血小板糖基化的研究進展

李麗萍，屈晨雪，戴菊華，吳雪蓮

(北京大學第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034)

·綜述·

血小板糖基化的研究進展

李麗萍，屈晨雪，戴菊華，吳雪蓮

(北京大學第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034)

糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要途徑之一。通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性，糖基化參與細胞功能的發(fā)揮及疾病的發(fā)生發(fā)展。血小板糖蛋白具有豐富的糖萼，其糖基化在血小板生成、分化中發(fā)揮重要作用，與出血及血栓性疾病的發(fā)病機制密切相關，多個糖蛋白分子，如P選擇素、C型凝集素樣受體2、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子等的糖基化修飾均參與調(diào)控血小板的功能。該文主要綜述了血小板糖基化在出血及血栓性疾病中的研究進展及主要檢測方法。

血小板；糖蛋白；糖基化

糖基化是體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。在酶的催化下糖鏈與肽鏈上的特定糖基化位點結(jié)合，或糖基之間生成糖苷鍵而發(fā)生共價結(jié)合,該過程稱為蛋白質(zhì)糖基化。糖基化在蛋白質(zhì)的折疊、相互作用、穩(wěn)定性、流動性及信號轉(zhuǎn)導中均具有重要作用。糖蛋白糖鏈主要分為天冬酰胺連接的N-糖鏈和絲氨酸或蘇氨酸連接的O-糖鏈2大類。糖鏈主要有9種糖基，包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、唾液酸，在高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)下依次延伸合成數(shù)百種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)[1]。通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性，糖基化也參與維持細胞的正常功能以及疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。研究證實，糖蛋白的糖基化水平或糖鏈結(jié)構(gòu)在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)生了改變，導致糖蛋白及其所在細胞的功能障礙，例如癌癥、炎癥反應、自身免疫病等。目前超過50%的蛋白質(zhì)有糖基化，而現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中只有約10%注釋為糖蛋白。電子顯微鏡下顯示血小板表面含有豐富的糖蛋白，形成了豐富的糖萼，在其分化、發(fā)育及功能方面可能發(fā)揮重要作用。本綜述主要總結(jié)血小板糖基化的研究進展及其主要檢測方法。

1 血小板糖基化與疾病

1.1血小板糖基化與出血性疾病 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一種免疫性血小板破壞過多造成的出血性疾病。目前公認的血小板清除機制是Fc受體途徑介導的血小板破壞：抗血小板抗體與血小板膜糖蛋白結(jié)合，如糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoprotein Ⅱb/Ⅲa,GPⅡb/Ⅲa)、糖蛋白Ⅰb(glycoproteinⅠb,GPⅠb)等，使血小板被單核-巨噬細胞吞噬。陶莉莉等[3]分析ITP患者血小板糖基化程度與一線治療療效相關性，發(fā)現(xiàn)血小板糖基化水平可在一定程度上提示ITP患者治療效果，表明ITP患者血小板清除可能存在非Fcγ依賴途徑。提示血小板糖基化有助于詮釋部分難治性ITP的發(fā)病機制，為其治療提供新的思路。

3例遺傳性唾液酸缺陷患者臨床表現(xiàn)為出血，血小板減少，同時平均血小板體積增大[4]。其血小板GPⅠb表達水平正常，但十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳卻顯示GPⅠb移動速率減慢，且與GPⅠb結(jié)合的花生凝集素含量減少，說明唾液酸含量減低?？梢奊PⅠb的唾液酸化水平在血小板的正常分化發(fā)育及功能發(fā)揮中產(chǎn)生一定的影響。

1.2血小板糖基化與血栓性疾病 先天性糖基化障礙(congenital disorder of glycosylation，CDG)疾病由于磷酸甘露糖酶(PMM2)發(fā)生突變，導致N-糖鏈糖基化異常。此類患者由于血小板自發(fā)聚集而導致血栓風險增加，而血小板糖蛋白潛在的低糖基化可能是導致血小板反應亢進的原因。而血小板N-糖鏈的糖蛋白(包括GPⅠbα)在數(shù)量和質(zhì)量上均沒有明顯變化，但血小板的半乳糖糖基化水平升高。提示血小板表面糖蛋白的異常糖基化修飾可能導致血小板自發(fā)性聚集造成血小板高反應性[5]。

冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂導致血栓形成是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)的病理生理基礎，血小板則參與血栓形成，在CHD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CHD患者血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P表達增高，呈現(xiàn)高反應性，發(fā)生血栓風險增加[6]。周方元等[7]發(fā)現(xiàn)CHD患者中血清唾液酸水平明顯高于對照組，高水平的唾液酸可能通過炎癥反應、促進白色血栓形成等方式加速動脈粥樣硬化的進程。血小板膜表面GPⅠb是糖基化程度最高的唾液酸糖蛋白，其唾液酸含量占血小板膜表面糖含量的64%。同時，動脈粥樣斑塊破裂暴露內(nèi)皮細胞后，血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ與血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的結(jié)合是血小板活化和血栓形成的啟始和關鍵步驟。提示CHD患者血小板高反應性及血栓風險增加與血小板GPⅠb的糖基化水平可能存在一定的相關性。

糖尿病患者體內(nèi)血小板功能亢進與高血糖有關，雖然抗血小板藥物可在相當程度上抑制血小板活性，研究顯示仍有部分患者出現(xiàn)抗血小板藥物不敏感。糖尿病患者體內(nèi)多種蛋白質(zhì)(如膠原蛋白、血紅蛋白等)在高血糖狀態(tài)下均發(fā)生了非酶糖基化反應，形成糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)，影響機體正常代謝途徑，如促進糖尿病患者動脈粥樣硬化生成，導致內(nèi)皮調(diào)節(jié)功能受損[8]，增加血小板活性，促進血小板聚集等。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血小板糖蛋白總的糖基化水平升高，且與患者阿司匹林不敏感相關[9]?？梢娧“逄腔c病程進展及治療可能存在某種內(nèi)在聯(lián)系，從血小板糖基化的角度研究糖尿病，對病情認識及發(fā)病機制方面都具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，去除癌細胞表面的唾液酸使其更容易被固有免疫細胞識別并消滅[10]，這可能為癌癥免疫療法提供新途徑。表明血小板糖基化修飾的研究不僅為詮釋疾病全新的發(fā)病機制提供依據(jù)，同時也可能是出血及血栓性疾病潛在的治療靶點。

2 血小板糖蛋白糖基化的功能

血小板糖蛋白糖基化的異常改變可能與血小板疾病密切相關。Shah等[11]分析血小板的糖蛋白質(zhì)組學，從血小板裂解后獲得的1 296種肽鏈中鑒別出799個與N-糖鏈結(jié)合的糖基化位點。

2.1GPⅠb GPⅠb是血小板膜表面最豐富的糖蛋白之一，其糖基化位點主要位于α亞單位[相對分子質(zhì)量(Mr)143 000],蛋白酶裂解后脫落到血漿中的GPⅠb片段包含2個部分：糖鏈部分(Mr 80 000)和多肽部分(含有vWF和凝血酶的結(jié)合位點，Mr 45 000)[12]。Hoffmeister等[13]研究發(fā)現(xiàn)以尿苷二磷酸半乳糖(uridine diphosphate-galactose,UDP-Gal)為糖基化供體，使血小板表面發(fā)生半乳糖糖基化，封閉αMβ2的識別位點，抑制巨噬細胞吞噬血小板，延長冷藏血小板的保存期限。有學者構(gòu)建小鼠內(nèi)皮/造血干細胞中Cosmc基因定向敲除的小鼠模型(Cosmc基因編碼調(diào)節(jié)O-糖鏈的蛋白質(zhì))，發(fā)現(xiàn)該突變可導致大多數(shù)小鼠在圍產(chǎn)期嚴重出血而死亡，幸存小鼠尾部出血時間顯著延長并發(fā)生巨血小板減少癥。該類小鼠血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ分子表達減少，與vWF結(jié)合功能及活化GPⅡb/Ⅲa的功能明顯減弱。提示廣泛的O-糖鏈對于血小板的生成、糖蛋白表達及功能的正常發(fā)揮必不可少，O-糖鏈的改變可能導致止血異常[14]。

2.2P選擇素 P選擇素(也稱CD62P，GMP140)是存在于血小板α顆粒膜和血管內(nèi)皮細胞的糖蛋白。血小板活化后，α顆粒膜與胞膜迅速融合，使P選擇素在血小板表面瞬時表達，從而介導活化血小板與白細胞的反應、促進血栓形成。研究證實，P選擇素存在野生型(715Thr)和變異型(715Pro)2種形式。變異型P選擇素糖基化水平降低50%，其在轉(zhuǎn)染細胞表面的表達和分泌也減少，與中性粒細胞樣的HL-60細胞結(jié)合降低，同時其與單核細胞的聚集體也明顯低于野生型；體外及體內(nèi)試驗顯示變異型P選擇素阻礙其糖基化，形成不完整P選擇素，從而減少P選擇素的表達及分泌，最終影響血小板功能[15]。表明血小板P選擇的糖基化修飾差異可能在炎癥反應中起著一定的作用。

2.3C型凝集素樣受體2(C-lectin like receptor 2，CLEC-2) CLEC-2是表達于血小板表面的受體,可識別多種配體，在血小板聚集、腫瘤轉(zhuǎn)移及HIV感染中發(fā)揮重要作用。CLEC-2存在2種不同的形式：高分子量和低分子量。二者的蛋白質(zhì)核心相同而糖鏈存在差異。研究發(fā)現(xiàn),2種類型的CLEC-2在134位天冬酰胺(Asn)存在不同的糖基化形式[16]。高分子量CLEC-2在該位點有巖藻糖糖鏈，且形式復雜，如雙觸角、三觸角和四觸角等形式，而低分子量CLEC-2中則沒有這些糖鏈結(jié)構(gòu)[16]。

2.4血小板內(nèi)皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1，即CD31) PECAM-1主要分布于血小板、單核細胞和粒細胞，是內(nèi)皮細胞間相互作用的主要成分。該分子通過N端的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，維持血管通透屏障和炎癥或血栓后的內(nèi)皮細胞重建。研究顯示，PECAM-1功能依賴于α2,6-唾液酸。缺乏α2,6-唾液酸可下調(diào)PECAM-1的酪氨酸磷酸化和募集Src(含有蛋白酪氨酸磷酸酶2)，使細胞更易發(fā)生線粒體依賴的細胞凋亡[17]。PECAM-1糖鏈占其分子量的30%，這些糖鏈主要來自于同源結(jié)合表面的25位Asn殘基；通過對該位點突變體(N25Q)試驗發(fā)現(xiàn)，盡管該突變體在細胞相互作用處正常聚集，但在凝血酶破壞的內(nèi)皮細胞屏障重建功能則顯著減弱，證實包含唾液酸的糖鏈結(jié)構(gòu)(來自25位Asn)通過穩(wěn)定PECAM-1分子同源結(jié)合表面而增強了內(nèi)皮細胞間的動態(tài)相互作用[18]。

2.5糖基轉(zhuǎn)移酶 在蛋白質(zhì)糖基化修飾過程中，糖基轉(zhuǎn)移酶通過催化生成糖苷鍵而發(fā)揮重要作用。研究曾認為糖基轉(zhuǎn)移酶是定位于高爾基體適當區(qū)室中，通過外殼蛋白Ⅰ介導進行逆向轉(zhuǎn)運，且僅在其莖區(qū)域的蛋白質(zhì)水解切割后才被釋放和分泌[19]。血小板是無核細胞，缺乏復雜的分泌系統(tǒng)如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。但已有研究顯示血小板有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，人血小板是糖基轉(zhuǎn)移酶的重要攜帶者，血小板內(nèi)部和表面存在多個不同糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員，包括α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3Gal-1)、β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β4GalT)、α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal-1)等[20]。同時，血小板內(nèi)部也含有豐富的糖基供體，活化后釋放可溶性血小板糖基轉(zhuǎn)移酶和糖基供體到細胞外，并使附近細胞糖基化?；罨娜搜“迮cST3GalⅣ-/-缺陷小鼠血小板孵育后，小鼠血小板表面唾液酸含量增多[21]。提示血小板活化釋放的糖基轉(zhuǎn)移酶具有重塑血小板表面糖鏈、改變細胞行為的能力，可能動態(tài)控制著血小板活化。

3 血小板糖基化的檢測方法

3.1質(zhì)譜法 質(zhì)譜法基于糖蛋白的糖鏈酶解和富集基礎上，可定量檢測糖鏈豐度，既可用于分辨聚糖混合物的成分，也可作為獲取糖鏈結(jié)構(gòu)信息的工具。首先純化并富集糖蛋白/糖肽，然后用胰蛋白酶及糖苷酶對糖肽加工處理、修飾，最后根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果并參照數(shù)據(jù)庫信息分析糖鏈糖基化位點、糖鏈結(jié)構(gòu)[2]。質(zhì)譜法是目前公認的分析糖蛋白糖基化的方法，特別適用于分析含少量聚糖的復合混合物，但在檢測血小板糖基化時，只能分析血小板裂解后提純的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)及糖基化水平，無法實現(xiàn)完整血小板糖蛋白糖基化修飾水平檢測，且質(zhì)譜法前處理復雜，對技術人員要求高，成本高，耗時較長，后期處理分析困難等缺陷，并不能作為血小板糖基化檢測的最佳方法。目前有研究用固相萃取含糖肽段的方法(solid phase extraction of glycosite-containing peptides，SPEG)[11]或酶化學法固相萃取獲得N-糖鏈和含糖肽(solid phase extraction of N-linked glycans and glycositecontaining peptides，NGAG)[22]，iTRAQ標記后聯(lián)用LC-MS/MS技術分析血小板糖蛋白質(zhì)組學。

3.2糖微陣列技術 糖微陣列技術(糖基因芯片)是以DNA微陣列技術為基礎，具有高通量和高靈敏度，可用于聚糖結(jié)構(gòu)分析。該技術是將數(shù)以千計的寡糖序列以點陣形式固定在特定的基板上，并通過高通量掃描技術分析糖分子與其他生物分子間的特異性相互作用，研究聚糖在生物體中的功能和作用機制。糖微陣列技術最顯著的特點是樣品用量小、一次性檢測樣品多，可同時分析、檢測和鑒別成百個樣品。但是糖微陣列還處于技術開發(fā)的初級階段，在很多方面需要進一步研究，如新的構(gòu)建方法、新的表面材料和顯影技術、進一步微型化、靈敏的檢測技術和數(shù)據(jù)處理工具等[21,23]。

3.3基于凝集素的流式細胞分析技術 凝集素能識別糖蛋白和糖脂中，特別是細胞膜中復雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細胞膜表面的糖基，一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力；同時凝集素具有多價結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合而不影響其生物活性。流式細胞分析技術具有靈敏度、特異性高，重復性好，分析細胞數(shù)量多(≥10 000個細胞)的特點。將二者結(jié)合產(chǎn)生的基于凝集素的流式細胞技術可用于檢測血小板及細胞表面的糖基化水平，相較于其他糖鏈分析技術，該方法樣本前處理分析過程簡單，可避免人為操作造成的結(jié)果差異[24]。

4 展望

雖然糖鏈結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜方法可獲得較為全面的信息，但對于糖蛋白糖基化修飾差異所致細胞或機體功能的改變目前并沒有較為統(tǒng)一的研究方法。血小板離體后受外界環(huán)境影響易活化，離體修飾后難以用體內(nèi)試驗來研究糖基化修飾差異對血小板功能的影響，而這些因素均對糖基化修飾差異與血小板功能影響的研究造成了很大的困難。目前，對已明確的血小板糖蛋白糖基化修飾的功能及其對機體的影響并沒有更詳細的研究。了解血小板糖基化，有利于對血小板異常糖基化導致血小板功能的改變以及與疾病發(fā)生發(fā)展關系的進一步研究，可為疾病的治療及診斷提供參考價值。

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10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.18

李麗萍，1992年生，女，碩士研究生，研究方向：臨床檢驗診斷學。

屈晨雪，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：qucx2012@hotmail.com。

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2017-03-27)

王海燕)