水蘇堿、膽堿及二者配伍對離體子宮收縮活動的調(diào)節(jié)作用

鄭俊清 王玉清

益母草系唇形科植物益母草(leonurus japonicus houtt)的地上干燥部分，具有良好的收縮子宮、活血止血的作用，為我國歷代醫(yī)家用來治療婦科病的要藥[1-2]。目前，大量研究證實(shí)水溶性生物堿成分是益母草藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，然而，關(guān)于其有效成分的系統(tǒng)研究較少，主要物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明了，作用機(jī)制亦不清楚[3-4]。本研究前期采用化學(xué)分離、純化方法從益母草開發(fā)而來的益母草注射液中得到水蘇堿和膽堿兩種成分，為了進(jìn)一步明確二者對子宮活動的調(diào)節(jié)作用，本研究擬觀察二者單獨(dú)或配伍應(yīng)用對大鼠離體子宮收縮的影響，為提升益母草藥物的制備工藝、臨床用藥提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：健康SD雌性大鼠購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蒙)2012-0002)]，體重(200±20)g。

2.藥物與試劑：水蘇堿、膽堿均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李剛教授提供，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，純度≥99.5%?？s宮素注射液(生產(chǎn)單位：成都市海通藥業(yè)有限公司，批號:1406032，規(guī)格：0.5毫升/2.5單位)，己烯雌酚注射液(生產(chǎn)單位：上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號:141126，規(guī)格：1 ml/2 mg)。

3.儀器：BL-420E生物機(jī)能系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，HU-1型張力(肌力)換能器(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司)，HW-400E型恒溫水浴平滑肌槽(成都泰盟軟件有限公司)。

二、方法

1.試藥與試劑配制：水蘇堿、膽堿溶液采用0.9%生理鹽水配成1 mg/ml；縮宮素溶液使用前用蒸餾水配成1 U/ml；己烯雌酚溶液用蒸餾水配成0.8 mg/ml混懸液；洛氏液的配置，即稱取NaCl 9.2 g、KC1 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，混勻，加入1 000 ml蒸餾水，攪拌至完全溶解。

2.大鼠離體子宮的制備[5]：取健康成年雌性未孕SD大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d以確認(rèn)健康后，隨機(jī)分為正常大鼠離體子宮模型組(n=15)和采用縮宮素制造痙攣離體子宮模型組(n=15)。

于第4天腹腔注射己烯雌酚注射液，每日劑量為1 mg/kg，連續(xù)2 d，以造成動情期，并于第6天頸椎脫臼處死動物，迅速剖取子宮，輕輕剝離其上附著的結(jié)締和脂肪組織。取離體子宮中間段2～3 cm，將一端以絲線固定于張力(肌力)換能器，另一端連接盛有溫度為(37±0.5)℃的洛氏液20 ml的浴槽，向浴槽中通入(95% O2+5% CO2)的混合氣體，控制流速為2～3個(gè)氣泡/秒。調(diào)節(jié)螺母加1 g的負(fù)荷，并將換能器連接于生理記錄儀，觀察子宮活動情況，待子宮收縮逐漸平穩(wěn)，自發(fā)節(jié)律恢復(fù)后，開始進(jìn)行正常離體子宮收縮活動影響實(shí)驗(yàn)。

3.給藥方法：子宮收縮逐漸平穩(wěn)后，記錄一段正常收縮曲線，然后分別加入水蘇堿溶液(n=5)、膽堿溶液(n=5)或兩者配伍溶液(n=5)，采用累加給藥方式，其中水蘇堿溶液和膽堿溶液的給藥體積依次為40 μl、40 μl、80 μl，配伍溶液的給藥體積依次為40 μl(水蘇堿溶液20 μl+膽堿溶液20 μl)、40 μl(水蘇堿溶液20 μl+膽堿溶液20 μl)、80 μl(水蘇堿溶液40 μl+膽堿溶液40 μl)。上述各組藥物分別試驗(yàn)5只大鼠，空白對照于各組加入藥物刺激前采用與受試藥物相同的累加給藥方式加入相同體積的洛氏液刺激。每次加藥后記錄10 min離體子宮平滑肌的收縮活動。一組藥物記錄完后換去營養(yǎng)液，用洛氏液沖洗3次，待曲線穩(wěn)定20 min 后，待子宮收縮穩(wěn)定后，繼續(xù)進(jìn)行下一組受試藥物的實(shí)驗(yàn)。若進(jìn)行痙攣離體子宮收縮活動影響實(shí)驗(yàn)，則在子宮穩(wěn)定后，先加入1 U/ml縮宮素160 μl，使子宮痙攣，記錄10 min后，分別加入水蘇堿溶液、膽堿溶液及二者配伍的高劑量的藥液，觀察痙攣離體子宮收縮活動的變化。比較給藥前后離體子宮收縮活力、頻率和抑制率的變化。子宮抑制率=(給藥前活力-給藥后活力)/給藥前活力×100%。

結(jié) 果

一、水蘇堿、膽堿對大鼠正常離體子宮平滑肌收縮的影響

與給藥前相比，給藥后水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激以及二者配伍刺激的各劑量均對大鼠正常離體子宮收縮活力無明顯影響，給藥前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抑制率隨著劑量的增大有降低的趨勢。見表1。

表1水蘇堿、膽堿對大鼠正常離體子宮平滑肌收縮活動力、抑制率的影響

試劑(μl)活動力(克/秒)給藥前給藥后抑制率(%)空白對照 —135142±43136134446±46432052水蘇堿 40127437±38129130254±38823-142 80127437±38129131439±37143-231 160127437±38129132671±33836-347膽堿 40128351±40631127262±41827093 80128351±40631129439±37143-078 160128351±40631132871±33836-128水蘇堿/膽堿(1∶1) 40117586±36147120206±36849-126 80117586±36147121651±34906-214 160117586±36147124750±38891-306

與給藥前相比，給藥后水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激和二者配伍刺激的各劑量均對大鼠正常離體子宮平滑肌收縮張力、張力最小值和頻率無明顯影響，給藥前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

二、水蘇堿、膽堿對大鼠痙攣離體子宮平滑肌收縮的影響

與造模前相比，造模后大鼠的痙攣離體子宮收縮活力明顯提高，當(dāng)水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激和二者配伍刺激后痙攣離體子宮平滑肌收縮活力均顯著低于造模后，抑制率變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

與造模前相比，造模后大鼠痙攣離體子宮平滑肌的收縮張力和頻率明顯提高，當(dāng)水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激和二者配伍刺激后痙攣離體子宮平滑肌的收縮張力和頻率顯著低于造模后，而收縮張力最小值顯著高于造模后，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表2 水蘇堿、膽堿對大鼠正常離體子宮平滑肌收縮張力、張力最小值和頻率的影響

表3 水蘇堿、膽堿對大鼠痙攣離體子宮平滑肌收縮活動力、抑制率的影響

注：與造模前相比，#P<0.05；與造模后相比，*P<0.05

表4 水蘇堿、膽堿對大鼠痙攣離體子宮平滑肌收縮張力、張力最小值和頻率的影響

注：#與造模前相比，P<0.05；*與造模后相比，P<0.05

討 論

益母草作為“婦科圣藥”，是唇形科益母草屬的一種一年生或二年生草本植物，別名益母艾、茺蔚，味辛、微苦，入心包、肝經(jīng)[6-7]。益母草注射液是采用現(xiàn)代提取分離純化工藝將傳統(tǒng)中草藥“益母草”中的有效成分精制而成的純中藥單方制劑，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫的功效。在現(xiàn)代臨床運(yùn)用中，益母草注射液常用于治療女性生殖內(nèi)分泌疾病，月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)，小便不利以及產(chǎn)后出血等[8-9]。益母草注射液的藥理作用是多種活性成分協(xié)同作用的合力結(jié)果，隨著對其化學(xué)成分研究的日益深入，已發(fā)現(xiàn)許多具有藥用價(jià)值的藥物活性化合物，其中生物堿作為其主要有效成分，謝曉芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)其水溶性生物堿部位是子宮收縮作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。水蘇堿是益母草注射液中含量較高的水溶性生物堿之一，約占其中85%，現(xiàn)代藥理證實(shí)其具有多種藥理作用，如促進(jìn)子宮收縮、抗炎和抗內(nèi)毒素、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、保護(hù)腎臟和利尿等[11-12]。此外，在益母草注射液中還包括益母草堿、膽堿和葫蘆巴堿等生物堿，趙小梅等[13]通過體外實(shí)驗(yàn)測定凝血四項(xiàng)值、血小板聚集率和纖溶活性證實(shí)膽堿和葫蘆巴堿為益母草注射液抗凝的有效成分；李燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)益母草注射液中水蘇堿、胡蘆巴堿、膽堿和總氨基酸存在興奮子宮的活性。

雖然益母草注射液在臨床中得到廣泛應(yīng)用，但是關(guān)于其生物堿對子宮調(diào)節(jié)作用的系統(tǒng)藥理研究較少，并且不同的研究報(bào)道水蘇堿對子宮活動的調(diào)節(jié)效果不一致。因此，為了進(jìn)一步明確益母草注射液中的生物堿對子宮活動的調(diào)節(jié)作用，本研究在前期益母草注射液化學(xué)成分系統(tǒng)分離的研究基礎(chǔ)上，采用成分配伍層面方法開展了水蘇堿、膽堿及二者配伍對正常大鼠離體子宮活動的研究，較之既往單一成分的研究更系統(tǒng)、全面，對產(chǎn)品的二次開發(fā)有重要指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激以及二者配伍刺激的各劑量均對大鼠正常離體子宮收縮活力無明顯影響，抑制率隨著劑量的增大有降低的趨勢，同時(shí)對大鼠正常離體子宮平滑肌收縮張力、張力最小值和頻率的均無明顯影響。本研究結(jié)果提示水蘇堿、膽堿以及二者配伍刺激對大鼠離體子宮在正常狀態(tài)下無明顯作用。而當(dāng)采用縮宮素制造痙攣離體子宮模型后，水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激和二者配伍刺激均能顯著降低痙攣離體子宮平滑肌收縮活力、收縮張力和頻率，抑制率變化明顯，而收縮張力最小值則顯著提高。表明水蘇堿、膽堿以及二者配伍對痙攣離體子宮有舒張作用，這可能與降低子宮收縮張力、頻率和活動力以及提高收縮張力最小值有關(guān)。然而在痙攣狀態(tài)下，水蘇堿、膽堿單獨(dú)刺激與二者配伍刺激的療效相當(dāng)，提示二者配伍對子宮的作用不存在協(xié)同作用。

綜上所述，水蘇堿、膽堿對正常大鼠離體子宮無明顯作用，而對縮宮素引起的痙攣離體子宮強(qiáng)直性收縮卻有舒張作用，表明二者對子宮活動的影響與子宮所處的機(jī)能狀態(tài)不同有關(guān)。雖然水蘇堿與膽堿配伍不存在明顯的協(xié)同作用，但是二者均是益母草注射液中調(diào)節(jié)子宮活動的有效物質(zhì)，提示今后可通過增加二者含量以提高藥物的藥理作用強(qiáng)度。

1 Shang X,Pan H,Wang X,et al.Leonurus japonicus Houtt:ethnopharmacology,phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine.J Ethnopharmacol,2014,152:14-32.

2 Xiong L,Peng C,Zhou QM,et al.Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from different parts of Leonurus japonicus Houtt.Molecules,2013,18:963-973.

3 張雪,宋玉琴,楊雨婷,等.益母草活血化瘀化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展.藥物評價(jià)研究,2015,38:214-217.

4 聶媛媛.對益母草成分及藥理活性的研究.求醫(yī)問藥(學(xué)術(shù)版),2012,10:57-58.

5 李燕,謝曉芳,余泉毅,等.篩選益母草注射液縮宮成分.中成藥,2015,37:1416-1422.

6 馮群,趙紅,孫蓉.益母草臨床應(yīng)用和不良反應(yīng)研究進(jìn)展.中國藥物警戒,2014,11:74-76.

7 程軒軒,桑雪雨,楊全等.不同炮制方法及提取溶劑對益母草有效成分含量的影響.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33:1850-1852.

8 杜舞英.益母草注射液聯(lián)合縮宮素預(yù)防剖宮產(chǎn)產(chǎn)后出血的臨床療效及安全性分析.中國計(jì)劃生育學(xué)雜志,2015,23:321-323.

9 姚葉珊,文斌,曾麗玲,等.益母草注射液聯(lián)合縮宮素預(yù)防產(chǎn)后出血的效果.廣東醫(yī)學(xué),2012,33:2501-2503.

10 謝曉芳,熊亮,李丹,等.益母草注射液有效部位對大鼠離體子宮活動的影響.中成藥,2015,37:1103-1106.

11 Zhang C,Shan XL,Liao YL,et al.Effects of stachydrine on norepinephrine-induced neonatal rat cardiac myocytes hypertrophy and intracellular calcium transients.BMC Complement Altern Med,2014,14:1-9.

12 石金金,張美玲,于揚(yáng),等.益母草成分鹽酸水蘇堿對小鼠的急性毒性研究.時(shí)珍國醫(yī)國藥,2015,4:865-866.

13 趙小梅,謝曉芳,熊亮.益母草注射液主要提取成分對凝血系統(tǒng)影響的篩選.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20:128-130.

14 李燕,謝曉芳,余泉毅,等.基于大鼠離體子宮活動的益母草注射液縮宮活性部位篩選.時(shí)珍國醫(yī)國藥,2015,2:288-291.