基因1型慢性丙型肝炎血清MicroRNA-122 的表達與干擾素應答的相關性研究

李劍萍 潘能浪 謝志偉 楊可立 關玉娟 唐小平

510060 廣州市第八人民醫(yī)院肝病科

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染引起的丙型肝炎仍是嚴重危害人民健康的重要疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球丙型肝炎病毒感染率約為3%，估計有1.7億人感染HCV。HCV感染后55%～85%的患者發(fā)展為慢性感染；在HCV感染后20年，一般人群肝硬化發(fā)生率為5%～15%[1]；一旦發(fā)展為失代償期肝硬化，10年的生存率僅為25%[2]。直接抗病毒(Direct-acting antiviral，DAA)藥物已在國外廣泛應用，并取得了很好的抗丙肝病毒療效，但目前國內(nèi)小分子藥物尚未上市，聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療仍是目前國內(nèi)的抗丙型肝炎病毒感染的標準療法；在目前的標準治療方案下，丙型肝炎1/4基因型患者的SVR率為40%～54%，而2/3基因型患者可獲得65%～82%的SVR[3-4]，文獻報道其治療效果受宿主及病毒因素影響，如患者的年齡、體重、感染時間、HCV RNA水平、HCV基因型及IL28B基因多態(tài)性[5-6]。并且研究發(fā)現(xiàn)miR-122表達水平[7]、IL28B基因多態(tài)性和HCV準種[8]與個體干擾素療效密切相關。

MicroRNA (miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為 22 個核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子， 它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控。 miR-122 是在肝臟特異高表達的一種 microRNA，占肝臟 miRNAs70%，在整個肝臟發(fā)育過程中有著非常重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。miR-122 是目前通過實驗確認的第一個與 HCV 復制有關的microRNA[11]。國內(nèi)李蘇娟[12]研究表明在細胞感染模型中 miR-122 不但促進 HCV 的復制， 而且 miR-122 的表達可部分中和 IFN-a 的抗 HCV 效應。 而靜默 miR-122 的表達可通過調(diào)節(jié) SOCS3(Suppressor of cytokine signaling，細胞因子信號轉(zhuǎn)導負調(diào)控蛋白 3) 的啟動子的甲基化而達到增強 IFN-a 抗病毒的作用[13]。同時研究表明 miRNA 的表達水平與 HBV 感染有密切關系[14]。 其中 HBV 感染患者的肝臟miR-122 的表達明顯低于健康對照者， miR-122 水平與肝內(nèi)病毒載量及肝臟炎癥程度呈負相關， 而通過抑制內(nèi)源性的 miR-122 可增強 HBV 復制[15]。因此，從目前的研究可以看出， miRNA-122 與丙肝病毒及乙肝病毒的復制密切相關，其表達水平可能與抗病毒療效有關。 目前 miR-122 與 慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C，CHC)干擾素抗病毒療效關系的體外研究較多，但國內(nèi)相關臨床研究報道較少。本課題旨在研究廣東地區(qū)的慢丙肝患者肝組織和血清中 miR-122 的表達水平與慢丙肝臨床治療的相關性， 探討是否可將miR-122 作為干擾素療效的預測指標。

1 對象與方法

1.1對象按照2004 年中華醫(yī)學會傳染病和寄生蟲病學分會與肝病學分會于聯(lián)合制定的《丙型肝炎防治指南》標準，篩選來自廣州市第八人民醫(yī)院的基因 1 型 CHC 患者40例為研究對象，除外其他病毒重疊感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等，均無聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療的禁忌癥，其中男性24例(60%)，女性16例(40%)，平均年齡(43.83±13.24)歲。

1.2方法

1.2.1 治療方法：采用聚乙二醇干擾素α-2 a(PEG-IFN α-2 a) 180 μg或135 μg(上海羅氏制藥有限公司 規(guī)格 180 μg/支和135 μg/支)或聚乙二醇干擾素α-2b (PEG-IFN α-2b)80 μg或50 μg(默沙東(中國)有限公司 規(guī)格 80 μg/支和50 μg/支)，皮下注射，每周1次，療程48周。利巴韋林(ribavirin) 800～1 200 mg (廣東華南藥業(yè)有限公司 規(guī)格0.1 g/片),每d分次口服，療程48周。

1.2.2 觀察指標:治療過程中對生化及病毒學指標進行檢測。生化指標采用美國貝克曼公司全自動生化分析儀檢測病毒學指標：采用PCR微板核酸雜交酶聯(lián)免疫法檢測HCV基因型(試劑盒購自廣州藍星生物科技開發(fā)公司)，HCV RNA定量檢測采用羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司COBAS Taq man 定量檢測試劑盒。HCV RNA<15IU/ml為陰性。miR-122：采用熒光定量PCR法檢測血清miR-122(引物為廣州銳博公司設計)；IL28B基因型：采用聚合酶鏈-連接酶檢測反應進行分型(試劑盒購自廣東東盛生物有限公司)(檢測時間點：治療前、治療4周、12周、24周、36周、48周及治療結束后24周)。

1.2.3 療效評價:根據(jù)PEG-IFN α聯(lián)合利巴韋林治療結束后隨訪24周HCV RNA是否小于15IU/ml，分為持續(xù)病毒學應答組(sustained virological response，SVR)和非持續(xù)病毒學應答組(non sustained virological response，NSVR)。

1.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，檢測結果采用均數(shù)與標準差表示，計量資料采用t檢測，計數(shù)資料采用χ2檢驗；線性回歸用來評估變量之間的相關性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療CHC患者療效本研究治療結束后隨訪24周時有29例(72.50%)患者出現(xiàn)SVR，11例(27.5%)為NSVR。

2.2SVR組與NSVR組基線指標比較SVR組患者與NSVR組患者比較，基線HCV RNA載量、總膽紅素 (Total bilirubin,TBIL) 水平、甲胎蛋白 (Alpha fetoprotein, AFP) 水平、肝臟硬度值(Fibroscan)、層粘連蛋白水平均更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL28B基因型有差異(P<0.05)；NSVR組基線血清miR-122水平為SVR組的3倍，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組患者年齡、BMI、性別等無明顯差異，見表1。

表1 兩組患者的基線特征Tab.1 Baseline Characteristics of two groups of patients

注：合并疾病采用的均為四格表資料的Fisher確切概率法

Note：Data of the combined diseases were all analyzed with exact probability methods of 2 by 2 tables

2.3基線血清miR-122水平與慢性丙型肝炎聚乙二醇干擾素α治療應答的關系SVR組和NSVR組基線miR-122水平分別為0.086±0.184和0.223±0.355，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.246)，見圖1。

圖1 基線血清miR-122水平與慢性丙型肝炎聚乙二醇干擾素α治療應答的關系Fig.1 The relationship between baseline MiR-122 level and response of patients with chronic hepatitis C treated with peg-interferon α

2.4SVR組與NSVR組患者miR-122最后一次測量值與基線值之間的差值比較兩組患者最后一次miR-122水平測量時間為治療結束后隨訪24周時。miR-122差值定義為最后一次測量值與基線值之間的差值。SVR組患者miR-122差值為0.044±0.239，NSVR組患者miR-122差值為0.215±0.355，兩組患者miR-122差值比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.481,P=0.161)，見圖2。

圖2 SVR組與NSVR組患者miR-122最后一次測量值與基線值之間的差值比較Fig.2 The change of MiR-122 level from baseline to the last available measurement between SVR group and NSVR group

2.5慢性丙型肝炎患者基線血清miR-122水平與病毒學、生化、纖維化指標的關系慢丙肝患者基線血清miR-122水平與基線HCV RNA載量、ALT水平、AST水平、TBIL水平、AFP水平、凝血酶原時間、層粘連蛋白水平、透明質(zhì)酸水平，Ⅲ型前膠原肽水平、IV型膠原水平、肝臟硬度值之間無相關性(P>0.05)，見表2。

表2 基線血清miR-122 線性回歸分析Tab.2 Baseline miR-122 level linear regression analysis

3 討論

CHC是終末期肝病的主要病因，CHC一旦進展為肝硬化，那么疾病可能會進入“加速”階段，此時若不進行規(guī)范、有效的抗病毒治療，則疾病很快將進展為失代償階段，發(fā)生肝細胞癌的比例也將提高；目前有許多研究發(fā)現(xiàn)患者年齡、體重、感染時程，HCV RNA載量、HCV基因型、IL28B多態(tài)性等宿主、病毒因素均可影響抗病毒療效。

MicroRNA是一類約為22個堿基的小分子非編碼RNA，主要與靶基因Mrna 3′非編碼區(qū)部分互補，促進靶基因mRNA降解或抑制其翻譯過程而發(fā)揮負調(diào)控作用[16]。

MicroRNA-122(miR-122)是含有22個堿基的肝臟特異性miRNA[17]，并且是肝臟中表達最豐富的miRNA[18]。miR-122的主要生理功能是調(diào)節(jié)脂質(zhì)和膽固醇的代謝。Jopling等[19]體外研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)HCV病毒的復制依賴于miR-122的表達狀態(tài)，只有在表達miR-122的Huh 7細胞中HCV才能復制；研究亦發(fā)現(xiàn)[20-21]，在慢性丙型肝炎及丙肝相關性肝硬化、肝癌患者血清中miR-122水平是顯著高于HCV陰性的人群，且血清miR-122與ALT水平、呈正相關，并提出miR-122可作為丙肝相關性肝癌診斷的一個標志物。Su等[22]報道，①血清miR-122與血漿(r=0.943)及肝臟(r=0.51)miR-122存在相關性，②基線血清miR-122肝臟組織活動指數(shù)(hepatic histology activity index，HAI) 評分及血清ALT存在正相關，但與HCV病毒載量、肝臟纖維化及血脂無相關性，③獲得完全早期應答(complete early virologic response, cEVR) 或SVR患者較NR患者有更高的基線miR-122水平。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NSVR組基線血清miR-122水平較SVR組高3倍，這也驗證了miR-122的存在可以促進HCV的復制，但兩組血清miR-122水平差異無統(tǒng)計學意義，考慮①本研究測得miR-122值為非正態(tài)分布，個別值離散程度大，②研究病例數(shù)較少；我們亦未發(fā)現(xiàn)血清miR-122與HCV RNA載量存在相關性，與既往報道相符；而在整個研究中，本研究亦未發(fā)現(xiàn)血清miR-122與其他指標存在相關性，考慮為本研究納入病例數(shù)少，且miR-122值為非正態(tài)分布，個別值離散程度大。

本研究旨在分析血清miR-122與SVR的關系，并且比較SVR與NSVR基線病毒指標、生化指標等的差異。在本研究中發(fā)現(xiàn)，SVR組與NSVR組比較，基線HCV RNA載量、AFP及Fibrosacn均較低，這與Mabrouk等[23]報道的一致。Safarnezhad等[6]發(fā)現(xiàn)在SVR組患者中IL28B CC基因型占90.9%，隨之是CT基因型(54%)及TT基因型(25%)，Ge 等[24]亦發(fā)現(xiàn)不管是在European-Americans、African-Americans 還是Hispanics，IL28B rs12979860 與SVR強烈相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)主要是IL28B rs12979860 CC基因型與SVR相關。在研究中我們亦發(fā)現(xiàn)SVR組患者中IL28B 基因型主要為CC基因型(占93.10%)，而SVR組CC基因型占54.55%。本研究中SVR組較NSVR組基線總膽紅素水平低，總膽紅素水平反映肝臟代謝功能，有研究發(fā)現(xiàn)基線高總膽紅素水平預示肝功能失代償，肝功能失代償會降低抗病毒治療的效果甚至增加治療的風險。層粘連蛋白作為肝纖維化指標，其升高提示肝纖維化傾向，在本研究中也發(fā)現(xiàn)基線層粘連蛋白水平高的患者不易獲得SVR。既往研究也發(fā)現(xiàn)年齡、性別、ALT、AST等與應答相關，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)上述因素與應答相關，考慮與本研究的病例數(shù)較少有關。

綜上所述，HCV RNA載量、IL28B基因型及肝臟纖維化程度均可應答聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗丙肝病毒療效，血清miR-122可能對抗病毒療效發(fā)揮關鍵作用。由于本研究樣本例數(shù)較少，還需要通過增加樣本數(shù)及進一步深入的生物學研究闡明其調(diào)控機制，從而有望發(fā)現(xiàn)miR-122在抗病毒治療中發(fā)揮更大的作用。

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