食品微生物本科畢業(yè)論文實驗的探索與實踐
——以干酪乳桿菌異源表達膽鹽水解酶為例

熊智強 ， 張 匯， 艾連中

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

大學的首要任務是培養(yǎng)高素質人才，本科畢業(yè)論文作為大學人才培養(yǎng)方案中重要的教學實踐環(huán)節(jié)，具有其他教學環(huán)節(jié)所不能替代的實踐性和綜合性作用[1]。本科畢業(yè)論文是檢驗本科生綜合運用所學專業(yè)知識和專業(yè)基本技能，考察學生分析和解決實際問題能力的一種重要手段[2-3]。通過完成畢業(yè)論文，讓學生能夠綜合運用所學知識，獨立地分析和解決問題，提升其綜合素質，為其順利進入社會奠定基礎。畢業(yè)論文的質量，既是評定學生學業(yè)能力的一個重要指標，又是認定本科畢業(yè)和學士學位資格的一項重要依據[3]。然而，近些年隨著大學嚴重擴招和就業(yè)形勢日益嚴峻，大學本科畢業(yè)論文整體水平呈現逐步下滑趨勢[3]。因此，提高本科畢業(yè)論文水平對提升大學生綜合素質具有顯著的意義。由于食品微生物是一門與農業(yè)和加工業(yè)聯系緊密的學科，其畢業(yè)論文一般是在通過一系列實驗獲得實驗數據的基礎上，完成數據分析、論文撰寫和最終通過論文答辯[4]。上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院對本科畢業(yè)論文教學過程中，以“上海食品微生物工程研究中心”為載體，一直以功能性乳酸菌的篩選及其分子生物學為重要研究方向，對本科生畢業(yè)論文指導工作進行探索和實踐。本文以“干酪乳桿菌異源表達膽鹽水解酶”畢業(yè)論文為例，將有關的試驗步驟和指導經驗進行介紹，以期為食品微生物學科本科生畢業(yè)論文的指導工作提供參考。

1 論文選題

本科畢業(yè)論文安排在本科最后一個學期進行，但經常與畢業(yè)生就業(yè)、考研和公務員面試等關鍵節(jié)點相沖突[5]。為避免對學生就業(yè)的沖擊和教師指導過于集中，食品微生物方向的指導教師會將畢業(yè)論文啟動工作提前至第六學期末，使指導的學生從大三學期結束的假期開始有較長的時間來完成選題、查閱文獻、實驗設計和實施等畢業(yè)論文工作。畢業(yè)論文質量好壞關鍵在選題[6]，尤其是論文創(chuàng)新性。根據指導教師承擔的科研項目和學生的科研興趣，結合上海食品微生物工程研究中心的研究方向及實驗條件，選定“干酪乳桿菌異源表達膽鹽水解酶”為論文題目。

干酪乳桿菌是一種具有調節(jié)人體腸道菌群、促進消化吸收和增強人體免疫力等多種保健功能的重要益生乳酸菌[7]，廣泛應用在發(fā)酵乳等食品工業(yè)生產中。例如，干酪乳桿菌LC2W是天然發(fā)酵食品中篩選的具有降血壓功能的益生乳酸菌[8-9]，該菌株已經獲得中國和歐洲發(fā)明專利授權，并已在光明乳業(yè)股份有限公司產業(yè)化應用，用于生產酸奶等發(fā)酵乳產品[8-13]。對干酪乳桿菌基因組分析發(fā)現[13]，基因組中并不存在膽鹽水解酶基因(負責水解結合膽鹽形成游離膽汁酸和氨基酸，使游離膽汁酸與膽固醇形成復合物沉淀，從而減少膽固醇含量)，造成其對膽鹽的耐受性不強。因此，在干酪乳桿菌中異源表達植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶，可顯著提高干酪乳桿菌的膽鹽耐受性，對開發(fā)降低膽固醇的干酪乳桿菌產品提供參考。

2 實驗準備

在實驗準備階段，指導教師應對學生進行理論知識、實驗操作和儀器使用等方面集中指導，使學生在實驗過程中盡可能減少不必要的錯誤。實驗準備包括方案設計、試驗材料和試劑準備等方面。指導教師將整個課題的前期工作和論文目標對學生進行介紹，讓學生結合畢業(yè)論文實驗內容進行文獻查閱，了解研究背景和最新國內外研究進展，掌握干酪乳桿菌分子生物學和膽鹽水解酶蛋白表達的研究情況，同時學習食品微生物厭氧培養(yǎng)和乳酸菌分子生物學基本實驗操作。學生結合上述已掌握的相關知識，設計可行性的實驗方案，并與指導教師進行方案討論，最終確定實驗方案和撰寫開題報告。學生根據自己的實驗設計，在指導教師協助下采購或采集實驗所需的試劑、耗材或實驗所需樣本。

3 實驗研究

實驗研究是畢業(yè)論文的核心階段[1-2，6]。在此階段要培養(yǎng)學生的動手能力和科研思維能力，使學生能夠具備分析和解決科研問題的能力。在實驗過程中，要求學生態(tài)度嚴謹，嚴格完成實驗設計，仔細觀察實驗現象，詳實記錄實驗結果，每周進行實驗總結，向指導教師匯報實驗進展。指導教師幫助學生對實驗結果進行分析，確定實驗是否達到預期設計，實驗方案是否需要進行調整。為方便學生實驗研究，上海食品微生物工程研究中心實行開放式管理，每天早8:30至晚10:00對學生開放，學生可以根據自己的時間預約儀器和安排實驗。

3.1 產膽鹽水解酶菌株的平板定性篩選

學生通過文獻查閱不難發(fā)現，很多種乳酸菌都含有膽鹽水解酶，但活性各異。由于文獻中酶活定義各不相同，很難比較出活性較高的膽鹽水解酶。為了克隆高活性的膽鹽水解酶基因，實驗方案采用平板篩選法[14-15]，從實驗室現有的乳酸菌中篩選高膽鹽降解活性的菌株，從中進行膽鹽水解酶基因克隆。通過平板篩選法對實驗室保藏的乳酸菌菌種庫進行快速定性膽鹽水解酶篩選，發(fā)現5株植物乳桿菌能在含有5 mmol/L甘氨膽酸鈉鹽的MRS固體培養(yǎng)基上生長，其中3株植物乳桿菌有白色沉淀圈，說明這3株菌產膽鹽水解酶有較好的活性。特別是植物乳桿菌AR113的白色沉淀圈最大，說明其膽鹽水解酶酶活最強。通過這樣簡單的平板篩選法，快速地篩選出高活性的膽鹽水解酶，避免了盲目克隆和表達出乳酸菌中低活性膽鹽水解酶，大大地降低了實驗失敗風險。

3.2 膽鹽水解酶表達重組質粒的構建

學生在進行本部分實驗前，首先經過指導教師的分子生物學實驗操作系統(tǒng)培訓，使學生較為熟練的掌握乳酸菌基因組DNA 提取、PCR技術克隆目的基因、PCR產物回收、酶切和連接、重組質粒的構建和驗證等實驗操作技能。所以，學生在進行植物乳桿菌基因組DNA提取和PCR克隆植物乳桿菌來源膽鹽水解酶基因的實驗過程較為順利，經瓊脂糖電泳跑膠，發(fā)現DNA條帶單一。同時Nanodrop儀器檢測也顯示，DNA質量較高，可以滿足后期試驗需要。利用PCR清潔回收試劑盒回收克隆的膽鹽水解酶DNA片段，通過酶切和連接等分子生物學實驗操作，最終順利構建出表達植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶重組乳酸菌質粒。

3.3 膽鹽水解酶在干酪乳桿菌中表達

目前蛋白表達最常用的原核宿主是大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌，乳酸菌并不是表達蛋白的通用宿主，蛋白表達量不高。此外，蛋白表達選用誘導型啟動子表達方式最為常見，蛋白表達量較高，但在乳酸菌中誘導型表達方式對蛋白表達效果不能確定。為避免在乳酸菌中可能出現表達目的蛋白含量太低的情況，在實驗設計時就選用了強的組成型啟動子來對膽鹽水解酶進行蛋白表達。另外，通過增加膽鹽水解酶的基因拷貝數，可進一步增加蛋白表達。將膽鹽水解酶重組質粒導入干酪乳桿菌中，聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白檢測，成功觀察到目的蛋白的表達。通過高效液相色譜檢測，重組的膽鹽水解酶具有一定的降膽鹽能力，能較好的降解甘氨類膽鹽，其中降解甘氨脫氧膽酸最強，甘氨膽酸其次，甘氨鵝脫氧膽酸的降解能力較弱。通過上述實驗充分表明，植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶在干酪乳桿菌中得到了活性蛋白表達。

4 實驗準備

學生按上述實驗方案將全部實驗完成后，與指導教師一起確定論文撰寫大綱。按照擬定的大綱和學院相關要求完成論文初稿撰寫，并交由指導教師修改。指導教師對論文條理、數據分析、結果與討論等部分對學生做出指導，修改后返回給學生繼續(xù)修改，如此反復多次直至定稿。學院同行專家和老師對定稿的畢業(yè)論文給出評閱意見，將意見返還學生修改。指導教師對再修改的論文進行審閱，給學生對畢業(yè)論文答辯提供建設性意見，使學生順利通過畢業(yè)論文答辯。

5 小 結

畢業(yè)論文作為本科人才培養(yǎng)過程中一個重要的環(huán)節(jié)，是全面考核學生綜合素質的有效方式[6]。通過論文選題、實驗方案設計和實驗研究等環(huán)節(jié)對食品專業(yè)學生進行食品微生物畢業(yè)論文指導和訓練，使學生在畢業(yè)階段極大地提高了對科研工作的興趣，鍛煉了學生的動手能力、科研思維能力和團隊協作精神。按照上述本科畢業(yè)論文指導模式，學生初步掌握如何解決科學問題的方法和步驟，如何檢索和查閱相關文獻，如何組織和實施實驗，如何用軟件處理實驗數據和實驗圖片，如何分析實驗結果和數據，如何撰寫畢業(yè)論文等能力。

以“干酪乳桿菌異源表達膽鹽水解酶”作為學生畢業(yè)論文題目，課題涉及到食品科學、微生物學、分子生物學等多個學科的理論與實驗技能，要求學生在有限的時間內獨立完成該畢業(yè)論文，這種自主性設計畢業(yè)論文能夠較為全面地多層次考察學生的自我學習、分析問題、解決問題和動手能力。學生最終能夠在有限的時間內高質量地完成實驗，并順利通過畢業(yè)論文答辯。畢業(yè)論文實驗結果目前已被國外乳品頂級刊物Journal of Dairy Science接收，間接說明畢業(yè)論文題目選題恰當、立意新穎、具有較好的科學前沿性和創(chuàng)新性。學生實驗構建異源表達植物乳桿菌來源膽鹽水解酶的干酪乳桿菌工程菌，顯著提高干酪乳桿菌的膽鹽水解酶活性，具有潛在的應用價值和理論指導意義，為開發(fā)降低膽固醇的干酪乳桿菌發(fā)酵乳產品奠定基礎。

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