替加環(huán)素與5種抗生素對多重耐藥鮑曼不動桿菌體外聯(lián)合藥敏實驗的研究

張肖冰, 楊事達， 姚志成, 單風平

(1.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 免疫學教研室，遼寧 沈陽 110122；2.遼寧省人民醫(yī)院 檢驗科，遼寧 沈陽 110015;3.遼寧省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110015)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanii,ABA) 是一種革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界水及土壤、醫(yī)院及人體皮膚表面、呼吸道、消化道和泌尿生殖道。鮑曼不動桿菌作為一種條件致病菌，當機體免疫力低下或免疫功能缺陷時會引起感染，如呼吸道系統(tǒng)感染、手術(shù)切口感染、敗血癥、獲得性肺炎、傷口感染、泌尿生殖道感染和繼發(fā)性腦膜炎等[1-3]。鮑曼不動桿菌的耐藥機制較為復(fù)雜，但主要以外排泵的方式為主[4-6],這使得多重耐藥菌株或泛耐藥株的大量出現(xiàn)，因此臨床醫(yī)生選擇藥物比較困難，成為臨床治療的一大難題[7]。通過比較2005至2014年的CHINET不動桿菌屬耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)表明[8]，我國不同地區(qū)19家醫(yī)院2005年從臨床分離的鮑曼不動桿菌共2 016株，2013年則達到頂峰9 024株。鮑曼不動桿菌對各種抗生素的敏感性逐年減低，多重耐藥鮑曼不動桿菌(multidrug-resistantA.baumannii, MDR-ABA)和泛耐藥的鮑曼不動桿菌(extremely-drug resistantA.baumannii)占比逐年增加，2014年基本都達到了45%以上。從患者分布來看，ICU患者分離出的鮑曼不動桿菌的耐藥率較高，一般均在75%以上。這可能與ICU患者免疫力較差，且長期大量使用廣譜抗生素有關(guān)。因此也有學者將多重耐藥的鮑曼不動桿菌形象地稱為21世紀革蘭陰性桿菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)[9]。2012年《中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》中提出對于泛耐藥鮑曼不動桿菌的治療提倡聯(lián)合用藥[10]。替加環(huán)素為甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物的第一個品種，對多重耐藥的鮑曼不動桿菌有著較高的敏感性。但由于其在人體組織分布廣泛，因此血藥濃度、腦脊液藥物濃度較低，需與其他抗菌藥物聯(lián)用較好[11]。因此本研究通過對替加環(huán)素與亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素5種臨床常用于鮑曼不動桿菌治療的抗生素單藥及兩藥聯(lián)用的體外活性藥敏的實驗研究，以期發(fā)現(xiàn)較好的聯(lián)合用藥方案，為臨床合理使用抗生素提供用藥參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2015年3月至2016年10月由遼寧省人民醫(yī)院微生物室從臨床分離出的鮑曼不動桿菌260株，經(jīng)過紙片擴散法測試，將對3個及以上種類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌列入實驗菌株，共計50株(痰標本26株，血標本8株，膿標本4株，尿液標本3株，膽汁標本3株，穿刺液標本2株，透析液標本2株，腹水標本1株，創(chuàng)口分泌物標本1株)；標準質(zhì)控菌株：ATCC35218、ATCC25922均由遼寧省人民醫(yī)院微生物室提供。

1.1.2 儀器及試劑 VITEK-2 compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)，比濁儀(法國梅里埃公司)；藥敏紙片：哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素的藥敏紙片(Oxoid賽默飛世爾科技有限公司)、替加環(huán)素(輝瑞制藥有限公司)、硫酸慶大霉素注射液(河南潤弘制藥股份有限公司)、頭孢曲松鈉(上海羅氏制藥有限公司)、鹽酸左氧氟沙星(揚子江藥業(yè)集團有限公司)、頭孢哌酮舒巴坦(輝瑞制藥有限公司)、亞胺培南西司他丁鈉(杭州默沙東制藥有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 哥倫比亞血瓊脂平板(法國梅里埃公司)、Muller-Hinton(MH平板)(天津金章科技發(fā)展有限公司)、Muller-Hinton鈣離子調(diào)節(jié)肉湯干粉(Oxoid賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 鮑曼不動桿菌的判定 選取臨床標本分離出的細菌，經(jīng)哥倫比亞血平板或麥康凱平板培養(yǎng)18～24 h后，Vitek 2 compact全自動分析儀鑒定，確認為鮑曼不動桿菌后放入脫脂牛奶中于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 紙片擴散藥敏法 取菌落配置0.5麥氏濁度的菌懸液,用棉簽涂布于MH平板，室溫靜置3～5 min，用紙片分配器將抗生素藥片貼于平板表面，將其貼平后置于5%的CO2培養(yǎng)箱中18～24 h后，準確測量抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI M100的最新標準判定結(jié)果。

1.2.3 多重耐藥鮑曼不動桿菌的判定 將對青霉素類、頭孢類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類中的3類或3類以上抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌劃歸為多重耐藥的鮑曼不動桿菌。

1.2.4 微量肉湯稀釋法 從-80 ℃冰箱中取出已經(jīng)配置好的抗生素各一支，待室溫溶解后將其置于振蕩器混勻，并配置成相應(yīng)濃度的抗生素應(yīng)用液，其中：替加環(huán)素、亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素的第一孔稀釋濃度分別為128、1 024、1 024、1 024、 1 024、4 096 μg/mL。根據(jù)不同的抗生素選取不同的稀釋液機制，將抗生素做倍比稀釋以作備用。分別加入96孔聚苯乙烯板孔中，其中第1～11孔加入抗生素，每孔100 μL，第12孔加入100 μL的肉湯，為生長對照。將濃度為106cfu/mL的菌懸液加入第1孔至第12孔中，每個實驗菌株為一排，使得最終的每孔細菌數(shù)為5×105cfu/mL。此時，每孔中含200 μL的實驗液體，抗生素與菌懸液各100 μL。將加好的96孔聚苯乙烯板放入37 ℃孵育箱中孵育18～24h后觀察結(jié)果，每行以肉眼可見的不生長鮑曼不動桿菌的實驗孔的抗生素濃度作為該抗生素的最小抑菌濃度值，并分別記錄。

1.2.5 聯(lián)合藥敏實驗 棋盤法設(shè)計：縱向(A～H)加入替加環(huán)素的降梯度方向，橫向(1～12)分別加入5種抗生素。每孔分別加入2種聯(lián)合用藥的抗生素各50 μL后再加入濃度為5×105cfu/mL的菌懸液100 μL，震蕩混勻后，將96孔板放入孵育箱中，培養(yǎng)18～24 h后觀察5種抗生素與替加環(huán)素兩兩應(yīng)用后的MIC替加環(huán)素和MIC5種抗生素。

1.2.6 FIC指數(shù)計算與判讀 FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。FIC指數(shù)判讀標準：當FIC指數(shù)<0.5時，兩種藥為協(xié)同作用;當FIC指數(shù)=0.5～1時，兩種藥為相加作用;當12時，兩種藥為拮抗作用。

1.2.7 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS軟件，采用配對T檢驗和幾何均數(shù)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重耐藥鮑曼不動桿菌的檢出率

經(jīng)過紙片擴散法復(fù)核后，多重耐藥鮑曼不動桿菌的檢出率為86.2%(50/58)。

2.2 50株多重耐藥鮑曼不動桿菌藥敏耐藥性分析

由表1可以看出，50株鮑曼不動菌對14種臨床常用治療鮑曼不動桿菌的抗生素耐藥性均達到80%以上，其中對阿米卡星(14%)、復(fù)方新諾明(14%)、四環(huán)素(14%)、亞胺培南(12%)敏感性較高，但也不十分理想；耐藥性中，頭孢哌酮-舒巴坦(80%)、阿米卡星(84%)、復(fù)方新諾明(84%)相對較低，頭孢哌酮-舒巴坦中介率最高(18%)，見表1。

表1 50株MDR-ABA的K-B法藥敏實驗結(jié)果

2.3 替加環(huán)素與5種抗生素分別應(yīng)用的MIC數(shù)據(jù)分析

替加環(huán)素在與亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢曲松、左氧氟沙星聯(lián)用后，MIC50、MIC90、MICG均為下降趨勢，而與慶大霉素聯(lián)用后MIC50、MIC90、MICG均為上升趨勢，且替加環(huán)素與5種抗生素的單用MIC和聯(lián)用MIC比較，均有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 替加環(huán)素與亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素單用和聯(lián)合應(yīng)用對MDR-ABA(n=50)的MIC50、MIC90、MICGTable 2 The MIC50，MIC90，MICG of Tigecycline and Imipenem, cefoperazone sulbactam, ceftriaxone, levofloxacin, gentamicin alone and in combination with MDR-ABA (n=50)

注： TGC：替加環(huán)素；IPM：亞胺培南；SCF：頭孢哌酮舒巴坦；CRO：頭孢曲松；LEV：左氧氟沙星；CN：慶大霉素

2.4 替加環(huán)素與5種抗生素的抑菌百分率曲線分析

由圖1可知，亞胺培南(圖1A)、頭孢哌酮舒巴坦(圖1B)、頭孢曲松(圖1C)、左氧氟沙星(圖1D)在與替加環(huán)素聯(lián)用后，濃度累積抑菌曲線均向左側(cè)移動，說明更低的藥物濃度能夠達到相同的抑菌效果，但慶大霉素(圖1E)與替加環(huán)素聯(lián)用后濃度累積抑菌曲線均向右側(cè)移動，說明為了達到相同的抑菌效果，需要更高的藥物濃度。

圖1 替加環(huán)素與5種抗生素對MDR-ABA抑菌百分率曲線(n=50)Fig.1 The concentration cumulative percentage inhibition curves of tigecycline and 5 antibiotics alone and in combination on MDR-ABA (n=50)A:替加環(huán)素與亞胺培南；B：替加環(huán)素與頭孢哌酮舒巴坦；C：替加環(huán)素與頭孢曲松；D：替加環(huán)素與左氧氟沙星；E：替加環(huán)素與慶大霉素;下圖同A: tigecycline and imipenem; B: tigecycline and cefoperazone sulbactam; C: tigecycline and ceftriaxone; D: tigecycline and levofloxacin; E：tigecycline and gentamicin;same the follow

2.5 替加環(huán)素與與5種抗生素的FIC指數(shù)分布分析

亞胺培南(圖2A)、頭孢哌酮舒巴坦(圖2B)、頭孢曲松(圖2C)、左氧氟沙星(圖2D)在與替加環(huán)素聯(lián)用后，F(xiàn)IC指數(shù)的分布大部分在0.5～1之間，說明這4種抗生素與替加環(huán)素具有協(xié)同或相加的作用。但是慶大霉素(圖2E)與替加環(huán)素聯(lián)用后FIC指數(shù)的分布均在2以上，說明慶大霉素與替加環(huán)素之間的作用為拮抗作用(見圖2)。

3 討 論

替加環(huán)素具有廣譜的抗菌型、對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等均有很好的抗菌效果[12]，是目前面對多重耐藥鮑曼不動桿菌治療時的“最后手段”。但根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，有些醫(yī)院的鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥率甚至達到了50%以上，遼寧省人民醫(yī)院的這一數(shù)據(jù)也達到30%以上。這可能與體外敏感實驗的操作不當有關(guān)，如替加環(huán)素紙片的保存及M-H平板是否為新鮮配制等[13]。本研究嚴格遵照2009年王輝等[13]發(fā)布的新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素的體外藥敏試驗操作規(guī)程操作，在進行肉湯稀釋法測試MIC值時，嚴格保證肉湯為新鮮配制[14-15]，結(jié)果替加環(huán)素的耐藥結(jié)果由之前用紙片檢測的30%耐藥率下降至2%中介，無耐藥菌株?？梢娞婕迎h(huán)素對遼寧省人民醫(yī)院分離的鮑曼不動桿菌仍具有較好的抗菌效果。但近年來隨著抗菌素的大量使用，替加環(huán)素的耐藥率也有上升趨勢[16]。因此合理地與其他抗生素聯(lián)合使用，減少替加環(huán)素的使用量但卻達到同樣的效果，從而減少替加環(huán)素耐藥情況的發(fā)生就成了目前臨床醫(yī)生的共識。2012年，我國發(fā)布了多重耐藥鮑曼不動桿菌的治療準則，其中也提到建議采取聯(lián)合用藥的方式。

臨床如何制定用藥方案，很大程度上取決于細菌的體外敏感實驗。而如何制定聯(lián)合用藥方案，臨床醫(yī)生可能更多地是依靠經(jīng)驗，但是FIC指數(shù)給臨床醫(yī)生提供了一個合理選擇抗生素聯(lián)合應(yīng)用的數(shù)據(jù)支撐，使得臨床醫(yī)生可以選擇FIC數(shù)值較低，即兩者之間存在協(xié)同或相加的藥物來對患者進行治療。本研究選取臨床常用的幾大類抗生素，并在其中選取了有代表性的亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、左氧氟沙星、頭孢曲松和慶大霉素。結(jié)果顯示，替加環(huán)素、亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、左氧氟沙星、頭孢曲松這4種抗生素均對替加環(huán)素表現(xiàn)出較好的協(xié)同和相加作用，但是慶大霉素與替加環(huán)素聯(lián)合使用后顯示出拮抗作用，這可能與兩藥均與核糖體30S亞基結(jié)合，造成作用位點過于相近有關(guān)。但是對于其他的氨基糖苷類藥物在與替加環(huán)素聯(lián)合使用時，是否也會產(chǎn)生拮抗作用，本文并未討論。

綜上，在臨床選擇治療藥物時可以根據(jù)體外藥敏實驗，制定用藥方案，并結(jié)合其他抗生素的MIC結(jié)果，合理地選擇抗生素與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用，達到更好地抗菌效果且減少替加環(huán)素的使用，從而降低替加環(huán)素耐藥情況的發(fā)生，并且對減少藥物的不良反應(yīng)有很大的幫助。

[1] Peleg A Y, Seifert H, Paterson A D L.Acinetobacterbaumannii: emergence of a successful pathogen[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2008, 21(3):538-582.

[2] Munozprice L S, Weinstein R A.Acinetobacterinfection[J]. New England Journal of Medicine, 2008, 358(26):2846-2847.

[3] 李顯志, 凌保東. 2006年細菌對抗菌藥物耐藥機制研究進展回顧[J]. 中國抗生素雜志, 2007, 32(4):193-202.

[4] Ughachukwu P, Unekwe P. Efflux pump-mediated resistance in chemotherapy[J]. Annals of Medical & Health Sciences Research, 2012, 2(2):191-198.

[5] Amaral L, Martins A. Efflux pumps of Gram-negative bacteria: what they do, how they do it, with what and how to deal with them[J]. Frontiers in pharmacology,2014, 4:168.

[6] Calgin M K, Sahin F, Turegun B, et al. Expression analysis of efflux pump genes among drug-susceptible and multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates and reference strains[J].Diagnostic Microbiology & infectious Disease, 2013, 76(3):291-297.

[7] Gootz T D, Marra A.Acinetobacterbaumannii: an emerging multidrug-resistant threat[J]. Expert review of anti-infective therapy, 2008, 6(3):309-325.

[8] 張輝, 張小江, 徐英春,等. 2005-2014年CHINET不動桿菌屬細菌耐藥性監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志, 2016, 16(4):429-436.

[9] 俞云松. 多藥耐藥鮑曼不動桿菌——21世紀革蘭陰性菌的“MRSA”[J]. 中華臨床感染病雜志, 2009, 2(2):65-68.

[10] 陳佰義, 何禮賢, 胡必杰,等. 中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2012, 92(2):3-8.

[11] Waites K B, Duffy L B, Dowzicky A M J. Antimicrobial susceptibility among pathogens collected from hospitalized patients in the United States and in vitro activity of tigecycline, a new glycylcycline antimicrobial[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2006, 50(10):3479-3484.

[12] Doan T L, Fung H B, Mehta D, et al. Tigecycline: a glycylcycline antimicrobial agent[J]. Clinical Therapeutics, 2006, 28(8):1079-1106.

[13] 王輝, 倪語星, 陳民鈞,等. 新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素的體外藥敏試驗操作規(guī)程[J]. 中華檢驗醫(yī)學雜志, 2009, 32(11):1208-1213.

[14] Petersen P J, Bradford P A. Effect of Medium Age and Supplementation with the Biocatalytic Oxygen-Reducing Reagent Oxyrase on In Vitro Activities of Tigecycline against Recent Clinical Isolates[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2005, 49(9):3910-3918.

[15] Jones R N, Ferraro M J, Reller L B, et al. Multicenter Studies of Tigecycline Disk Diffusion Susceptibility Results forAcinetobacterspp.[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2007, 45(1):227.

[16] 周秀珍, 劉建華, 王艷玲,等. 鮑曼不動桿菌連續(xù)12年的感染分布及耐藥性動態(tài)變遷[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2011, 27(10):755-758.