整合型HIV DNA熒光定量檢測法的臨床初探

張敏 王前英 李昕 胡蕓文 施碧勝

201508 上海市公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科(張敏、王前英、李昕、胡蕓文)；科學(xué)研究部(施碧勝)

HIV感染者目前多采取高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，該方案可快速降低患者體內(nèi)病毒載量，但不能徹底清除病毒，主要原因在于病毒潛伏庫的存在[1-2]。一旦停止用藥，潛伏庫的病毒將會(huì)再次復(fù)制擴(kuò)增，導(dǎo)致體內(nèi)病毒載量迅速反彈[3]。目前針對(duì)于潛伏庫清除的干預(yù)治療也即針對(duì)于潛伏庫的清除，如基因修飾技術(shù)、基因打靶技術(shù)等，但如何評(píng)價(jià)這些干預(yù)措施的有效性便成為臨床檢測急需解決的問題[4-5]。潛伏庫中整合型HIV DNA是主要的存在形式，本實(shí)驗(yàn)建立外周血單核細(xì)胞整合型HIV DNA熒光定量ALu-PCR的檢測方法，以期為臨床藥物的效果評(píng)價(jià)和完全治愈提供一定的判定依據(jù)[6]。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象與樣本來源選擇2015年至2016年在上海市公共衛(wèi)生臨床中心就診的HIV患者30例。其中病毒載量<20IU/ml的患者10例，耐藥患者10例，初診患者10例。排除乙肝、丙肝共感染病例。抽取患者靜脈血，EDTA抗凝血5 ml。采用Qiagen Whole Blood Kit(德國Qiagen公司)提取樣本基因組。羅氏的Cobas AmpliPrep/ Taqman480測定HIV的病毒載量。用ABI7500和GeneAmp PCR system 9700(美國Applied Biosystem公司)進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)研究對(duì)象均已告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書。并通過上海公共衛(wèi)生臨檢中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備(1)ACH2細(xì)胞系A(chǔ)CH2細(xì)胞培養(yǎng)后收集細(xì)胞，提取基因組。用無菌TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH=8.0)1∶5進(jìn)行梯度稀釋，共8個(gè)梯度。(2)CD3標(biāo)準(zhǔn)品：使用HCD3OUT5(ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG)和HCD3OUT3(CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT)為引物，健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化產(chǎn)物后克隆至pMD19T載體中。提取質(zhì)粒，Nanodrop 1 000測定其濃度，計(jì)算CD3拷貝數(shù)。

1.3分離患者白細(xì)胞并提取基因組將患者EDTA抗凝血5 ml樣本1 100×g離心10 min，吸取白細(xì)胞層至一新的離心管，加2 ml生理鹽水并顛倒混勻，1 100×g 離心10 min，棄上清，即得到白細(xì)胞。對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行基因組提取。

1.4預(yù)擴(kuò)增樣本及ACH2基因組基因組模板1 μl。25 μl 的反應(yīng)體系，引物ULF1(ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TDG TTA GAC)150 nmol/L，引物ALu1(TCC CAG CTA CTG GGG AGG CTG AGG)及引物ALu2(GCC TCC CAA AGT GCT GGG ATT ACA G)各300 nmol/L，2.5U TaKaRa La Taq 長片段PCR擴(kuò)增酶，1X擴(kuò)增酶反應(yīng)液(含Mg2+)。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃8 min； 95 ℃ 1 min，55℃1 min，72 ℃ 10 min，共12個(gè)反應(yīng)循環(huán)；72℃15 min。

1.5熒光定量PCR(1)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物0.5 μl作為模板，進(jìn)行整合型HIV DNA熒光PCR。20 μl 的反應(yīng)體系。引物L(fēng)ambda T(ATG CCA CGT AAG CGA AAC T)300 nmol/L，UR2(CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC)300 nmol/L,探針HIV TaqMan(LC640-CAC TCA AGG CAA GCT TTA TTG AGG C-BBQ)50 nmol/L, TakaRa probe qPCR mix。(2)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物0.5 μl作為模板，使用1∶5梯度稀釋后的pMD19T-CD3質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行CD3熒光PCR。反應(yīng)體系為20 μl。引物CD3IN5(GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T)和CD3IN3(CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A)各300 nmol/L，CD3 Taqman(LC640-AGC AGA GAA CAG TTA AGA GCC TCC AT-BBQ)100 nmol/L，TaKaRa probe qPCR mix。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s共40個(gè)反應(yīng)循環(huán)，在60 ℃退火/延伸步驟收集熒光信號(hào)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法GraphPad Prism 5軟件，進(jìn)行線性回歸分析，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 3組患者的CD3細(xì)胞數(shù)及對(duì)應(yīng)的Ct值

表2 3組患者的整合型HIV DNA拷貝數(shù)及對(duì)應(yīng)的Ct值

2.2樣本及ACH2的細(xì)胞數(shù)pMD19T-CD3質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，以Ct作為縱坐標(biāo)、log10拷貝作為橫坐標(biāo)。計(jì)算所得回歸曲線的方程為y=-2.731x+43.01(R2=0.953)。由于每個(gè)細(xì)胞中含有2個(gè)CD3基因，因此根據(jù)此方程計(jì)算可得

到3組患者的CD3細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如表1所示：

2.3樣本中整合型HIVDNA的拷貝數(shù)根據(jù)上述結(jié)果得到的ACH2細(xì)胞數(shù)即為HIV-1拷貝數(shù)為4.271×104，使用1∶5梯度稀釋后的ACH2基因組作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，以Ct作為縱坐標(biāo)、log10拷貝作為橫坐標(biāo)。計(jì)算得回歸曲線的方程為y=-3.146x+39.11(R2=0.968)。根據(jù)不同患者的Ct值，計(jì)算樣本的整合型HIV DNA。結(jié)果如表2所示：

2.4單位細(xì)胞中整合型HIV-DNA的拷貝數(shù)根據(jù)上述結(jié)果，用樣本整合型 HIV-DNA的拷貝數(shù)/樣本CD3拷貝數(shù)，即得到單位細(xì)胞中的HIV-1整合拷貝數(shù)，結(jié)果如圖1所示。將病毒載量<20IU/ml的患者、耐藥患者和初診患者分別定義為A、B、C組，通過各組兩t檢驗(yàn)的比較，可知各組間差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

圖1 3組患者單位細(xì)胞中整合型HIV-DNA拷貝數(shù)Fig.1 Copies of integrated HIV DNA per cell in three groups

3 討論

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active anti-retroviral therapy,HAART)自應(yīng)用以來，降低了患者體內(nèi)的HIV病毒載量水平，然而卻不能徹底清除患者體內(nèi)的病毒，其主要原因在于病毒潛伏庫的存在。病毒潛伏庫在疾病的急性期即病毒感染后幾天內(nèi)產(chǎn)生，同時(shí)在病毒活躍復(fù)制的過程中不斷產(chǎn)生。已知含有整合HIV DNA的靜止性CD4+T細(xì)胞是最主要的 HIV潛伏庫。因此，研究整合型HIV對(duì)于探討HIV的致病機(jī)制及最終清除病毒具有重要的意義[7]。

Alu-PCR是目前常用的檢測整合型HIV DNA的實(shí)驗(yàn)方法。Alu序列是人類特有的，在基因組中廣泛分布并高度保守的間隔重復(fù)序列，平均間隔4 000 bp。根據(jù) Alu序列和HIV基因組中的相對(duì)保守序列分別設(shè)計(jì)引物，可得到整合型HIV基因。本實(shí)驗(yàn)先構(gòu)建了ACH2細(xì)胞系，使每個(gè)細(xì)胞含有一個(gè)HIV基因組。

本研究建立的該方法與基于體外培養(yǎng)的潛伏庫測定技術(shù)相比，簡便、快速，成本較低比較適合臨床標(biāo)本的檢測，作為一種監(jiān)測和評(píng)估手段，檢測病毒潛伏庫的大小，可以初步判定臨床藥物的效果。同時(shí)也為新的干預(yù)治療方法提供了一種評(píng)估依據(jù)。尤其對(duì)病毒載量低拷貝的標(biāo)本更具有檢測意義，為HIV早期感染的診斷也提供了一定的參考依據(jù)。然而目前關(guān)于潛伏庫的定量檢測研究主要集中在外周血，研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及淋巴組織中HIV也保持著低水平的復(fù)制[10]，因此要精確定量HIV潛伏庫的大小，仍需要在HIV潛伏庫的形成機(jī)制及調(diào)控方面做更進(jìn)一步的深入探討。

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