六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株交配型的分離鑒定

劉 彬，刁文濤，周伏忠*，陳曉飛，寧 萌，郭 恒

（河南省科學(xué)院 生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008）

羊肚菌（Morchella）是一種珍稀食藥用菌，富含氨基酸、多糖、礦質(zhì)元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗腫瘤、抗菌、保護(hù)心血管、增強(qiáng)免疫力等功效[1]。近年來，我國(guó)羊肚菌人工栽培技術(shù)取得重要進(jìn)展，在“外營(yíng)養(yǎng)袋”栽培模式引領(lǐng)下，我國(guó)易出菇羊肚菌品種，如梯棱羊肚菌（Morchella importuna）、六妹羊肚菌（Morchella sextelata）和七妹羊肚菌（Morchella eximia）的商業(yè)化栽培迅猛發(fā)展，栽培面積已超過8 000 hm2且仍在不斷增加，然而在羊肚菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，每年有50%～70%的種植者無法穩(wěn)定盈利、重返貧困或負(fù)債[2-4]。其原因是，羊肚菌菌種不穩(wěn)定、易老化退化（如異核體中交配型丟失、線粒體氧化功能衰退等）以及管理不當(dāng)帶來商業(yè)化栽培時(shí)產(chǎn)量不穩(wěn)定（0～500 kg鮮菇/畝）是制約我國(guó)羊肚菌栽培成敗的關(guān)鍵因素[5-7]。

羊肚菌是一種單極性異宗結(jié)合子囊菌，其菌絲細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)量在15～42個(gè)不等，其子囊孢子內(nèi)含有18～32個(gè)細(xì)胞核，子囊孢子剛萌發(fā)芽管菌絲細(xì)胞也含有4～22個(gè)細(xì)胞核，無性孢子（暨分生孢子）大多單核，然而，在目前實(shí)驗(yàn)室條件下，無法誘導(dǎo)無性孢子穩(wěn)定產(chǎn)生和有效萌發(fā)[8-10]，這些情況不利于羊肚菌遺傳育種工作的深入開展。植物原生質(zhì)體技術(shù)在食藥用菌遺傳育種中的應(yīng)用顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如實(shí)驗(yàn)室易于操作、試驗(yàn)周期短、不受子實(shí)體栽培季節(jié)限制、可以進(jìn)行單交配型菌株或單核體的快速分離、誘變、雜交及細(xì)胞融合等。利用原生質(zhì)體技術(shù)分離交配型及單核體的分析研究，在擔(dān)子菌類食藥用菌中研究較多，如應(yīng)用原生質(zhì)體單核化技術(shù)分別分離到香菇（Lentinus edodes）[11-13]、大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）[14]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[15-16]、金針菇（Flammulina velutipes）[17]、猴頭菇（Hericium erinaceus）[18]等不同食藥用菌的單交配型菌株，并開展了不同交配型單核體的生理生化差異性、遺傳誘變和雜交育種等分析研究；而子囊菌類食藥用菌中利用原生質(zhì)體技術(shù)進(jìn)行交配型及同核體分離的研究報(bào)道較少，劉偉等[19]利用原生質(zhì)體單細(xì)胞技術(shù)可分離到梯棱羊肚菌（M.importuna）的單交配型同核體，目前還未見采用原生質(zhì)體技術(shù)對(duì)六妹羊肚菌交配型（mating type，MAT）進(jìn)行分離的研究報(bào)道。

本研究對(duì)六妹羊肚菌（M.sextelata）原生質(zhì)體進(jìn)行制備及再生，且對(duì)分離后的原生質(zhì)體再生菌株的交配型進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其交配型穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以期實(shí)現(xiàn)羊肚菌交配型的有效分離，對(duì)六妹羊肚菌的遺傳育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與引物

栽培種分離的六妹羊肚菌（Morchella sextelata）：河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、保存。交配型基因的上游引物（P6-1F、P8-4F）及下游引物（P6-1R、P8-4R）參照文獻(xiàn)[20]的序列，由華大基因公司提供合成服務(wù)。其中引物對(duì)P6-1F/P6-1R用于檢測(cè)交配型MAT1-2-1基因，引物對(duì)P8-4F/P8-4R用于擴(kuò)增交配型MAT1-1-1基因。

1.1.2 試劑

瓊脂糖、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、酵母提取物（粉）（均為生化試劑）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；溶壁酶（18 000 U/g）：廣東省微生物所；纖維素酶（7 000 U/g）、蝸牛酶（破壁率90%）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、GenSTAR Stain RED核酸染料：北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；2×ESTaqMaster Mix試劑盒：北京天根生化科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：上海萊楓生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

完全酵母提取物培養(yǎng)基（complete yeast extract medium，CYM）（CYM再生培養(yǎng)基）：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.046%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂1.5%（液體培養(yǎng)基不添加）、0.6 mol/L甘露醇（再生培養(yǎng)基中添加）、蒸餾水配制，pH值自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g，切片、煮沸10 min，3～4層紗布過濾取濾液，加入葡萄糖2%、瓊脂1.5%，蒸餾水配制，pH值自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)：上海滬凈凈化設(shè)備有限公司；TCYQ型全溫?fù)u瓶柜：太倉(cāng)市豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；DDY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；Chemi DocTMXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司；MIKRO 22R離心機(jī)：德國(guó)Hettich公司；MULTIFUGE X1R離心機(jī)：美國(guó)Thermo scientific 公司；Tpersonal聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：法國(guó)Biometra公司；UV8C18/2HJ型紫外誘變箱：北京賽百奧科技有限公司；BMXSP-10CA顯微鏡：上海彼愛姆公司；ZEISS Axio Imager M2型全電動(dòng)正置熒光顯微鏡：德國(guó)ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 原生質(zhì)體的制備

（1）CYM液態(tài)培養(yǎng)法

將六妹羊肚菌等菌株接種于置有玻璃紙（直徑8.5～9.0 cm）的CYM平板上，24 ℃倒置培養(yǎng)72 h，長(zhǎng)刀片刮下轉(zhuǎn)接于CYM液體培養(yǎng)基中，24 ℃靜置培養(yǎng)3～4 d，過濾收集幼嫩菌絲體，用無菌水、甘露醇洗滌4次；加入混合酶液中（2%溶壁酶+1%纖維素酶+1%蝸牛酶，0.22 μm濾膜過濾滅菌），于30 ℃、60 r/min條件下酶解2.5～3.5 h，酶解后的原生質(zhì)體粗酶液通過G2燒結(jié)玻璃漏斗過濾分離原生質(zhì)體和菌絲片段，原生質(zhì)體濾液用0.6 mol/L甘露醇進(jìn)行離心（4 000 r/min、10 min）、洗滌和濃縮（重復(fù)2～3次，離心前在離心管中預(yù)先加入60%蔗糖墊在離心管底部），得到純凈的原生質(zhì)體濃縮液，采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酶解液和濃縮液中的原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（2）玻璃紙CYM平板培養(yǎng)法

挑取六妹羊肚菌等菌株2塊，接種于置有玻璃紙（直徑8.5～9.0 cm）的CYM平板上，24 ℃倒置培養(yǎng)72 h，長(zhǎng)刀片刮下幼嫩菌絲，采用上述方法制備原生質(zhì)體濃縮液。

1.3.2 原生質(zhì)體的再生

原生質(zhì)體濃縮液用0.6 mol/L甘露醇適當(dāng)稀釋后取100～200 μL涂布于CYM再生培養(yǎng)基平板進(jìn)行再生培養(yǎng)，或?qū)ν坎加贑YM再生培養(yǎng)基平板上的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外線（ultraviolet，UV）誘變后再進(jìn)行再生培養(yǎng)（紫外誘變條件：18 W紫外燈、距離32 cm、照射30 s，紅光燈下操作）；再生培養(yǎng)條件：CYM再生培養(yǎng)基平板正立靜置30 min后封口膜封口、24 ℃倒置培養(yǎng)65～120 h，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，觀察原生質(zhì)體的再生情況并計(jì)算回收率及再生率，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 原生質(zhì)體再生菌株的分離及其交配型的鑒定

（1）原生質(zhì)體再生菌株的分離

小心挑取CYM再生培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的單菌落至PDA培養(yǎng)基斜面上，編號(hào)后置于24 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d，或?qū)?jīng)紫外誘變（原生質(zhì)體稀釋溶液于18 W紫外燈下距離32 cm處照射30 s）原生質(zhì)體再生單菌落進(jìn)行編號(hào)，并將單菌落接種于PDA培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)后，于4～12 ℃冰箱保藏。

（2）原生質(zhì)體再生菌株的交配型鑒定

取斜面保藏菌株的少量菌絲于2 mL離心管內(nèi)，加入300 μL細(xì)胞壁裂解液[1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2%乙酸鋰]、少量玻璃珠，研磨2～3 min，75 ℃水浴20min，取上清100μL，加入無水乙醇300μL，12000r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入400μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，12000r/min離心5min，棄去上清液，DNA沉淀風(fēng)干20min；風(fēng)干后的DNA用50 μL雙蒸水（ddH2O）溶解、振蕩懸浮，作為DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系（15 μL）：2×ESTaqMaster Mix 7.5 μL，P8-4F/P8-4R引物對(duì)或P6-1F/P6-1R引物對(duì)（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳：1.0%瓊脂糖凝膠加熱溶解，然后加入1 μL核酸染料，倒入電泳膠槽，凝固后進(jìn)行點(diǎn)樣和電泳檢測(cè)，其條件為：130 V、160 A，20～25 min。

1.3.4 再生菌株的交配型穩(wěn)定性驗(yàn)證

在完成原生質(zhì)體再生菌株的分離和交配型鑒定的基礎(chǔ)上，選取代表性的單交配型再生菌株（UV-31、UV-42和3PK-65）和雙交配型再生菌株（6M2P-24），按照1.3.1的方法再次進(jìn)行菌絲體培養(yǎng)、原生質(zhì)體制備、濃縮，經(jīng)理化誘變后對(duì)其“第二代”原生質(zhì)體再生菌株進(jìn)行分離及其交配型鑒定；期間開展紫外線輻照誘變和亞硝基胍化學(xué)誘變，其中原生質(zhì)體的紫外線誘變處理：紫外燈功率18 W、照射距離32 cm、照射時(shí)間30 s；原生質(zhì)體的亞硝基胍誘變方法：液體培養(yǎng)48 h的菌絲體中加入0.25 mg/mL亞硝基胍，誘變處理30 min（室溫、間歇搖動(dòng)），誘變后用無菌水洗滌4次；G2漏斗過濾收集菌絲體，0.6 mol/L甘露醇洗滌2次，擠去液體，菌絲體塊轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，加入混合酶液進(jìn)行原生質(zhì)體制備、濃縮、再生等操作。

1.3.5 細(xì)胞核的熒光染色

制備的六妹羊肚菌原生質(zhì)體及其再生菌絲體用質(zhì)量濃度4 μg/mL的DAPI染料進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫下避光染色10～15 min，立刻進(jìn)行顯微觀察（激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420～470 nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 六妹羊肚菌原生質(zhì)體的制備和再生

六妹羊肚菌原生質(zhì)體濃度達(dá)（0.6～4.5）×105個(gè)/mL（CYM液體法）或（2.2～4.5）×106個(gè)/mL（玻璃紙CYM平板法），原生質(zhì)體直徑在2～6 μm之間；其中CYM液體法制備的原生質(zhì)體回收率（60%～80%）和再生率（0.15%～9.00%）明顯高于玻璃紙CYM平板法（5%～20%和0.05%～0.16%）；可見六妹羊肚菌原生質(zhì)體的酶解和再生參數(shù)與前人報(bào)道粗柄羊肚菌、尖頂羊肚菌等子囊菌、香菇、平菇、金針菇等擔(dān)子菌的酶解條件基本一致，但產(chǎn)量偏低[21-25]；同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，六妹羊肚菌液體培養(yǎng)法制備的原生質(zhì)體在回收率、再生率等方面更有利于后續(xù)的遺傳育種研究工作。

2.2 六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株的分離及其交配型的鑒定

本實(shí)驗(yàn)共分離獲得200余株六妹羊肚菌的原生質(zhì)體再生單菌落，從中獲得有效生長(zhǎng)菌株182株，對(duì)菌株的交配型進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果見表1。

表1 六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株的交配型PCR鑒定結(jié)果Table 1 PCR identification results of mating types of regenerated strains from protoplast of Morchella sextelata

由表1可知，182株菌株中MAT1-1-1單交配型菌株共63株，占比34.62%；MAT1-2-1單交配型菌株共45株，占比24.73%；同時(shí)含有MAT1-2-1和MAT1-2-1兩種交配型的雙交配型菌株共66株，占比36.26%；同時(shí)還有8株未能擴(kuò)增出交配型基因的“雙陰性”菌落，占比4.40%，可能是菌株老化引起的細(xì)胞核自溶（觀察到“雙陰性”菌落大部分為產(chǎn)深褐色色素的菌株），具體原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

傳統(tǒng)的羊肚菌單交配型同核體的獲取多采用子囊果組織分離或毛細(xì)管顯微操作的方法，如劉偉等[27]采用組織分離法從多個(gè)羊肚菌子囊果中分離到單一交配型基因的同核體菌株，并發(fā)現(xiàn)其子囊果組織中存在交配型缺失現(xiàn)象（交配型缺失比例達(dá)43.96%）。劉萍等[28]采取毛細(xì)管單孢分離法從多種羊肚菌子囊果中分離到子囊孢子單交配型及雙交配型單孢菌株，并通過單孢菌株對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羊肚菌中存在性親和但營(yíng)養(yǎng)體不親和的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，通過原生質(zhì)體單核化的方法能有效實(shí)現(xiàn)羊肚菌交配型的分離。代表性的六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌落的交配型PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果見圖1。

圖1 六妹羊肚菌再生菌株交配型的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR testing results of mating type of regenerated strains of Morchella sextelata

由圖1可知，泳道1和2、3和4、7和8、21和22代表的4個(gè)菌株（UV-84、UV-85、UV-87和UV-5）只有P8-4F/P8-4R引物對(duì)擴(kuò)增出條帶，為MAT1-1-1單交配型菌株，泳道5和6、11和12、13和14、23和24代表的4個(gè)菌株（UV-86、UV-89、UV-90和UV-7）只有P6-1F/P6-1R引物對(duì)擴(kuò)增出條帶，為MAT1-2-1單交配型菌株，而泳道9和10、15和16、17和18、19和20代表的4個(gè)菌株（UV-88、UV-91、UV-92和UV-4）P6-1F/P6-1R、P8-4F/P8-4R兩組引物對(duì)都擴(kuò)增出條帶，為交配型MAT1-1-1/MAT1-2-1的雙極性菌株（異核體）。

2.3 原生質(zhì)體再生菌株的交配型穩(wěn)定性驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)試了六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌落的交配型的穩(wěn)定性，六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株的“第二代”再生菌落的交配型的PCR檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 六妹羊肚菌原生質(zhì)體的“第二代”再生菌株交配型的PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR testing results of mating types of "second generation"regenerated strains from protoplast of Morchella sextelata

由表2可知，六妹羊肚菌的“同核體”再生菌絲體，再次經(jīng)過原生質(zhì)體化過程、紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）等處理（誘變結(jié)果數(shù)據(jù)未列出），其交配型沒有改變或丟失，與親本菌株的交配型一致（其中六妹羊肚菌UV31系列19株，UV42系列10株的交配型均穩(wěn)定表現(xiàn)為MAT1-1-1，六妹羊肚菌3PK65系列22株的交配型穩(wěn)定表現(xiàn)為MAT1-2-1）；同時(shí)由表2可知，六妹羊肚菌原生質(zhì)體雙極性再生菌株（6M2P245G系列，異核體）的“第二代”原生質(zhì)體再生菌落中再次發(fā)生了兩種交配型分離的現(xiàn)象。

2.4 六妹羊肚菌原生質(zhì)體細(xì)胞核的染色觀察

六妹羊肚菌原生質(zhì)體中細(xì)胞核的顯微觀察見圖2。

圖2 六妹羊肚菌原生質(zhì)體中細(xì)胞核的顯微鏡觀察結(jié)果Fig.2 Microscopic observation results of nuclei in protoplasts of Morchella sextelata

由圖2A可知，六妹羊肚菌原生質(zhì)體形成過程中，每個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞包裹的細(xì)胞核數(shù)量比菌絲細(xì)胞大幅減少，只有1個(gè)細(xì)胞核充盈整個(gè)原生質(zhì)體，或少量的含有0～3個(gè)細(xì)胞核；由圖2B可知，六妹羊肚菌的幼嫩菌絲或尖端菌絲細(xì)胞中細(xì)胞核是多核的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)六妹羊肚菌的原生質(zhì)體細(xì)胞核染色觀察佐證了原生質(zhì)體方法分離羊肚菌單核菌絲體或單交配型菌株的可行性。

3 結(jié)論

本研究對(duì)六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株的交配型分離及穩(wěn)定性情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析研究，共獲得182株有效生長(zhǎng)菌株，妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株中MAT1-1-1交配型菌株達(dá)34.62%，MAT1-2-1交配型菌株24.73%，單交配型菌株比例近60%（59.35%）；而且單交配型菌株經(jīng)過理化誘變處理（紫外線、亞硝基胍等）的處理，交配型與親本一致，具有很強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)也證實(shí)六妹羊肚菌原生質(zhì)體中只含有0～3個(gè)細(xì)胞核，這種單核或少核狀態(tài)的原生質(zhì)體十分有利于后續(xù)的羊肚菌單一背景遺傳材料如交配型的獲取、遺傳誘變以及親和性分析等研究。