǎng)技術(shù)的作用與應(yīng)用前景

提高原料收率是制曲追求的目標(biāo)，即單位重量的原料應(yīng)能盡可能產(chǎn)生收獲更多的菌絲體生物量，比較各種制曲培養(yǎng)方法認(rèn)為運(yùn)用透析膜培養(yǎng)技術(shù)可以增加提高菌體的密度，最終可提高特定產(chǎn)物的再生產(chǎn)率。目前膜技術(shù)培養(yǎng)已首先在動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)干擾素，單克隆抗體等方面獲得了應(yīng)用，根霉的透析膜培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)縝密的試驗(yàn)后，如能在實(shí)踐中加以推廣應(yīng)用，這將徹底打破我國(guó)酒藥生產(chǎn)，藥拌草藥，以及定時(shí)定節(jié)，固體傳統(tǒng)培養(yǎng)作坊式生產(chǎn)的模式。