彈力纖維染色Gomori醛品紅法的改良及應(yīng)用體會(huì)

熊紅梅，郭榮年，邱曉明

近幾年，彈力纖維染色被廣泛應(yīng)用于病理診斷中，如腫瘤靜脈浸潤(rùn)、漿膜浸潤(rùn)的判斷，腫瘤早期浸潤(rùn)的確定、皮膚彈力纖維增生癥等常常用到彈力纖維染色。皮膚組織HE染色中，彈力纖維與膠原纖維相似，均著染深淺不一的紅色，兩者較難區(qū)分，只有通過(guò)彈力纖維特殊染色才將兩者顯示出來(lái)。顯示彈力纖維的方法很多，常用的有Gomori醛品紅法、Weigert間苯二酚堿性品紅法、維多利亞藍(lán)法、Uana地衣紅法等[1]，后三種方法染色時(shí)間均長(zhǎng)，有些甚至要過(guò)夜。在常規(guī)病理檢查工作中常用Gomori醛品紅法，作者通過(guò)工作實(shí)踐和摸索，對(duì)Gomori醛品紅法進(jìn)行了改良，效果良好，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集2014～2016年福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院皮膚科取材活檢的皮膚組織30例，5例肺癌緊鄰胸膜組織，3例腸癌標(biāo)本中的動(dòng)脈組織，每例標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片、普通載玻片撈片、恒溫箱(55 ℃)烤片過(guò)夜。其中每個(gè)蠟塊均切5張，傳統(tǒng)法切片3 μm厚，改良法切片5 μm厚，分5組。

1.2設(shè)備Tissue-Tik Vip6組織脫水機(jī)，Leica2245切片機(jī)，Olympus BX41普通光學(xué)顯微鏡

1.3試劑(1)醛品紅染液：堿性品紅0.5 g+70%乙醇100 mL+濃鹽酸1 mL+三聚乙醛1 mL。先把堿性品紅溶解于70%乙醇，然后加入濃鹽酸和三聚乙醛，塞緊瓶蓋，輕輕搖動(dòng)使均勻混合，于室溫下放3～4天(冬天時(shí)所需時(shí)間更長(zhǎng))，待轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙礊槌墒炜捎?，? ℃冰箱保存。(2)Lugol碘液：碘片1 g，碘化鉀2.0 g，蒸餾水100 mL，先將碘化鉀溶解于10 mL蒸餾水，加入碘片，輕輕搖動(dòng)使之完全溶解后再加入其余蒸餾水，置4 ℃冰箱保存。(3)5%硫代硫酸鈉液：硫代硫酸鈉5 g+蒸餾水100 mL溶解混合，置4℃冰箱保存。(4)桔黃G液：桔黃G 2 g+磷鎢酸5 g+蒸餾水100 mL，室溫保存，取上清液使用。(5)0.5%高錳酸鉀溶液：高錳酸鉀0.5 g+蒸餾水100 mL混勻溶解棕色瓶裝，置4 ℃冰箱保存。(6)酸性高錳酸鉀溶液：0.5%高錳酸鉀溶液與0.5%硫酸臨用前等量混合。(7)2%過(guò)碘酸：過(guò)碘酸2 g+蒸餾水100 mL混勻溶解，置4 ℃冰箱保存。(8)3%過(guò)氧化氫溶液：為醫(yī)用雙氧水，本院藥劑科提供。(9)70%乙醇：70 mL無(wú)水乙醇+30 mL蒸餾水配成，室溫保存。(10)2.5%草酸溶液：2.5 g草酸+蒸餾水100 mL混合溶解，室溫保存?zhèn)溆谩Ｋ迷噭┚鶠閲?guó)產(chǎn)分析純。

1.4染色方法(1)組：傳統(tǒng)Gomori醛品紅法[1]；(2)組：改良酸性高錳酸鉀法；(3)組：改良0.5%高錳酸鉀法；(4)組：改良2%過(guò)碘酸法；(5)組：改良3%過(guò)氧化氫法。5種具體染色方法見(jiàn)表1。

1.5觀察方法顯微鏡觀察染色切片，參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊(cè)》常規(guī)石蠟切片質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]，省略其它項(xiàng)目的分值，僅對(duì)“染色清晰、對(duì)比度好”該項(xiàng)10分，應(yīng)用于彈力纖維著色清晰度、對(duì)比度進(jìn)行評(píng)分。用10×物鏡觀察彈力纖維，皮膚組織再用40×物鏡觀察耐酸纖維、前彈力纖維，>90%彈力纖維清晰著色鮮艷為9～10分，80%～90%為8～9分，70%～80%為7～8分，60%～70%為6～7分，依此類(lèi)推，不著色為0分。

2 結(jié)果

38例組織5種方法染色質(zhì)量平均分：傳統(tǒng)法(1)組為4.20±1.19，改良法(2)組為9.43±0.50，(3)組為9.03±0.61，(4)組為8.80±0.84，(5)組為4.80±1.69，改良法(2)(3)(4)與傳統(tǒng)法(1)比較差異有顯著性(P<0.05)，改良法(5)與傳統(tǒng)法(1)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，傳統(tǒng)法與改良法染色結(jié)果比較見(jiàn)表2(圖1～10)。

3 討論

彈力纖維廣泛分布于身體各處，特別在皮膚、血管壁、韌帶、氣管、支氣管、肺泡、耳廓和腺體的導(dǎo)管處最為豐富，它由兩種成分組成，即集合束的彈力微纖維(由糖蛋白形成)和均質(zhì)狀的彈力蛋白，彈力蛋白提供彈力纖維的彈性，彈力纖維在新鮮標(biāo)本上呈黃色發(fā)亮的細(xì)線(xiàn)條狀，在HE染色下，呈深淺不一的粉紅色，與膠原纖維不易區(qū)別，為了更好地顯示彈力纖維的病變，作者在傳統(tǒng)法的基礎(chǔ)上做了如下幾個(gè)方面的改良：(1)氧化劑的改良：酸性高錳酸鉀、高錳酸鉀、過(guò)碘酸、過(guò)氧化氫均為氧化劑，彈力纖維的主要成分含有豐富的二硫鍵糖蛋白又稱(chēng)彈性蛋白，切片經(jīng)上述氧化劑氧化后，彈力纖維內(nèi)糖蛋白中已糖羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槿┗c成熟的呈深紫色的醛品紅染液具有較強(qiáng)的親和力，與彈力纖維結(jié)合很緊。傳統(tǒng)法Lugol碘液是碘和碘化鉀的混合溶液，作為氧化劑，其氧化能力不強(qiáng)，只能顯示部分彈力纖維，對(duì)較細(xì)的耐酸纖維、前彈力纖維未能顯示，染色淡，不鮮艷清晰，對(duì)比度差，而且配制麻煩，需稱(chēng)取兩種化學(xué)粉劑。經(jīng)實(shí)踐證明，其失效快，4 ℃冰箱保存僅3個(gè)月，超過(guò)3個(gè)月染色質(zhì)量明顯減弱。改良法中高錳酸鉀是最強(qiáng)的氧化劑之一，深紫色結(jié)晶，光有催化分解作用，宜用棕色瓶室溫保存。作為氧化劑受pH值影響很大，在酸性溶液中氧化能力最強(qiáng)，可明顯提高其氧化作用，在病理實(shí)驗(yàn)室常用的濃度為0.25%～0.5%，作者用0.5%的高錳酸鉀溶液，具有強(qiáng)烈的氧化作用，酸性高錳酸鉀改良法中臨用前在0.5%的高錳酸鉀溶液中加入等量的0.5%硫酸，其氧化作用更強(qiáng)，能將彈力纖維系統(tǒng)的三種纖維成分均清晰顯示出來(lái)，染色鮮艷，質(zhì)量穩(wěn)定，效果最佳，與傳統(tǒng)氧化法相比，差異有顯著性(P<0.05)。過(guò)碘酸也稱(chēng)高碘酸，白色結(jié)晶，無(wú)臭，有潮解性，粉劑宜置冰箱保存，屬無(wú)機(jī)氧化劑，性質(zhì)穩(wěn)定，常用濃度0.5%～5%，作者用2%的過(guò)碘酸作用20 min，無(wú)需漂白的步驟，其染色質(zhì)量穩(wěn)定，效果也很理想，與傳統(tǒng)法比較差異有顯著性(P<0.05)。過(guò)氧化氫溶液為無(wú)色透明溶液，由于其性質(zhì)活潑且容易分解，保存時(shí)應(yīng)該盡量使用密閉容器，防止日光照射，而且不宜長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，雙氧水的工作性質(zhì)是新生態(tài)氧，其有較強(qiáng)的氧化作用，又有漂白作用，市售濃度30%，醫(yī)用濃度3%，本組實(shí)驗(yàn)采用3%過(guò)氧化氫溶液作用20 min，彈力纖維清晰，但由于其性質(zhì)不穩(wěn)定，不易儲(chǔ)存，染色效果也不夠穩(wěn)定，塑料瓶裝，剛開(kāi)封使用，染色效果很好，著色鮮艷、清晰，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，氧化能力下降，即使在有效期內(nèi)，染色效果也越來(lái)越差，特別在皮膚組織中彈力纖維不夠清晰，對(duì)比度較差，但在胸膜、動(dòng)脈中染色清晰，對(duì)比度好，這可能是由于彈力纖維在不同組織中的結(jié)構(gòu)形式不同有關(guān)，如在皮膚組織中，彈力纖維呈單條出現(xiàn)；在胸膜、動(dòng)脈中呈膜樣結(jié)構(gòu)[3]，鏡下容易觀察辨認(rèn)。因此，與傳統(tǒng)法比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。(2)醛品紅染液儲(chǔ)存方式的改良：配好成熟后，用裝免疫組化抗體的小塑料瓶分裝，可以延長(zhǎng)試劑有效期，減少三聚乙醛和乙醇的揮發(fā)，導(dǎo)致染液失效快，造成浪費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存可以10個(gè)月，甚至1年仍然有效。(3)染色方式的改良：由于染液中含乙醇易揮發(fā)，傳統(tǒng)法采用立式染缸浸染，但浸染所用染液量多，造成浪費(fèi)，而且對(duì)后面切片的染色不能保證試劑新鮮，容易污染。作者經(jīng)改良采用滴染用孵育盒加蓋的方式染色，可以保證試劑新鮮，且不致污染。為了不影響效果，避免染色過(guò)程中染液彌散，染色時(shí)70%乙醇浸洗完，用吸水紙擦干或讓其自然涼干，再用固體石蠟在組織周邊5 mm處劃粗線(xiàn)條的圈，并且中途往切片上補(bǔ)滴染液1～2次，防止乙醇揮發(fā)導(dǎo)致干片。(4)醛品紅染色時(shí)間延長(zhǎng)到20 min，可使染色更加鮮艷、清晰。(5)分化是染色的關(guān)鍵，分化過(guò)久，已經(jīng)染上的彈力纖維退色，分化不夠，切片底色不干凈，對(duì)比度不好，傳統(tǒng)法分化用2次，每次30 s，筆者認(rèn)為，時(shí)間太長(zhǎng)，容易使彈力纖維退色，改良法分化時(shí)，左右振蕩浸洗8～10 s比較適宜。(6)切片厚度的改良：作者切5 μm厚的切片比傳統(tǒng)法常規(guī)3 μm、4 μm厚切片更容易觀察彈力纖維的變化，染色清晰易辨。另外，在染色過(guò)程中還須注意：(1)桔黃G液要淡染，若過(guò)染則會(huì)掩蓋彈力纖維的紫色，因此，滴入桔黃G液1 s后即水洗，如過(guò)染，水洗時(shí)間可長(zhǎng)一些，如過(guò)淡，再染1 s后水洗。(2)皮膚組織必須切片完整[4]，更容易觀察彈力纖維的連續(xù)性，完整性。但由于其表層細(xì)胞層次多，纖維組織與脂肪組織豐富，切片不易切全，易產(chǎn)生破碎，組織松散或切片厚薄不均等現(xiàn)象，為了切片完整，皮膚組織脫水、透明、浸蠟必須充分，切片時(shí)粗修完的蠟塊必須充分冷凍，30～60 min，5 μm厚，另外，展片的水溫不能過(guò)熱，約40 ℃，以避免蠟帶熔化造成組織分離或形成裂隙等假象。

表1 傳統(tǒng)法與改良法的比較

表2 傳統(tǒng)法與改良法的染色結(jié)果比較

①②③④⑤⑥⑦⑧

圖1傳統(tǒng)法：真皮深層見(jiàn)部分與表皮平行走向的粗彈力纖維，呈纖細(xì)的極淡紫色圖2傳統(tǒng)法：真皮乳頭淺層未見(jiàn)耐酸纖維、前彈力纖維

圖3改良酸性高錳酸鉀法：真皮中見(jiàn)大量與表皮平行走向的紫色粗彈力纖維圖4改良酸性高錳酸鉀法：真皮淺層見(jiàn)細(xì)的淡紫色的前彈力纖維及與表皮基膜相連的耐酸纖維圖5改良過(guò)碘酸法：真皮深層見(jiàn)大量與表皮平行走向的紫色粗彈力纖維圖6改良過(guò)碘酸法：真皮淺層見(jiàn)細(xì)的淡紫色的前彈力纖維及與表皮基膜相連的耐酸纖維圖7傳統(tǒng)法：胸膜彈力纖維呈纖細(xì)的極淡的紫色圖8改良高錳酸鉀法：胸膜彈力纖維呈明顯的深紫色

⑨⑩

圖9傳統(tǒng)法：動(dòng)脈中的彈力纖維呈纖細(xì)的淡紫色圖10改良過(guò)氧化氫法：動(dòng)脈中的彈力纖維呈明顯的深紫色

4種改良法與傳統(tǒng)法相比，酸性高錳酸鉀組、高錳酸鉀組節(jié)約了漂白時(shí)間，僅用草酸1 min漂白，過(guò)碘酸及過(guò)氧化氫組均只須一步氧化，不需漂白，簡(jiǎn)化了染色步驟，而且傳統(tǒng)法所需化學(xué)試劑品種多，配制麻煩，四種改良法氧化劑均單一，價(jià)廉，易得，是實(shí)驗(yàn)室常用的試劑。作者認(rèn)為，對(duì)皮膚組織的彈力纖維染色時(shí)，選用改良的酸性高錳酸鉀法、高錳酸鉀法及2%過(guò)碘酸法較好，對(duì)漿膜、血管組織的彈力纖維染色，選用改良的4種方法均可，但是酸性高錳酸鉀是值得推薦的最好的方法。

(本文經(jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科馬恒輝指導(dǎo)，特此致謝！)

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