乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)降低輸血感染殘余風(fēng)險(xiǎn)的初步評(píng)估

余占娟 王月霞 呂豪 李向陽

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)(余占娟、李向陽)；324000 衢州市中心血站(王月霞、呂豪)

有報(bào)道我國人群中HBsAg攜帶率為7.18%[1]，2005年報(bào)道顯示衢州市人群的HBsAg陽性率平均為3.21%，屬乙肝中流行[2]。如何降低輸血感染，確保輸血安全，一直是國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)之一。由于條件限制，我國大多數(shù)血站一直采用兩種不同廠家的ELISA試劑檢測(cè)輸血傳染指標(biāo)，雖然這個(gè)方法的檢測(cè)技術(shù)不斷在提高，但仍存在一定的局限性，窗口期、隱匿性乙肝、HBV基因突變等因素都可能造成HBV漏檢。

為進(jìn)一步提高我國臨床用血安全水平、降低經(jīng)輸血傳播疾病風(fēng)險(xiǎn)，衛(wèi)生部在《全面推進(jìn)血站核酸檢測(cè)工作實(shí)施方案(2013—2015年)》提出到2015年底2016初全國血液篩查基本覆蓋核酸檢測(cè)。NAT直接檢測(cè)病毒DNA/RNA, 比ELISA更早地檢出處于窗口期的標(biāo)本。本調(diào)查就我站開展標(biāo)本送金華血站集中化核酸檢測(cè)后HBV血清學(xué)檢測(cè)和NAT檢測(cè)結(jié)果分析比較，探討核酸檢測(cè)對(duì)降低衢州地區(qū)HBV輸血感染的意義。分析如下：

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源收集2016年3月到2017年3月期間衢州市中心血站檢驗(yàn)科檢測(cè)的獻(xiàn)血血液標(biāo)本共27 646人份,其中首次獻(xiàn)血10 548人份、再次獻(xiàn)血17 098人份。每個(gè)獻(xiàn)血者同時(shí)留取兩份血液標(biāo)本，分別用于ELISA檢測(cè)和核酸檢測(cè)。根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》，核酸標(biāo)本需要采集4 h內(nèi)3 500×g離心15 min并于2～8 ℃冰箱保存，標(biāo)本采集后送金華血站檢測(cè)，72 h內(nèi)完成檢測(cè)，血液標(biāo)本包裝盒和運(yùn)送過程符合國家相關(guān)要求。

1.2方法、試劑與儀器

1.2.1 檢測(cè)方法：血液標(biāo)本采集后于次日進(jìn)行ELISA檢測(cè)、并將核酸管送往金華血站進(jìn)行核酸檢測(cè)。ELISA檢測(cè)HBsAg采用雙抗體夾心法。NAT檢測(cè)HBV DNA引物由上海浩源生物有限公司提供，靶基因?yàn)镠BV C區(qū)，反應(yīng)條件：步驟一，UNG酶啟動(dòng)：37 ℃×2 min，1個(gè)循環(huán)數(shù)；步驟二，UNG酶反應(yīng)：50 ℃×5 min，1個(gè)循環(huán)數(shù)；步驟三，反轉(zhuǎn)錄：42 ℃×35 min，1個(gè)循環(huán)數(shù)；步驟四，核酸變性：94 ℃×10 min，1個(gè)循環(huán)數(shù)；步驟五，擴(kuò)增、變性、退火、延伸：94 ℃×10 s、55 ℃×15 s、65 ℃×45 s，45個(gè)循環(huán)數(shù)(注65 ℃采集全部熒光信號(hào))。

1.2.2 主要試劑與儀器：ELISA試劑盒：廈門英科新創(chuàng)乙肝表面抗原診斷試劑盒；英國索林乙肝表面抗原診斷試劑盒。儀器：Hamilton Star7560全自動(dòng)加樣儀，F(xiàn)AME3443酶免分析儀。NAT試劑盒：上海浩源乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒/人類免疫缺陷病毒(1型)三合一核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法)，本品采用儀器自動(dòng)化提取，按照8的系數(shù)等體積合并檢測(cè)樣本，取1.2 ml進(jìn)行核酸提取，如果檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)性需進(jìn)行拆分檢測(cè)，拆分檢測(cè)直接取需拆分標(biāo)本1.2 ml進(jìn)行核酸提取。儀器：ChiTas bss1200加樣提取儀；ABI7500擴(kuò)增儀。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)結(jié)果s/co值<1.0為陰性，s/co值1.0為陽性。雙試劑陰性則判定結(jié)果為陰性；單一試劑陽性，則雙孔復(fù)查，均為陰性則判斷結(jié)果為陰性，有一孔以上有陽性則判定結(jié)果為陽性；雙試劑陽性則判定結(jié)果為陽性；NAT檢測(cè)確認(rèn)ELISA檢測(cè)結(jié)果，ELISA檢測(cè)陽性NAT檢測(cè)陽性則判斷ELISA結(jié)果陽性；ELISA檢測(cè)陰性NAT檢測(cè)陽性則判定ELISA結(jié)果陽性。

1.4輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法根據(jù)“發(fā)病率/窗口期”數(shù)學(xué)模型計(jì)算公式[3-4]計(jì)算。R=ΣRi；Ri=(WFi+HFi)×Di；WFi=Ii×(Li/365)；HFi=E×Pi。R:單位血液未檢測(cè)出HBV陽性加權(quán)平均數(shù);Ri:各分組單位血液未檢測(cè)出HBV陽性數(shù)；Pi:各分組乙肝病毒現(xiàn)患率；Ii:各分組乙肝發(fā)病率；WFi:各分組窗口期風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)因素; HFi:各分組人為因素或其他所致的試驗(yàn)誤差;Di：各分組百分比;E:檢測(cè)試驗(yàn)差錯(cuò)率;Li:乙肝窗口期(d)；i:首次獻(xiàn)血組和重復(fù)獻(xiàn)血組。首次獻(xiàn)血者發(fā)病率=(重復(fù)獻(xiàn)血者發(fā)病率×首次獻(xiàn)血者現(xiàn)患率)/重復(fù)獻(xiàn)血現(xiàn)患率。重復(fù)獻(xiàn)血者發(fā)病率=重復(fù)獻(xiàn)血現(xiàn)患率/重復(fù)獻(xiàn)血間隔時(shí)間。簡(jiǎn)化公式:R=(Li/T+E)×(ΣPi*Di)。T:重復(fù)獻(xiàn)血間隔時(shí)間(d)。

1.5確定參數(shù)窗口期(Li)長短與使用試劑、方法相關(guān)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]確定ELISA檢測(cè)HBsAg的窗口期為59 d, NAT檢測(cè)HBV DNA的窗口期為20 d。差錯(cuò)率(E)參考文獻(xiàn)[4,6]，本實(shí)驗(yàn)室近3年參加約500份室間質(zhì)評(píng)檢測(cè)，有1份結(jié)果不符合預(yù)期，金華核酸實(shí)驗(yàn)室未出現(xiàn)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果不符合情況，故計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室的差錯(cuò)率為0.2%，金華核酸實(shí)驗(yàn)室的差錯(cuò)率為0。重復(fù)獻(xiàn)血間隔時(shí)間(T),由浙江省血液中心信息中心提供為587 d。

2 結(jié)果

2.1檢測(cè)結(jié)果2016年3月至2017年3月共27 646份衢州地區(qū)無償獻(xiàn)血血液。HBV檢測(cè)結(jié)果為ELISA檢測(cè)陽性，NAT檢測(cè)陽性的標(biāo)本有76例；ELISA檢測(cè)為陰性，NAT檢測(cè)為陽性的標(biāo)本有31例；NAT檢測(cè)陽性的標(biāo)本一共有107例。詳見表1。

2.2計(jì)算方法采用簡(jiǎn)化公式R=(Li/T+E)×(ΣPi*Di)計(jì)算，ELISA檢測(cè)后HBV輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)為28.2×10-5，NAT檢測(cè)后HBV輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)為 13.0×10-5，NAT檢測(cè)對(duì)ELISA檢測(cè)降低輸血感染HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)程度=(R1-R2)/R1=(28.2×10-5-13.0×10-5)/28.2×10-5=53.9%。詳見表2。

3 討論

HBV可經(jīng)輸血傳播，與病毒自身、檢測(cè)方法和受血者狀況等因素密切相關(guān)[7]。隨著獻(xiàn)血相關(guān)法律法規(guī)的完善以及檢測(cè)技術(shù)的革新?lián)Q代，HBV輸血傳播90%的風(fēng)險(xiǎn)來源于病毒“窗口期”[8]，當(dāng)今酶免技術(shù)還不能檢出隱匿性乙肝、基因突變以及血清學(xué)轉(zhuǎn)換前的“窗口期”，而NAT直接檢測(cè)HBV-DNA，可以很大程度解決這些漏檢問題，乙肝窗口期更由原來ELISA的59 d降至20 d，大大減低窗口期給輸血帶來的風(fēng)險(xiǎn)。本次選取的27 646份無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，經(jīng)檢測(cè)乙肝總陽性率占0.39%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于我國人群HBsAg攜帶率7．18%[1]和衢州市人群的HBsAg陽性率平均為3．21%[2],這和參加獻(xiàn)血人群大多是健康人群以及獻(xiàn)血前的健康征詢、快速試紙條的初篩有重要關(guān)系。

表1 衢州地區(qū)27 646份無償獻(xiàn)血血液HBV檢測(cè)情況[n(%)]

表2 2016年3月至2017年3月衢州地區(qū)無償獻(xiàn)血血液HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)

很多國家使用NAT 估計(jì)來自窗口期的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。本分析采用“發(fā)病率/窗口期”模型[11]，將ELISA檢測(cè)陰性NAT檢測(cè)陽性的標(biāo)本數(shù)看作窗口期的標(biāo)本數(shù)。結(jié)果顯示NAT檢測(cè)后HBV輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)顯著下降，符合相關(guān)報(bào)道中NAT可降低HBV輸血傳播40%～50%的殘余風(fēng)險(xiǎn)[12]。

綜合上述表明，開展核酸檢測(cè)技術(shù)能有效的降低衢州地區(qū)HBV輸血感染的殘余風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)保證臨床輸血安全有重大意義。

[1] 莊輝. 乙型肝炎流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志, 2009, 1(2): 18-24. doi:10.3760/ cma.j.issn.1673-4149.2004.03.002.

[2] 龔曉英, 龔震宇, 鄒亞洲, 等. 浙江省衢州市乙型病毒性肝炎流行現(xiàn)狀與分析[J]. 疾病監(jiān)測(cè), 2007, 22(4): 246-247. doi:10.3784/j.issn.1003-9961.2007.04.014.

[3] Cumming PD, Edward L, Wallace EL, et al. Exposure of patients to human immunodeficiency virus through the transfusion of blood components that test antibody-negative[J]. N Engl J Med, 1989, 32 (1): 941-946. doi: 10.1056/NEJM198910053211405.

[4] 吳敬林, 周仲民, 羅保紅. 核酸檢測(cè)對(duì)降低柳州地區(qū)輸血病原感染殘余風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估[J]. 中國輸血雜志, 2014, 27(7): 727-729. doi:10.13303/j.cjbt.issn.1004-549x.2014.07.016.

[5] Schreiber GB, Busch MD, Kleinman SH, et al. The risk of transfusion-transmitted viral infections[J]. N Engl J Med,1996, 33(4):1685-1690. doi:10.1056/NEJM199606273342601.

[6] 王宋興, 曾勁峰, 楊愛蓮, 等.深圳地區(qū)無償獻(xiàn)血者HIV感染情況調(diào)查分析及輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 中國輸血雜志, 2012, 25(7): 674-676.

[7] Zanetti AR, Van Damme P, Shouval D， et al． The global impact of vaccination against hepatitis B: A historical overview[J]. Vaccine, 2008, 26(12): 6266-6273. doi:10.1016/j.vaccine.2008. 09.056.

[8] Gallarda JL, Dragon E. Blood screening by nucleic acid amplification technology: current issues， future challenges[J]. Mol Diag, 2000, 5 (1): 11-12. doi:10.1054/MODI00500011.

[9] Zou S，Dorsey KA，Notari EP，et al．Prevalence，incidence，and residual risk of human immunodeficiency virus and hepatitis C virus infections among United States blood donors since the introduction of nucleic acid testing[J].Transfusion, 2010, 50(7): 1495-1504. doi: 10.1111/j. 1537-2995. 2010.02622.x.

[10] Al Shaer L, Abdul Rahman M, John TJ, et al. Trends in prevalence, incidence, and residual risk of major transfusion-transmissible viral infections in United Arab Emirates blood donors:impact of individual-donation nucleic acid testing 2004 through 2009[J]. Transfusion, 2012, 52(11): 2300-2309. doi: 10.1111/j.1537-2995.03740.x.

[11] 韓婷婷, 劉魚, 李玲, 等. 輸血傳染性殘余風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法研究進(jìn)展[J]. 中國輸血雜志, 2014, 27(10): 1061-1064. doi:10.13303/j.cjbt.issn.1004-549x.2014.10.030.

[12] Alvarez M, Oyonarte S, Rodriguez PM, et al. Estimated risk of transfusion-transmitted viral infections in spain [J]. Transfusion, 2002, 42(8): 994-998. doi:10.1046/j1537-1995.2002.00154x.