高純度EGCG單體提取與分離純化小試工藝研究

鄭琳++龔自明

摘要：在篩選出合適的富含EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）的茶葉原料基礎(chǔ)上，開展提取和分離純化試驗，獲得配套工藝和參數(shù)，得到高純度EGCG單體。結(jié)果顯示，浸提溫度70 ℃，料液比1∶20（g/mL）條件下浸提60 min，茶湯中EGCG含量較高；浸提液用聚酰胺樹脂純化分離，純化的最佳工藝條件為上樣流速1 BV/h、料液濃度為20 mg/mL、解吸流速為1 BV/h，分別用1 BV的水、1 BV 20%的乙醇溶液以及1 BV 80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，兩次柱層析制得的EGCG純度為95.21%，得率僅為0.276%。該方法綠色無污染，對提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義。

關(guān)鍵詞：EGCG；提取；分離純化；工藝研究

中圖分類號：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6533-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.052

EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）作為茶葉中的一種有效成分，具有抗病毒、抗氧化、抑菌消炎等功能[1]，在體內(nèi)外試驗中被證實具有廣泛的抗癌活性，其抗癌機(jī)理包含誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、阻滯細(xì)胞轉(zhuǎn)移、協(xié)同抗癌等[2]。近年來對其功效的研究日趨深入和完善，被廣泛用于食品、保健品和日化領(lǐng)域。本研究通過對高純度EGCG的提取、分離純化工藝的探討，為放大生產(chǎn)EGCG提供參考，對提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉原料 茶葉原料來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所茶葉資源圃種植的鄂茶1號、鄂茶5號、鄂茶8號、中茶108和福鼎大白。

1.1.2 試驗試劑 乙醇為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸、乙腈為色譜純（美國Fisher Chemical）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料篩選 在前人研究基礎(chǔ)上[3]，選擇EGCG含量相對較高的茶葉資源作為試驗原料。采摘一芽二葉（采摘日期為2015年8月6日），100 ℃純水蒸制3 min，100 ℃烘至足干，茶樣粉碎后過40目篩，分別稱取3 g，加入500 mL水，100 ℃浸提45 min，得到的濾液定容至500 mL，HPLC法檢測其EGCG含量。

1.2.2 EGCG的提取 單因素試驗：按照茶多酚提取方法，浸提溫度選取40、50、60、70、80、90、100 ℃，浸提時間選取30、40、50、60、70、80、90 min，浸提料液比選取1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20（g/mL，下同），以此研究各因素的影響作用。

正交試驗：通過單因素試驗，分析各因素對EGCG浸出量的影響，確定較佳的單因素試驗條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以浸提溫度、浸提時間、料液比為主要影響因素，各選出4個水平，安排L16（43）正交試驗分析。

1.2.3 EGCG的分離純化 樹脂的預(yù)處理：樹脂在使用之前需要進(jìn)行有效的預(yù)處理，以除去制備和貯存中引入的雜質(zhì)。一般預(yù)處理的方法是：①乙醇浸泡。樹脂浸泡在95%左右濃度的乙醇中，乙醇的液面高于樹脂，不停攪拌以使樹脂和乙醇充分接觸，對樹脂進(jìn)行初步的浮選。浸泡時間一般為24 h。②乙醇沖洗。浸泡后的樹脂濕法上柱，再用95%的乙醇沖洗，直至流出液清亮無渾濁為止。③3%的氫氧化鈉溶液的浸泡和沖洗。先將經(jīng)乙醇浸泡沖洗過的樹脂浸泡于3%的氫氧化鈉溶液中4 h，再以2 BV 3%的氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗至中性。④5%的檸檬酸沖洗。先將經(jīng)3%的氫氧化鈉溶液浸泡沖洗過的樹脂浸泡于5%的檸檬酸溶液中4 h，再以2 BV 5%的檸檬酸沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗至中性[4]。

樹脂的篩選：在劉偉等[5]、王偉濤等[6]研究基礎(chǔ)上，選擇AB-8、HPD-826和聚酰胺三種樹脂。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，樹脂在使用3～15次時柱效穩(wěn)定、分離效果較佳，故選取使用過2次的3種樹脂各8 g，分別置于500 mL的具塞磨口燒瓶中，加入2%濃度的原茶湯400 mL，在恒溫?fù)u床（30 ℃、140 r/min）上充分吸附2 h，考察樹脂對EGCG的吸附量。冰箱中靜置約12 h后過濾，濾液中加入200 mL 80%的乙醇，在恒溫?fù)u床上充分解吸2 h，得解吸液。將以上的原茶湯、吸附后茶湯殘留液和解吸液各用移液管吸取5 mL，定容至50 mL，進(jìn)行HPLC分析檢測，并按下式分別計算吸附量和解吸率：

Q=■；E=■

式中，Q為吸附量（mg/g），M為去游離水的樹脂質(zhì)量（g），E為解吸率，V1為茶湯原始體積，V2為80%乙醇洗脫液體積，C1為原茶湯溶液濃度（mg/mL），C2為樹脂吸附后剩余茶湯殘留液濃度（mg/mL），C3為80%乙醇洗脫液濃度（mg/mL）。

洗脫劑濃度的選擇：選用篩選到的樹脂，茶湯（500 mL，濃度為20 mg/mL）上柱流速控制在1 BV/h，上柱后靜態(tài)吸附2 h，開展解吸試驗。先研究水洗量對咖啡因和EGCG含量的影響，再分別制備乙醇濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的洗脫液，解吸流速控制在1 BV/h，研究EGCG和咖啡因在樹脂中的乙醇梯度洗脫的含量變化。

1.3 高效液相色譜分析檢測方法

色譜柱為PhenomenexGemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A：0.2%乙酸水溶液（V/V），流動相B：乙腈。流速：0.8 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取EGCG標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶于一定量的25%乙腈水溶液中，分別配制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)EGCG標(biāo)樣及相對保留時間作為定性方法，以峰面積計算其含量，工作曲線Y=11 004 641.426X-528 274.199。其中Y為峰面積；X為樣品濃度（mg/mL）。洗脫梯度見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料篩選

表3為不同茶葉資源中EGCG的含量。由表3可見，鄂茶1號中EGCG含量相對較高，可用作提取分離純化高純度EGCG單體的原料。

2.2 EGCG的提取

2.2.1 單因素試驗結(jié)果 圖1表明，浸提液中EGCG的含量隨著浸提溫度的升高先升后降，分析其原因為浸提以擴(kuò)散原理為基礎(chǔ)，隨溫度升高，擴(kuò)散速度加快，浸提液中EGCG含量有所增加，但當(dāng)溫度到達(dá)一定值后，EGCG的氧化速度也加快，含量反而有所下降。

圖2表明，浸提液中EGCG的含量隨著浸提時間的延長先升后降，分析其原因為固-液浸提過程為三步[7]：①溶劑進(jìn)入固體內(nèi)部，溶質(zhì)溶解；②溶質(zhì)從固體內(nèi)部到表面；③溶質(zhì)溶解液從固體表面到溶劑中。這個過程需要一定的時間，在這個時間范圍內(nèi)，隨浸提時間的延長，EGCG浸出量增加，但當(dāng)浸提時間到達(dá)一定值后，因溫度原因EGCG的氧化速度加快，含量反而有所下降。

圖3表明，在選取的料液比范圍內(nèi)隨著浸提用水量的增加，浸提液中EGCG含量一直呈上升趨勢，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶16后，再增加浸提用水量，對EGCG的浸出影響不大，分析其原因為茶粉中所含的EGCG量是一定的，當(dāng)浸提用水量到達(dá)一定值后，茶粉中EGCG已全部浸提出，再增加用水量EGCG也沒有明顯增加，反而會因溫度等原因加快EGCG的氧化，同時給后續(xù)吸附、解吸和濃縮處理增加能耗，提高生產(chǎn)成本。

2.2.2 正交試驗確定浸提茶多酚和EGCG的最佳條件 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，浸提溫度選取60、70、80、90 ℃，浸提時間選取40、50、60、70 min，浸提料液比選取1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，正交分析結(jié)果見表4和表5。

由表4可知，最佳浸提工藝組合為A2B3C4，即浸提溫度70 ℃，浸提時間60 min，料液比1∶20，此條件下茶湯中EGCG含量為9.041%。由表5可知，浸提溫度和料液比對浸提液中EGCG含量的影響顯著，浸提時間對浸提液中EGCG含量的影響不顯著。

2.3 EGCG的分離純化

2.3.1 樹脂的篩選結(jié)果 由表6可見，聚酰胺樹脂優(yōu)于其他兩種，可用于較好地分離純化茶湯中的EGCG單體。分析其原因是聚酰胺樹脂具有的酰胺基與EGCG分子上的酚羥基進(jìn)行氫鍵締合能產(chǎn)生較好的吸附作用，用高濃度乙醇洗脫時解吸率也較高。

2.3.2 洗脫梯度選擇 浸提液上柱完成后先用純水洗脫，這是因為咖啡因?qū)儆卩堰噬飰A，在溶劑中作為氫鍵受體，不易與聚酰胺樹脂形成較強(qiáng)吸附作用，而EGCG的酚羥基與聚酰胺樹脂的酰胺基具有很好的氫鍵結(jié)合力，所以用純水沖洗時，水洗量對EGCG的含量幾乎無影響，對咖啡因的解吸效果影響比較明顯。由圖4可見，解吸液中咖啡因含量隨水洗量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且在500 mL水洗量（1 BV料液）的時候咖啡因的含量達(dá)到最高。

由圖5可知，解吸液中EGCG含量隨著乙醇濃度的提高而升高，乙醇濃度為80%時達(dá)到最高，而后稍降低，分析其原因為乙醇分子中的羥基與EGCG分子中的酚羥基有很強(qiáng)的氫鍵結(jié)合力，有效取代了聚酰胺樹脂與EGCG分子的結(jié)合，但是聚酰胺樹脂結(jié)合的EGCG分子數(shù)量是一定的，所以當(dāng)乙醇濃度到達(dá)一定值后，過剩的乙醇分子開始結(jié)合除EGCG以外的其他分子，導(dǎo)致解吸液中EGCG含量反而有所下降。

由圖6可見，咖啡因含量隨著乙醇濃度的提高而降低，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%以后，變化微小。分析其原因為低純度乙醇溶液中極性和非極性分子同時大量存在，可充分洗脫出樹脂柱中的咖啡因，隨乙醇濃度增加，極性分子含量增多，非極性分子含量減少，咖啡因的解吸量反而下降。

綜合圖4、圖5和圖6的結(jié)果，從產(chǎn)品的品質(zhì)和成本考慮，選用梯度洗脫：先用1 BV的純水洗脫，再用1 BV 20%乙醇洗脫，最后用1 BV 80%乙醇洗脫，所得解吸液經(jīng)懸轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，但試驗最終得到的EGCG單體純度僅為90.87%。為解決產(chǎn)品純度問題，考慮兩次上柱純化的方案，最終得到純度為95.21%的EGCG單體，但得率僅為0.276%。

3 小結(jié)與討論

3.1 結(jié)論

湖北省廣泛種植的5種茶葉資源中，鄂茶1號的EGCG含量相對較高，可用作提取、分離純化高純度EGCG單體的原料。

用純水浸提，浸提溫度70 ℃，料液比1∶20條件下浸提60 min，所得浸提液中EGCG含量最高。

聚酰胺樹脂由于其酰胺基能對含酚羥基的EGCG具有較好的吸附作用，且對CAF的選擇吸附作用較低，非常符合本試驗制備無酯兒茶素產(chǎn)品的要求。聚酰胺樹脂純化兒茶素最佳工藝條件為：上樣流速1 BV/h、茶湯濃度為20 mg/mL，解吸流速為1 BV/h，分別用1 BV的水、1 BV 20%的乙醇溶液以及1 BV80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。

通過兩次柱層析分離純化，得到的EGCG單體純度可達(dá)95.21%。

3.2 討論

本研究通過提取、分離純化工藝的探討，得到了高純度EGCG單體，工藝綠色無污染，對提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義，但是得率低，成本相對較高。預(yù)計從兩方面著手開展后續(xù)試驗：一是擴(kuò)大高EGCG含量茶葉資源[8]的篩選范圍，從湖北省擴(kuò)大到全國；二是進(jìn)一步篩選合適的樹脂，力求一次柱層析可分離純化得到95%純度的EGCG單體，減少損耗，提高得率。

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