甲狀腺乳頭狀癌中DOG-1和C-erbB-2的表達(dá)及臨床意義

賀亞敏，高麗麗，李 惠，錢曉萍

甲狀腺癌占發(fā)展中國家所有惡性腫瘤的1%，是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤[1]。近年來我國甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年增高趨勢。甲狀腺癌中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最為多見[2]。絕大多數(shù)PTC惡性程度低，生長緩慢，病死率低，預(yù)后較好，但也有部分逐漸出現(xiàn)失分化現(xiàn)象，出現(xiàn)生長迅速、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時病灶也表現(xiàn)出不攝碘而對放射性碘治療療效差的情況?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不少基因變異與分化型甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的甲狀腺癌相關(guān)基因達(dá)數(shù)十種[3]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)針對甲狀腺癌完全特異性的基因標(biāo)志物。因此，有待更多的研究篩選出高特異性的相關(guān)基因，以及多個基因的聯(lián)合檢測，為甲狀腺癌的診斷、靶向治療以及預(yù)后風(fēng)險分層提供依據(jù)。C-erbB-2是一種原癌基因，在美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南中已明確其擴(kuò)增與乳腺癌和胃癌的預(yù)后和靶向治療顯著相關(guān)，但在甲狀腺癌中研究較少。DOG-1(又名ANO1, TMEM16A)，是胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors, GIST)相對特異性的診斷標(biāo)志物之一，近來還被發(fā)現(xiàn)其是一種鈣激活的氯離子通道[4-6]，除具有重要的生理功能，在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等惡性上皮性腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。DOG-1在甲狀腺癌中的表達(dá)目前尚未有報道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法對48例PTC和30例甲狀腺良性病例中DOG-1和C-erbB-2表達(dá)進(jìn)行檢測，以初步探討DOG-1及C-erbB-2在PTC中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2013年1月～2016年6月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院手術(shù)切除且病理確診的48例PTC(其中經(jīng)典型42例，濾泡亞型6例)和30例甲狀腺良性病變(結(jié)節(jié)性甲狀腺腫15例、橋本甲狀腺炎15例)。

1.2試劑與方法鼠抗人C-erbB-2、DOG-1即用型單克隆抗體、二抗SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚切片，免疫組化SP法檢測步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，采用微波抗原修復(fù)，用已知的乳腺癌及GIST陽性切片分別作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3結(jié)果判定C-erbB-2或DOG-1染色陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒。具體標(biāo)準(zhǔn)為：整個切片未見陽性著色為陰性(-)；陽性細(xì)胞數(shù)<10%為弱陽性(+)；10%～50%為陽性()；>50%為強(qiáng)陽性()。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用χ2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)性檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DOG-1和C-erbB-2在甲狀腺良、惡性病變中的表達(dá)DOG-1在良性病變組織中無表達(dá)(0/30，0)，而在PTC中的表達(dá)增高(27.08%，13/48)(圖1)。C-erbB-2在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中不表達(dá)(0/15)，在橋本甲狀腺炎中有1例弱陽性(1/15)，在PTC中表達(dá)增高(39.58%，19/48)(圖2)，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DOG-1及C-erbB-2在PTC中的表達(dá)主要定位于胞質(zhì)，部分混合胞膜(表1)。

表1 DOG-1和C-erbB-2在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性病變組織中的表達(dá)

2.2DOG-1和C-erbB-2表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系在48例甲狀腺乳頭狀癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中DOG-1和C-erbB-2陽性例數(shù)分別為12例(8例強(qiáng)陽性，2例陽性，2例弱陽性)和17例(9例強(qiáng)陽性，5例陽性，3例弱陽性)，占44.44%和62.96%(P<0.05)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中DOG-1和C-erbB-2陽性例數(shù)分別為1例和2例，均為弱陽性或陽性，占4.76%和9.52%，兩組相比差異均有顯著性(P<0.05，表2)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，DOG-1或C-erbB-2高表達(dá)與腫瘤分期、腺外侵犯亦相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小以及病灶是否多發(fā)無關(guān)(P>0.05)。

2.3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且有多灶的甲狀腺乳頭癌中DOG-1和C-erbB-2表達(dá)的相關(guān)性盡管DOG-1和C-erbB-2表達(dá)在病灶的單發(fā)和多發(fā)組之間差異無顯著性，但在20例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且有多發(fā)癌灶的PTC中，DOG-1與C-erbB-2常協(xié)同高表達(dá)(40%，8/20，8例均呈強(qiáng)陽性)，并呈顯著正相關(guān)(r=0.503，P=0.024，表3)。

①A①B②A②B

圖1A.DOG-1在甲狀腺乳頭狀癌中呈強(qiáng)陽性，在周圍正常濾泡上皮(下方)中陰性；B.DOG-1在乳頭狀癌中的表達(dá)以胞質(zhì)為主，SP法

圖2A.C-erbB-2在甲狀腺乳頭狀癌中呈強(qiáng)陽性，在周圍正常濾泡上皮(左側(cè))中陰性；B.C-erbB-2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)以胞質(zhì)為主，SP法

表2 DOG-1和C-erbB-2表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

表3 C-erbB-2和DOG-1在多灶且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)

3 討論

DOG1也被命名為TMEM16A(transmem-brane protein 16A)和ANO1(anoctamin 1)，是TMEM16家族成員之一。DOG1是一種鈣激活的氯離子通道蛋白，其編碼基因位于人染色體11q13區(qū)，包含26個外顯子，編碼960個氨基酸。DOG1蛋白約114 Kb，是一個具有8個跨膜功能區(qū)的膜蛋白。人11號染色體長臂1區(qū)3帶集中了很多惡性上皮性腫瘤(乳腺癌、膀胱癌等)發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的重要基因如CCND1等，因此DOG-1與癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系也成為研究熱點(diǎn)。DOG-1在GIST中表達(dá)穩(wěn)定，在90%以上GIST中出現(xiàn)DOG-1的表達(dá)，其敏感性與特異性均與CD117相似甚至略高，約1/3 CD117陰性的GIST中可檢到DOG-1的表達(dá)，因而DOG-1最早被作為GIST診斷及鑒別診斷的重要抗體。鈣激活的氯離子通道蛋白參與眾多的生理過程，如上皮細(xì)胞電解質(zhì)和水的分泌、感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)和心肌細(xì)胞興奮性調(diào)節(jié)、血管緊張度的調(diào)節(jié)等，最新研究結(jié)果表明其還與細(xì)胞生長、增殖以及侵襲有關(guān)[8]。DOG-1作為鈣激活的氯離子通道蛋白，其作用顯然不應(yīng)僅局限于作為GIST的標(biāo)志物。Ayoub等[9]的研究結(jié)果證實(shí)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中DOG-1的高表達(dá)有助于細(xì)胞的容積改變，促進(jìn)侵襲，從而引起轉(zhuǎn)移進(jìn)展，與差預(yù)后相關(guān)。此外在肝癌、前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)DOG-1有高表達(dá)，沉默、抑制或者敲除ANO1基因，會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[10-11]。那么DOG-1是如何促進(jìn)腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的呢？目前研究結(jié)果揭示可能是通過激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CAMKⅡ)信號隨后激活PI3K-AKT通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[12]。也有研究表明[13]是通過激活RAS-RAF-MEK-ERK1/2通路導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的增殖。

正是基于研究中揭示的DOG-1和EGFR之間的關(guān)系，作者選擇了與EGFR(ErbB1)一樣同屬HER/ErbB家族，結(jié)構(gòu)和功能高度相似的C-erbB-2(HER2/ErbB2)。正常情況下，C-erbB-2癌基因參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化。如果C-erbB-2是激活的，結(jié)構(gòu)的變化將導(dǎo)致過度表達(dá)，C-erbB-2蛋白在各種腫瘤中的表達(dá)水平各研究結(jié)果均有差別。

本實(shí)驗(yàn)顯示，DOG-1和C-erbB-2在PTC中表達(dá)會增高，陽性率分別為27.08%(13/48)和39.58%(19/48)。而在良性病變組織中不表達(dá)或僅有個別表達(dá)，但其表達(dá)率顯示作為甲狀腺良惡性病變鑒別診斷的價值有限。本組實(shí)驗(yàn)亦顯示，PTC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者DOG-1以及C-erbB-2的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，兩者差異有顯著性。文獻(xiàn)報道，結(jié)直腸癌中C-erbB-2的陽性率為25.64%，其表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[14]。本組PTC中C-erbB-2和DOG-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腺外侵犯密切相關(guān)，與文獻(xiàn)相符。尤其在多灶且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中C-erbB-2和DOG-1呈協(xié)同高表達(dá)，從而提示DOG-1和C-erbB-2通過某種機(jī)制互相影響，聯(lián)合檢測可以作為PTC患者預(yù)后指標(biāo)之一。

除了為PTC的預(yù)后分層提供依據(jù)外，一些研究[15]還顯示DOG-1的過表達(dá)還可以提高頭頸部鱗狀細(xì)胞癌對EGFR靶向治療藥吉非替尼的敏感性，針對DOG-1和EGFR的聯(lián)合靶向治療將降低單藥耐藥可能性。聯(lián)合抑制DOG-1的過表達(dá)還增加針對EGFR過表達(dá)的西妥昔單抗以及C-erbB-2高表達(dá)的曲妥珠單抗的敏感性，減少耐藥[16]。眾所周知，對碘131難治性PTC以及復(fù)發(fā)病例的治療是臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)，隨著對甲狀腺癌分子機(jī)制研究的不斷深入，越來越多的靶向藥物開展了針對甲狀腺癌的臨床試驗(yàn)。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)是目前在甲狀腺癌中研究最多的靶向治療藥物[17]。包括索拉非尼、舒尼替尼、凡得替尼、阿昔替尼、莫替沙尼和吉非替尼等在內(nèi)的多個TKIs已開展了臨床試驗(yàn)，證實(shí)TKIs在一定程度上可以緩解疾病進(jìn)展。但是，至今尚無患者出現(xiàn)完全治愈，部分緩解率最高也不足50%。因此，本組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為難治性PTC多靶點(diǎn)的聯(lián)合治療提供新依據(jù)。推測DOG-1為可能的靶向治療標(biāo)志物。

在其它腫瘤中DOG-1及C-erbB-2蛋白的表達(dá)主要在胞膜，而本組實(shí)驗(yàn)中，這兩者在PTC中的表達(dá)主要在上皮的胞質(zhì)中，這說明DOG-1及C-erbB-2蛋白在不同組織中的表達(dá)模式不同，可能與代謝、再循環(huán)和降解過程有關(guān)。DOG-1在PTC中的作用分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本組實(shí)驗(yàn)中涉及的病例并未包含高細(xì)胞型、柱狀細(xì)胞型等高危亞型，以后有待進(jìn)一步深入探討。

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