腦蛋白水解物溶液的滅活及去除病毒工藝研究

吳晶晶+段洪雙

摘 要：目的：研究腦蛋白水解物溶液的滅活及病毒去除的工藝。方法：選擇披膜病毒科黃病毒屬的豬流行性乙型腦炎病毒（乙腦）、細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的豬細(xì)小病毒（PPV）作為指示病毒，其中乙腦代表有囊膜的核糖核酸RNA），PPV作為無(wú)囊膜脫氧核糖核酸（DNA）病毒的代表。模擬生產(chǎn)工藝中的病毒滅活步驟100℃×10min，超濾作為滅活及去除病毒的條件。將病毒分別按照1∶4加入到腦蛋白水解物溶液中，進(jìn)行高溫、濃縮、超濾來(lái)滅活及去除病毒。以豬腎細(xì)胞（PK-15）細(xì)胞培養(yǎng)PPV，以倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）培養(yǎng)乙腦，測(cè)定病毒滴度。結(jié)果：PPV、乙腦通過(guò)滅菌，病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）分別為6.15log/0.1mL（logs）、5.37log/0.1mL（logs）；去除工藝平均病毒降低系數(shù)分別為6.15log/0.1mL（logs）、5.37log/0.1mL（logs）。結(jié)論：腦蛋白水解物溶液生產(chǎn)工藝中的高溫、濃縮、超濾均可作為病毒滅活及去除的有效工藝。

關(guān)鍵詞：腦蛋白水解物；滅活；去除病毒；工藝研究

健康的豬腦組織經(jīng)復(fù)合蛋白酶水解分離得到腦蛋白水解物，其主要含多種人體必須的游離氨基酸及活性小分子多肽，是一種神經(jīng)保護(hù)劑，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)的類似神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用，其中檢出游離氨基酸16種，占總含量的75%～80%，臨床多用于治療腦外傷，改善伴有記憶減退及注意力集中障礙等癥狀的腦血管疾病后遺癥，還可輔助治療腦功能不全、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神病性抑郁癥及蛋白質(zhì)消化吸收障礙等[1-2]。由于腦蛋白水解物溶液提取自動(dòng)物器官，在動(dòng)物源的選擇上或生產(chǎn)過(guò)程中可能存在源性病毒及其他污染性病毒。產(chǎn)品的安全性是產(chǎn)品生產(chǎn)的硬性指標(biāo)，為了保證產(chǎn)品的質(zhì)量，除了通過(guò)嚴(yán)格控制原料的來(lái)源和質(zhì)量外，還應(yīng)該在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中增加相應(yīng)的病毒滅活及去除步驟[3]。本次針對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的一些環(huán)節(jié)進(jìn)行研究探討，找出適合腦蛋白水解物溶液的滅活及去除病毒的工藝，并總結(jié)如下。

1.材料與方法[4]

1.1細(xì)胞與毒株 豬細(xì)小病毒（PPV 9025 C4）株、乙腦病毒株均在成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采購(gòu)，豬腎細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）作為傳代細(xì)胞，均由吉林萬(wàn)通藥業(yè)集團(tuán)梅河藥業(yè)股份有限公司實(shí)驗(yàn)室存放。本次研究時(shí)間為2015年10月至2016年9月。

1.2藥品與試劑 滅活前的腦蛋白水解物病毒中間體（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)141020、141021、141022）；RPMI 1640培養(yǎng)基、抗生素（雙抗）、胎牛血清、胰酶等均由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供

1.3儀器 ZCP-50W水套式CO2培養(yǎng)箱，上海喆圖科學(xué)儀器有限公司；MHY-26435超潔凈工作臺(tái)，北京美華儀科技有限公司；奧林巴斯倒置顯微鏡CKX53，成貫儀器（上海）有限公司；離心超濾管（0.22μm），上海摩速科學(xué)器材有限公司其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器由本人所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒的增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15豬腎細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同步接種PPV，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）長(zhǎng)成致密單層時(shí)接種乙腦，按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變后，將其置于-20℃/37℃進(jìn)行3次反復(fù)凍融，收集病毒液。未接種病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞。

1.5病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染計(jì)量的測(cè)定 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中測(cè)定細(xì)胞半數(shù)感染量，將傳代消化后的細(xì)胞稀釋成約105～106個(gè)/mL后，轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔0.2mL；PK-15細(xì)胞傳代貼壁后再其未進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí)機(jī)加入培養(yǎng)基，接種PPV。將病毒液進(jìn)行連續(xù)10倍的稀釋，待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后加入培養(yǎng)基，并將乙腦病毒接種，每個(gè)稀釋度以0.1mL接種6孔，并用0.9%NaCl注射液做陰性對(duì)照，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3小時(shí)后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE并記錄，按Reed-Muench計(jì)算TCID50，病毒的TCID50應(yīng)大于105；

1.6模擬制備工藝樣品 在無(wú)菌罩內(nèi)打開(kāi)三批樣品溶液，每批取3.2mL等量裝入兩只2mL凍存管中，每管在分別加入PVP和乙腦病毒各0.4mL，混勻后作為高溫條件下滅活實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)樣品，并標(biāo)記為高溫。按生產(chǎn)工藝中的病毒滅活及去除工藝的方式處理樣品，將上述標(biāo)記為高溫的加入病毒的樣品分別在100℃下滅活10min，做為下一步病毒滅活效果監(jiān)測(cè)的樣品。另分別取的三批樣品各3.2mL，，等量分裝于兩只2mL凍存管中同樣各加入0.4mL的PVP和乙腦病毒混勻，用超濾柱超濾，并標(biāo)記，作為超濾病毒滅活及去除實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品。同時(shí)做以培養(yǎng)基代替樣品溶液做不加入病毒的樣品對(duì)照。

1.7批量制備工業(yè)樣品 取新鮮豬腦100kg，按工藝方法處理后得到脫脂腦酚11kg，加水溶解并混合2.9kg的胃蛋白酶、1.9kg胰蛋白酶進(jìn)行過(guò)濾，經(jīng)柱層析后得到腦蛋白水解物。

1.8測(cè)定病毒滅活的滴定度，按1.5的方式將轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞稀釋液加入濃度為2%的血清，BHK-21細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄去培養(yǎng)基，重新加入0.09mL培養(yǎng)基后接種0.01mL在1.6中制備的樣品；PK-15細(xì)胞以每孔0.09mL同步接種病毒0.01mL傳代至培養(yǎng)板。接種樣品分別為：加入病毒并經(jīng)過(guò)病毒滅活及去除（高溫/超濾）過(guò)程的樣品、未加入病毒并經(jīng)過(guò)病毒滅活及去除（高溫/超濾）過(guò)程的樣品、經(jīng)過(guò)（高溫/超濾）處理后的病毒對(duì)照品、病毒原液、加入培養(yǎng)基的細(xì)胞空白對(duì)照。除空白對(duì)照樣品外，其余樣品莒南10倍梯度稀釋，連續(xù)做6個(gè)滴度，每個(gè)滴度向洪福2次，接種病毒后3h更換培養(yǎng)基。接種乙腦病毒、PPV進(jìn)行CPE的72h觀察。

2.結(jié)果

分別測(cè)定PPV毒株和乙腦毒株的TCID50，每隔24h通過(guò)倒置顯微鏡觀察未接種病毒的和接種病毒后的PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞，72h內(nèi)未接種病毒的PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞形態(tài)基本完整，無(wú)明顯變化；而接種病毒后的PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)的脫落、拉網(wǎng)、圓縮、折光性減弱等明顯的CPE。收集接毒48h的PK-15細(xì)胞、接毒72hBHK-21細(xì)胞各30mL，分裝于凍存管中，作為本實(shí)驗(yàn)的病毒原液。按Reed-Muench計(jì)算出PPV的TCID50，為0.1mL 107.24logs，乙腦的TCID50，為0.1mL 103.36logs，兩者稀釋的病毒液備用。

模擬工藝對(duì)加入病毒的樣品進(jìn)行滅活及去除驗(yàn)證，經(jīng)高溫、超濾后的樣品加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)觀察，此件對(duì)照細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

3.討論

通過(guò)本次研究結(jié)果，可以看出病毒滅活及去除的效果受多種因素影響，如何針對(duì)這些影響因素作出客觀的評(píng)價(jià)，在將乙腦和PPV病毒添加到腦蛋白水解物溶液中中，高溫工藝可以有效的將病毒滅活，超濾可有效將其去除，從而都是病毒喪失了對(duì)細(xì)胞的感染能力。通過(guò)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組可以看出，經(jīng)以上方法處理后的男蛋白水解物溶液不再對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。由此可見(jiàn)，在生產(chǎn)工藝中增加有效的病毒滅活和去除措施是非常必要的，高溫滅活和超濾去除病毒的方法在工藝上是可行的，部分學(xué)者[5]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在超濾工藝的基礎(chǔ)上增加了層析工藝，更有利于生產(chǎn)過(guò)程中的雜志去除，該項(xiàng)結(jié)論值得進(jìn)一步研究推廣和研究。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：吳晶晶，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，主管藥師，150025，本科，1983年生人。