中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析

劉巧英++李夢歌++劉雪飛++余昊++王運兵

摘要：采用兼并引物和RACE的技術(shù)，在中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）中獲得絲氨酸蛋白酶的全長cDNA序列，將該基因命名為ASJSP，cDNA全長為958 bp，開放閱讀框為885 bp，推測編碼295個氨基酸，預(yù)計分子量為31.20 kDa，等電點pI為9.38，預(yù)測分子式為C1 374H2 222N390O407S15，不穩(wěn)定系數(shù)為31.94，總親水性系數(shù)為0.114，為疏水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。序列分析表明ASJSP與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的核苷酸序列一致性為55.70%。

關(guān)鍵詞：中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）；絲氨酸蛋白酶；RT-PCR；序列分析

中圖分類號：S433.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5659-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.056

Cloning and Sequence Analysis of Serine Proteinase of Adelphocoris suturalis Jakovlev

LIU Qiao-ying， LI Meng-ge， LIU Xue-fei， YU Hao， WANG Yun-bing

（School of Resourse and Environment Science，Henan Institute of Science and Techology，Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： RT-PCR with degenerate primers and RACE were used to amplify partial cDNA fragments and full cDNA，one serine protease gene from Adelphocoris suturalis Jakovlev was identified， designated ASJSP. The full-length cDNAs of ASJSP is 958 bp，this gene contains 885 bp open-reading frames（ORF） which encodes a putative 295 amino acid protein，with a predicted molecular mass of 31.20 kDa and isoeletric point（pI） of 9.38. Its predicted molecular formula is C1 374H2 222N390O407S15. Bioinformatical analysis showed that it is a instability index is 31.94 and the GRAVY 0.114，suggesting that it is a stable hydrophobic protein. Sequences analysis showed that ASJSP had 55.70% identity with complete serine protease genes from other Miridae insects.

Key words：Adelphocoris suturalis Jakovlev；serine proteinase；RT-PCR；sequence analysis

絲氨酸蛋白酶主要消化昆蟲食物中的蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì)，并參與合成與降解昆蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)，是大多數(shù)昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)較為重要的消化酶，其主要包含彈性蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等[1-5]。目前，已有一些關(guān)于半翅目盲蝽科昆蟲的絲氨酸蛋白酶方面報道，研究發(fā)現(xiàn)Lygus rugulipennis和Creontiades dilutus等盲蝽科昆蟲唾液中富含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶類[6-9]，豆莢盲蝽Lygus Hesperus唾液腺內(nèi)的總蛋白酶活性也以胰蛋白酶活性為主[10-12]。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)美國牧草盲蝽取食后，主要依靠其唾液腺內(nèi)的絲氨酸蛋白酶先進行初步消化，之后其他腸道內(nèi)的蛋白酶進一步消化，吸收蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì)，且絲氨酸蛋白酶的活性占其唾液腺內(nèi)總蛋白酶活性的80%。以上研究結(jié)果說明，在半翅目昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)絲氨酸蛋白酶是較重要的消化酶。

中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）為半翅目盲蝽科昆蟲，是中國一種重要的盲蝽類害蟲，廣泛分布于長江流域和黃河流域[14]。中黑盲蝽的寄主植物種類眾多，已報道有100余種，包括棉花等多種作物[15]。20世紀(jì)90年代末，由于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及Bt棉花廣泛種植減少化學(xué)農(nóng)藥的使用等原因，中黑盲蝽種群數(shù)量上升、為害加重，成為中國棉花等作物的主要害蟲[16-19]。由于其食性雜、天敵控制作用弱、寄主廣泛及行動敏捷等特點，在作物大面積生產(chǎn)時增加了一定的防控測報難度。雖然，在一些半翅目盲蝽科植食性昆蟲種類上，針對絲氨酸蛋白酶類消化酶已進行了分子生物學(xué)方面的研究，如豆莢盲蝽Lygus hesperus及美國牧草盲蝽，但是目前關(guān)于中黑盲蝽的研究國內(nèi)鮮見報道。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因的cDNA序列ASJSP，并對其進行初步分析，以期為中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶的分子消化機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源：中黑盲蝽成蟲采自河南省新鄉(xiāng)縣，采回后在實驗室用新鮮四季豆人工飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度條件（26±0.5） ℃，相對濕度60%～70%，光周期16∶8 h（L∶D）。飼養(yǎng)密度為40～60頭/盒，供試所用昆蟲為羽化后的中黑盲蝽成蟲。

1.2 試劑和儀器

主要試劑：RNA提取試劑盒（REeasy Mini Kit）購自QIAGEN公司。cDNA第一鏈合成試劑盒（PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）購自寶生物工程有限公司。膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）購自O(shè)MEGA公司。Marker Ⅱ、Marker Ⅲ購自TIANGEN公司。DEPC購自上海索萊寶科技有限公司。50×TAE緩沖液購自上海雙螺旋生物科技有限公司。其他所用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

儀器：Neofuge 13R型高速臺式冷凍離心機；Tgradient型梯度PCR儀；JY600C型君儀電泳儀和JY-SP-BT型電泳槽；Tanon3500型Tanon凝膠成像系統(tǒng)；SkanIt RE for Multiskan GO 3.2型全波長酶標(biāo)儀；Eppendorf移液槍；PYX-300Q-A型智能光照培養(yǎng)箱；JJ-CJ-1FD型超凈工作臺。

1.3 試驗方法

1.3.1 中黑盲蝽總RNA的提取 將實驗室飼養(yǎng)的中黑盲蝽成蟲置于1.5 mL預(yù)冷的離心管中，加適量液氮研磨至粉末，按照RNA提取試劑盒（REeasy Mini Kit）的具體方法提取中黑盲蝽總RNA。

1.3.2 中間片段的獲取 cDNA的第一鏈合成按試劑盒（PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）說明書進行。PCR反應(yīng)體系包括DEPC-treat water 34.75 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，cDNA 2 μL，Taq酶0.25 μL。PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94 ℃ 3 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸10 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。正向引物序列：5′-TCGTCCAAGCCGACTCAT-3′。反向引物序列：5′-ACGCAGATAGCAGCACA-3′。

1.3.3 全長cDNA的獲取 3′端cDNA擴增：反應(yīng)采用3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen）推薦的方法進行， 以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物5′-GCCTCTTCCATCAACTTCAAC-3′與通用引物UAP配對擴增3′端。PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用上游引物5′-AGAACTCTGACTGTTTGTCCG-3′與下游引物UAP進行第二次PCR，擴增產(chǎn)物回收、測序。

5′端cDNA 擴增：按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Version 2.0）推薦方法進行，以總RNA為模板，用引物5′-CAAGGGTGTATCTGTTG-3′，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下合成cDNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)S.N.A.P純化后進行TdT 加尾。最后，以加尾產(chǎn)物為模板，用引物5′-GGTGGTGTCAAGTTTC

TTTGG-3′與通用引物AAP進行5′端擴增。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的回收與序列測定 PCR擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并保存結(jié)果，切割目的條帶按照凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）的方法回收PCR產(chǎn)物，并于-20 ℃保存回收目的產(chǎn)物。最后，將純化后的PCR產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Blast獲得的全長cDNA序列，使用Clustalx1.8 軟件對這些序列進行比對。采用軟件MEGA4.0進行Kimura雙參數(shù)遺傳距離分析，構(gòu)建NJ進化樹，Bootstrap估算重復(fù)1 000次，檢驗分子系統(tǒng)樹各處的置信度。利用TMPRED軟件（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)；采用ExPASy生物信息學(xué)資源網(wǎng)站的ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析基本理化性質(zhì)及Protscale工具（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析疏水性；使用SignalP工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及測序結(jié)果

通過檢測，提取的中黑盲蝽成蟲RNA的OD260 nm/OD280 nm值為1.926，當(dāng)OD260 nm/OD280 nm>1.8時，說明樣品純度較高，可以滿足后續(xù)試驗的要求。

經(jīng)測序，得到中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶cDNA基因，命名為ASJSP，長度為958 bp，推測其開放閱讀框為885 bp，編碼295個氨基酸，以ATG為起始密碼子，以TAG為終止密碼，結(jié)果如圖1所示。

2.2 序列同源性分析

由圖2可知，中黑盲蝽ASJSP與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的蛋白序列的一致性為55.70%。ASJSP與Creontiades dilutus（登錄號：AAL15154.1）的一致性為84.41%；與綠盲蝽Apolygus lucorum（登錄號：AFX73399.1）的一致性為32.93%；與其他盲蝽科的絲氨酸蛋白酶蛋白序列的一致性均大于31.64%。

2.3 不同目絲氨酸蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)育樹

應(yīng)用MEGA4.0軟件Neighbor Joining（NJ）法對包括ASJSP在內(nèi)的10種不同種類昆蟲的絲氨酸蛋白酶進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建（圖3）。結(jié)果顯示，膜翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶較為分化，位于不同的分支上，可能與該目昆蟲食性的不同及繁多的種有一定關(guān)系。中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶ASJSP先與Creontiades dilutus聚在一起，又跟綠盲蝽Apolygus lucorum聚在一起，說明中黑盲蝽與Creontiades dilutus（登錄號：AAL15154.1）進化關(guān)系最近，與綠盲蝽Apolygus lucorum（登錄號：JQ609682.1）進化關(guān)系次之，與其他7種昆蟲的進化關(guān)系較遠。

2.4 中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基本理化性質(zhì)預(yù)測分析

通過ExPASy生物信息學(xué)資源網(wǎng)站的ProtParam工具推測中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶的基本理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)共包含295個氨基酸，預(yù)測分子式為C1 374H2 222N390O407S15，理論分子量為31.20 kDa，等電點pI為9.38，不穩(wěn)定系數(shù)為31.94，摩爾消光系數(shù)為33 055，總平均親水性系數(shù)為0.114，故推測此蛋白質(zhì)為穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)。使用TMPRED軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其有3個跨膜區(qū)，分別位于第1～20，59～76和198～215位，故推測該蛋白質(zhì)為跨膜蛋白質(zhì)。使用SignalP工具對信號肽進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因ASJSP所編碼的蛋白質(zhì)具有信號肽結(jié)構(gòu)，該信號肽位于1～20位氨基酸殘基處。

3 討論

通過RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了絲氨酸蛋白酶基因的全長cDNA序列ASJSP。通過對比氨基酸序列的同源性，ASJSP與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的一致性為55.70%，與Creontiades dilutus（登錄號：AAL15154.1）的一致性最高，推測獲得的克隆蛋白序列是絲氨酸蛋白酶家族中的一員。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，推測中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因ASJSP所編碼的蛋白質(zhì)是一個疏水蛋白質(zhì)，信號肽的切割位點可能是前20位氨基酸。

研究表明，絲氨酸蛋白酶是昆蟲消化系統(tǒng)中較為重要的蛋白酶。如華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）的絲氨酸蛋白酶HoSP1、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的絲氨酸蛋白酶Ha-TLP及桔小實蠅（Bactroceran）的絲氨酸蛋白酶BdorSer，這些酶在消化系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用[20-22]。綠盲蝽（Apolygus lucorum）取食不同的寄主植物后，其絲氨酸蛋白酶基因AlSP3和AlSP4在不同性別成蟲的體內(nèi)表達量均有明顯差異[23，24]。為深入地探究中黑盲蝽的消化系統(tǒng)中絲氨酸蛋白酶的作用，本研究獲得中黑盲蝽的絲氨酸蛋白酶基因，同時為以后研究中黑盲蝽體內(nèi)的消化代謝提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] RYAN C A. Protease inhibitors in plants：Genes for improving defenses against insects and pathogens[J].Annual Review of Phytopathology，1990，28（1）：425-449.

[2] WOLFSON J L，MURDOCK L L.Diversity in digestive proteinase activity among insects[J].Journal of Chemical Ecology， 1990，16（4）：1089-1102.

[3] JOHNSTON K A，LEE M J，GATEHOUSE J A，et al. The partial purification and characterisation of serine protease activity in midgut of larval Helicoverpa armigera[J].Insect Biochemistry，1991，21（4）：389-397.

[4] CHRISTELLER J T，LAING W A，MARKWICK N P，et al. Midgut protease activities in 12 phytophagous lepidopteran larvae：Dietary and protease inhibitor interactions[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，1992，22（7）：735-746.

[5] COLEBATCH G，COOPER P，EAST P.cDNA cloning of a salivary chymotrypsin-like protease and the identification of six additional cDNAs encoding putative digestive proteases from the green mirid，Creontiades dilutus（Hemiptera：Miridae）[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32（9）：1065-1075.

[6] GOODCHILD A J P.A study of the digestive system of the West African cacao capsid bugs （Hemiptera， Miridae）[C].Proc Zool Soc Lond，1952，122：543-572.

[7] HORI K. Some variations in the activities of salivary amylase and protease of lygus disponsi LINNAVUORI：Hemiptera：Miridae[J].Applied Entomology and Zoology，1970，5（2）：51-61.

[8] COHEN A C. Organization of digestion and preliminary characterization of salivary trypsin-like enzymes in a predaceous heteropteran，Zelus renardii[J].Journal of Insect Physiology，1993， 39（10）：823-829.

[9] COLEBATCH G，EAST P，COOPER P.Preliminary characterisation of digestive proteases of the green mirid，Creontiades dilutus（Hemiptera：Miridae）[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2001，31（4）：415-423.

[10] AGUSTI N，COHEN A C. Lygus hesperus and L. lineolaris （Hemiptera：Miridae），phytophages，zoophages，or omnivores：Evidence of feeding adaptations suggested by the salivary and midgut digestive enzymes[J].Journal of Entomological Science， 2000，35（2）：176-186.

[11] ZENG F，ZHU Y，COHEN A.Partial characterization of trypsin-like protease and molecular cloning of a trypsin-like precursor cDNA in salivary glands of Lygus lineolaris[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2002，131（3）：453-463.

[12] ZENG F，ZHU Y C，COHEN A C.Molecular cloning and partial characterization of a trypsin-like protein in salivary glands of Lygus hesperus（Hemiptera：Miridae）[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32（4）：455-464.

[13] ZHU Y C，ZENG F，OPPERT B. Molecular cloning of trypsin-like cDNAs and comparison of proteinase activities in the salivary glands and gut of the tarnished plant bug Lygus lineolaris（Heteroptera：Miridae）[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2003，33（9）：889-899.

[14] LU Y，WU K，JIANG Y，et al. Mirid bug outbreaks in multiple crops correlated with wide-scale adoption of Bt cotton in China[J]. Science，2010，328（5982）：1151-1154.

[15] 陸宴輝，吳孔明.棉花盲椿象及其防治[M].北京：金盾出版社，2008.

[16] 吳孔明.我國Bt棉花商業(yè)化的環(huán)境影響與風(fēng)險管理策略[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（1）：1-4.

[17] WU K，LI W，F(xiàn)ENG H，et al. Seasonal abundance of the mirids，Lygus lucorum and Adelphocoris spp.（Hemiptera：Miridae） on Bt cotton in northern China[J].Crop Protection，2002， 21（10）：997-1002.

[18] LU Y H，QIU F，F(xiàn)ENG H Q，et al. Species composition and seasonal abundance of pestiferous plant bugs（Hemiptera：Miridae） on Bt cotton in China[J].Crop Protection，2008，27（3）：465-472.

[19] 陸宴輝，梁革梅，吳孔明.棉盲蝽綜合治理研究進展[J].植物保護，2008，33（6）：10-15.

[20] 劉海明，鄭桂玲，李長友，等.華北大黑鰓金龜中腸絲氨酸蛋白酶cDNA克隆，序列分析及表達[J].昆蟲學(xué)報，2012，55（2）：147-155.

[21] SUI Y P，WANG J X，ZHAO X F.The impacts of classical insect hormones on the expression profiles of a new digestive trypsin-like protease（TLP） from the cotton bollworm，Helicoverpa armigera[J].Insect Molecular Biology，2009，18（4）：443-452.

[22] 胡黎明，曾 玲，申建梅，等.桔小實蠅絲氨酸蛋白酶基因（BdorSer）的克隆與表達分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，40（7）：70-76.

[23] 孫 洋，柏立新，張永軍，等.綠盲蝽絲氨酸蛋白酶基因AlSP3 的鑒定及表達譜分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（5）：991-998.

[24] 孫 洋，柏立新，張永軍，等.綠盲蝽絲氨酸蛋白酶基因AlSP4的克隆及取食不同寄主植物后的表達譜分析[J].昆蟲學(xué)報，2012，55（6）：641-650.