全自動染色機在制備涂膠載玻片中的改良應(yīng)用

魯 波，錢潔芳，任麗芳，張 鵬，沈 寅，李美平，戈文舜，包 磊

在日常免疫組化染色中防止組織切片在染色過程中脫落，是免疫組化的重要環(huán)節(jié)[1]。因此，操作前必須將載玻片用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyitriethoxyssicane, APES)進(jìn)行預(yù)處理。本科室利用全自動染色機制作涂膠載玻片，效果良好，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料(1)載玻片規(guī)格：25.4 mm×76.2 mm×(1～1.2) mm；(2)APES試劑：10 mL(工作濃度1 ∶50)；(3)隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；(4)全自動HE染色機(Leica St5020型，德國Leica公司)；(5)丙酮；(6)蒸餾水(自配)；(7)重鉻酸鉀清洗液。(8)實驗對照組的組織標(biāo)本類型：選用質(zhì)地較硬，易掉片的子宮頸錐切組織、子宮平滑肌瘤組織、帶血塊的子宮內(nèi)膜組織。

1.2方法

1.2.1載玻片預(yù)處理 將所需載玻片清除包裝后浸于清洗液中過夜，取出后自來水沖洗干凈。蒸餾水沖洗1遍，將裝有載玻片的染色架至65 ℃溫箱烘干備用。

1.2.2全自動染色機程序編輯 按下Clip Color進(jìn)入Program Clip colorassignment菜單為程序設(shè)定顏色代碼。按下Insert Row創(chuàng)建程序步驟，實驗選用染色機空置的4缸染色缸，分別設(shè)置APES丙酮缸2 min→空缸5 min→蒸餾水缸15 s→空缸，按下Sation打開Choose Sation菜單選擇站點，然后按Confirm將所選站點指定到該步驟。按下Duration設(shè)置步驟的持續(xù)時間，按Confirm確認(rèn)。按照上述方法依次設(shè)定其他步驟數(shù)。最后一個站點設(shè)置，即下載站點。進(jìn)入Choose Sation選擇Exit作為最后一個站點。

1.2.3涂膠載玻片制作運行 將APES和丙酮(1 ∶50)混勻后，將此液倒入APES丙酮缸備用，將蒸餾水倒入蒸餾水缸備用，將洗凈的載玻片插入染色架(30張/架)中，并配上指定標(biāo)記染色頭(以便機器操作時識別)，放入染色機中自動運行，依次經(jīng)過待定缸→APES丙酮缸→空缸→蒸餾水缸→結(jié)束空缸。

1.2.4涂膠載玻片溫箱烘烤 將浸泡好的涂膠載玻片放入65 ℃恒溫培養(yǎng)箱烘烤2 h后放置室溫自然冷卻，晾干后裝入載玻片包裝盒中備用。

2 結(jié)果

本實驗選用質(zhì)地較硬、平時容易脫片的平滑肌瘤組織、子宮頸錐切組織和帶有血塊的子宮內(nèi)膜組織2 μm厚切片，選用自動染色機制備的涂膠片進(jìn)行貼片，烤片后行免疫組化染色，結(jié)果無一組織脫片，鏡下觀察陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，無背景著色，結(jié)果可靠穩(wěn)定(圖1～3)。

3 討論

免疫組化染色技術(shù)以其操作簡單、敏感性高、特異性強，能將形態(tài)和抗原定位結(jié)合起來等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床病理診斷和鑒別診斷[2]。在免疫組化染色過程中，切片需長時間在液體中孵育，并受高溫高壓抗原修復(fù)等步驟的處理。因為，脫片現(xiàn)象時有發(fā)生，尤其在組織處理不佳時更加明顯；所以在日常病理工作中經(jīng)常需要將載玻片用粘合劑預(yù)處理，以減少組織或細(xì)胞的損失[3]。

從經(jīng)濟角度分析，雖然市場上已有成品涂膠載玻片出售，但是其價格較高，通常50片/盒為100元左右，30盒為3 000元，而10 mL APES+490 mL丙酮混合制涂膠片，數(shù)量可達(dá)30盒左右(50片/盒)，其10 mL APES售價僅為80元；兩者價格相比，甚為明顯。從環(huán)保角度分析：丙酮是刺激性揮發(fā)性液體，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制、麻醉作用。長時間接觸可產(chǎn)生頭暈、惡心及嘔吐。APES是一種腐蝕性液體，配制時應(yīng)避免接觸皮膚，通常工作人員都是手工制作涂膠載玻片，不僅對人體危害極大，而且揮發(fā)的丙酮始終暴露在辦公場所中。而全自動染色機制作涂膠載玻片時所有過程均在封閉的機器中進(jìn)行，大大減少與人的接觸，降低了有毒有害氣體對人體的侵害。染色機又安放在通風(fēng)管道口，揮發(fā)的氣體可直接排放至室外。從質(zhì)量角度分析：通常制作涂膠載玻片方法繁瑣費時費力，由于沒有合適的容器，實驗中以往選用50 mL隔槽玻璃杯制作。因此，一般只能制作3～4盒(50片/盒)，而且每次制作時不能保證手法一致，制成的涂膠片附著的APES流量會不一致，受人為因素影響較大。而全自動染色機以其卓越的性能和良好的處理效果，特別是穩(wěn)定、高效，逐漸被各級醫(yī)院病理科接受并使用[4]，大大減少手工操作時間，且染色架的合理間隙使每張載玻片均能均勻的涂抹到APES，通過計算機處理程序的精確操作，確保制作涂膠片的質(zhì)量，制成的涂膠載玻片看不出浸泡后留下的痕跡，玻面光滑平整，又降低了工作強度，大大改善了工作環(huán)境。病理涂膠載玻片制作由傳統(tǒng)的經(jīng)驗控制轉(zhuǎn)變?yōu)榭茖W(xué)的質(zhì)量控制?？傊?，合理利用全自動染色機制作涂膠載玻片能夠減少機器的空置率。用完清洗干凈，不影響機器再次使用，此方法制成的涂膠片與市售的涂膠載玻片無明顯差異，值得推廣。

①A②A③A①B②B③B

圖1A.修復(fù)顯色后的子宮頸錐切組織，外觀完整貼片無破損；B.對應(yīng)組織鏡下顯色Ki-67陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，無背景著色，組織結(jié)構(gòu)完整

圖2A.修復(fù)顯色后的平滑肌瘤組織，外觀完整貼片無破損；B.對應(yīng)組織鏡下顯色PR陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，無背景著色，組織結(jié)構(gòu)完整圖3A.修復(fù)顯色后的帶凝血塊的子宮內(nèi)膜組織，外觀完整貼片無破損；B.對應(yīng)組織鏡下顯色Ki-67陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，無背景著色

[1] 張 威, 駱新蘭, 梁英杰. 制備硅化玻片技術(shù)方法的改進(jìn)[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2002,31(4):362.

[2] 熊正文, 王伯沄, 李春光, 等. 提高免疫細(xì)胞化學(xué)染色的新技術(shù)研究及應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)研究通訊, 2002,30(2):36-38.

[3] 周航波, 馬恒輝, 章如松, 周曉軍. 噴灑法在制備涂膠載玻片的應(yīng)用[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2011,27(6):668-669.

[4] 馬恒輝, 章如松, 周航波, 周曉軍. 全自動染色機在常規(guī)染色中的應(yīng)用[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2006,35(3):183-184.