結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)脊柱結(jié)核的診斷價(jià)值

劉漢輝，李 輝，余嘉洪

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核中最常見的類型，其中脊柱結(jié)核占50%以上，尤以兒童與青少年多見[1]。早期診斷和早期治療能夠阻止脊柱結(jié)核病變的進(jìn)一步發(fā)展，大大縮短療程，避免或減少畸形發(fā)生，甚至不用手術(shù)就能達(dá)到治愈目的[2]。但脊柱結(jié)核發(fā)病早期一般較隱匿，缺乏典型的臨床癥狀；加上近年來椎間盤型結(jié)核、單椎體中心型結(jié)核、非連續(xù)性結(jié)核等非典型性脊柱結(jié)核病例不斷增多，早期X線、CT及其他影像學(xué)檢查缺乏特異性，導(dǎo)致脊柱結(jié)核在早期易發(fā)生漏診或誤診[3]，延誤治療，引發(fā)脊柱畸形、截癱等嚴(yán)重后果。

結(jié)核病的傳統(tǒng)診斷手段包括結(jié)核菌素純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）皮試、血清結(jié)核抗體檢測(cè)、結(jié)核桿菌DNA PCR檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、組織病理學(xué)檢查等[4]。結(jié)核菌素皮試試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）臨床最為常用，但有較多缺陷[5]，在易受結(jié)核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低，而在普遍接種卡介苗的地區(qū)則出現(xiàn)非常高的假陽性率；其他幾種檢測(cè)手段因陽性率偏低、結(jié)果誤差較大或檢測(cè)技術(shù)要求高等原因，對(duì)脊柱結(jié)核的輔助診斷作用亦有限[6]。因此建立更加快速準(zhǔn)確的診斷方法，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和診斷脊柱結(jié)核至關(guān)重要。近年來出現(xiàn)的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)（T-cell spot of tuberculosis，T-SPOT.TB）試驗(yàn)是診斷結(jié)核感染的新方法，在國(guó)外已廣泛應(yīng)用于結(jié)核感染的診斷[7-8]。本研究應(yīng)用T-SPOT.TB試劑盒對(duì)經(jīng)確診的脊柱結(jié)核及非結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，并與其他常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行比較，目的在于評(píng)估T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)于脊柱結(jié)核的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年12月佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科收治并確診的脊柱結(jié)核及非結(jié)核患者各50例。結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查符合脊柱結(jié)核的特征；②術(shù)前或術(shù)中活檢病灶標(biāo)本涂片或細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)存在結(jié)核分枝桿菌，或病理檢查符合結(jié)核改變；③抗結(jié)核治療少于2周。排除合并脊柱外結(jié)核病例。非結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無結(jié)核患者接觸史；②影像學(xué)檢查無結(jié)核表現(xiàn)；③排除結(jié)核分枝桿菌感染及診斷不明的脊柱疾病。

結(jié)核組患者男31例，女19例，年齡9～43歲，平均年齡35.3歲；其中頸椎結(jié)核8例、胸椎結(jié)核23例、腰椎結(jié)核19例。非結(jié)核組患者中男28例，女22例，年齡13～56歲，平均年齡41.8歲；其中化膿性感染21例、轉(zhuǎn)移瘤16例、多發(fā)性骨髓瘤9例、布魯氏菌病4例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 PPD皮試 抽取結(jié)核菌素皮試液0.1 mL（5 IU）于受試者左前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射，注射后72 h硬結(jié)的橫徑與縱徑平均值≥5 mm為陽性、＜5 mm為陰性。

1.2.2抗結(jié)核抗體檢測(cè) 抽取受試者3 mL外周血，采用結(jié)核桿菌抗體檢測(cè)試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司）及全自動(dòng)生化檢測(cè)儀進(jìn)行抗結(jié)核抗體檢測(cè)，并記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 T-SPOT.TB檢測(cè) 分別抽取受試者3～4 mL外周抗凝血，以淋巴細(xì)胞分層液分離、提純外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×106/L。在4個(gè)檢測(cè)孔內(nèi)加入不同的對(duì)照物：陰性對(duì)照孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL；陽性質(zhì)控對(duì)照孔加入陽性對(duì)照植物血細(xì)胞凝集素50 μL；2個(gè)測(cè)試孔A孔和B孔分別加入結(jié)核桿菌混合多肽A（ESAT-6抗原）和混合多肽B（CFP-10抗原）各50 μL。分別在上述孔內(nèi)加入100 μL 2.5×106/mL的PBMC。將微孔板放入（37±1）℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育l6～20 h。洗板后加入配制的標(biāo)記抗體工作液50 μL，于2～8℃下孵育60 min；再次洗板后加入底物溶液50 μL，于室溫中顯色反應(yīng)7 min，洗滌各孔、終止反應(yīng)，孔內(nèi)可見深藍(lán)色清晰斑點(diǎn)。將微孔板避光置于通風(fēng)環(huán)境或37℃溫箱中干燥，采用ELISPOT斑點(diǎn)計(jì)數(shù)并加以記錄。

T-SPOT.TB試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：①陽性結(jié)果：當(dāng)空白對(duì)照孔≤5 SFCs（斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)）時(shí)，（A孔－空白對(duì)照孔）或（B孔－空白對(duì)照孔）≥6 SFCs；當(dāng)空白對(duì)照孔≥6 SFCs時(shí)，A孔或B孔細(xì)胞數(shù)≥空白對(duì)照孔2倍；②陰性結(jié)果：（A孔－空白對(duì)照孔）或（B孔-空白對(duì)照孔）＜6 SFCs且陽性對(duì)照孔≥20 SFCs；③不確定結(jié)果：（A孔－空白對(duì)照孔）或（B孔－空白對(duì)照孔）＜6 SFCs且陽性對(duì)照＜20 SFCs，建議重新送檢；④技術(shù)誤差：當(dāng)空白對(duì)照孔≥10 SFCs時(shí)建議重新送檢。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)3種檢測(cè)方法診斷脊柱結(jié)核的敏感度（真陽性率，Se）、特異度（真陰性率，Sp）、陽性似然比（+LR）及陰性似然比（－LR）；對(duì)脊柱結(jié)核組3種診斷方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 結(jié)果判定

當(dāng)Se、Sp分別＞80%，可判定該檢測(cè)方法對(duì)脊柱結(jié)核的輔助診斷價(jià)值較高；+LR＞10或－LR＜0.1，可判定其檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信，+LR越大或－LR越小，檢測(cè)結(jié)果可信度則越高[9]。

2 結(jié)果

3種診斷方法對(duì)脊柱結(jié)核的檢測(cè)結(jié)果見表1，表2提示T-SPOT.TB檢測(cè)的Se、Sp、+LR、－LR明顯優(yōu)于其他兩種常規(guī)檢測(cè)方法。對(duì)脊柱結(jié)核組T-SPOT.TB試驗(yàn)與其他兩種診斷方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

3 討論

3.1 診斷脊柱結(jié)核的傳統(tǒng)方法

表1 3種檢測(cè)方法診斷脊柱結(jié)核的結(jié)果比較（n=50，例）

表2 3種檢測(cè)方法敏感度、特異度、陽性似然比和陰性似然比的比較（n=50）

結(jié)核菌培養(yǎng)是目前臨床診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但敏感性太低，對(duì)結(jié)核菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室條件及工作人員的素質(zhì)要求也較高，在基層醫(yī)院較難開展。組織病理學(xué)檢測(cè)方法對(duì)脊柱結(jié)核的診斷陽性率亦只有40%左右[10]。原因可能是脊柱結(jié)核病變位置較深，組織標(biāo)本取材難度較高；此外，結(jié)核病變?cè)缙诔史翘禺愋匝装Y反應(yīng)，而特異性干酪性壞死及結(jié)核結(jié)節(jié)樣壞死在疾病晚期才出現(xiàn)，因此限制了其對(duì)脊柱結(jié)核的早期診斷。

表3 脊柱結(jié)核組T-SPOT.TB檢測(cè)與結(jié)核菌素PPD皮試、抗核抗體檢測(cè)的比較（n=50，例）

3.3 T-SPOT.TB檢測(cè)原理

結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主。作為免疫應(yīng)答的一部分，T細(xì)胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，包括CD4和CD8。將這些活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞從全血中單獨(dú)分離出來，在體外受特異抗原刺激并計(jì)數(shù)；在細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子擴(kuò)散稀釋前，ELISPOT技術(shù)能夠立即捕獲細(xì)胞周圍所分泌的細(xì)胞因子，可以檢測(cè)出1/10 000～1/50 000 PBMC中經(jīng)結(jié)核菌抗原刺激后釋放γ-干擾素的細(xì)胞，其靈敏度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[11-12]。

而T-SPOT.TB試驗(yàn)是一種以ELISPOT技術(shù)檢測(cè)結(jié)核感染的新方法，其對(duì)每個(gè)活化的結(jié)核特異效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，操作更加簡(jiǎn)單。該方法使用的抗原是結(jié)核分枝桿菌RD1和RD16區(qū)編碼的蛋白，這些蛋白在卡介苗中缺失，因此能夠較好地區(qū)分卡介苗接種和結(jié)核分枝桿菌感染[13]。由于排除了卡介苗接種及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的影響，故T-SPOT.TB檢測(cè)的特異性和敏感性均較高。

3.3 T-SPOT.TB試驗(yàn)對(duì)脊柱結(jié)核的診斷價(jià)值

自英國(guó)Oxford Immunotec公司成功研制T-SPOT.TB試劑盒以來，已經(jīng)在多個(gè)國(guó)家獲準(zhǔn)用于結(jié)核病的診斷。目前國(guó)內(nèi)部分醫(yī)院及檢測(cè)機(jī)構(gòu)已采用該檢測(cè)方法輔助診斷肺結(jié)核，但對(duì)脊柱結(jié)核及骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷應(yīng)用仍較少[14-15]。本研究采用T-SPOT.TB試劑盒對(duì)確診的脊柱結(jié)核及非結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度為88%，特異度達(dá)到94%，明顯高于PPD皮試及抗結(jié)核抗體檢測(cè)，證實(shí)T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)脊柱結(jié)核也具有較高的輔助診斷價(jià)值。而在揭示檢測(cè)方法準(zhǔn)確性的參數(shù)中，陽性似然比、陰性似然比屬于能同時(shí)反映靈敏度和特異度的復(fù)合指標(biāo)，可全面體現(xiàn)篩檢試驗(yàn)的診斷價(jià)值，非常穩(wěn)定可靠；此外，似然比的計(jì)算只涉及到靈敏度與特異度，不受患病率的影響，因此是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的診斷性試驗(yàn)評(píng)估指標(biāo)。當(dāng)陽性似然比＞10或陰性似然比＜0.1時(shí)，診斷或排除某種疾病的可能性將顯著增加[16]。本研究中，T-SPOT.TB試驗(yàn)的陽性似然比為14.667、陰性似然比為0.126，而PPD皮試及抗結(jié)核抗體檢測(cè)的陽性似然比分別為2.176、3.222，陰性似然比分別為0.393、0.512，綜上結(jié)果可判定，T-SPOT.TB檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果更為真實(shí)可信。

3.4 T-SPOT.TB檢測(cè)特點(diǎn)

與傳統(tǒng)結(jié)核檢測(cè)方法比較，T-SPOT.TB具有以下優(yōu)點(diǎn)：①敏感性及特異性高：不受卡介苗接種及環(huán)境分枝桿菌干擾，亦不受機(jī)體免疫狀態(tài)的影響；②取樣簡(jiǎn)單：僅需抽取少量外周血；③診斷快速：24 h可報(bào)告結(jié)果。其不足之處在于：①不能有效區(qū)分潛伏感染、活動(dòng)性結(jié)核病及已治愈的結(jié)核病患者；②檢測(cè)結(jié)果不能明確結(jié)核感染的具體部位。

綜上所述，T-SPOT.TB試驗(yàn)檢測(cè)脊柱結(jié)核操作難度小，診斷快速，具有較高的靈敏度及特異度，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。結(jié)合患者臨床癥狀、體征、影像學(xué)資料及其他輔助檢查，該方法可脊柱結(jié)核感染的早期臨床診斷提供有力依據(jù)。

[1]全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(1):6-10.

[2]Xiao W,Jin GL.Advances in diagnosis and treatment of spinal tuberculosis medical recapitulate[J].Med Recapit,2012,18(14):2222.

[3]施建黨,王自立.非典型脊柱結(jié)核的早期診斷[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志,2010,20(5):432-434.

[4]董翔宇,申才良.脊柱結(jié)核治療方法研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(7):882-884.

[5] Richeldi L.An update on the diagnosis of tuberculosis infection[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,174(7):736-742.

[6]劉麗英,董小青,王丹敏.幾種常見的結(jié)核桿菌快速檢測(cè)方法[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,14(3):341-342.

[7]Kim SH,Song KH,Choi SJ,et a1.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients[J].Am J Med,2009,122(2):189-195.

[8]Tanabe M,Nakamura A,Arai A,et al.The direct comparison of two interferon-gamma release assays in the tuberculosis screening of Japanese healthcare workers[J].Intern Med,2017,56(7):773-779.

[9]王家良.臨床流行病學(xué):臨床科研設(shè)計(jì)、衡量與評(píng)價(jià)[M].3版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2010.

[10]傅俊偉,陳卓,吳俊彪,等.脊柱結(jié)核早期診斷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)骨傷,2015,28(1):82-84.

[11]Nicol MP,Davies MA,Wood K,et al.Comparison of T-SPOT.TB assay and tuberculin skin test for the evaluation ofyoung children athigh risk fortuberculosis in a community setting[J].Pediatrics,2009,123(1):38-43.

[12]Vassilopoulos D,Stamoulis N,Hadziyannis E,et al.Usefulness of enzyme-linked immunospot assay (Elispot)compared to tuberculin skin testing for latent tuberculosis screening in rheumatic patients scheduled for anti-tumor necrosis factor treatment[J].J Rheumatol,2008,35(7):1271-1276.

[13]Lee JY,Choi HJ,Park IN,et a1.Comparison of two commercial interferon-gamma assays for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection[J].Eur Respir J,2006,28(1):24-30.

[14]Wu X,Ma Y,Li D,et al.Diagnostic value of ELISPOT technique for osteoarticular tuberculosis[J].Clin Lab,2014,60(11):1865-1870.

[15]Yuan K,Zhong ZM,Zhang Q,et al.Evaluation of an enzyme-linked immunospot assay for the immunodiagnosis of atypical spinal tuberculosis(atypical clinical presentation/atypical radiographic presentation)in China[J].Braz J Infect Dis,2013,17(5):529-537.

[16]許汝福,熊鴻燕,李亞斐,等.診斷試驗(yàn)靈敏度與特異度似然比預(yù)測(cè)值的變化關(guān)系研究[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2008,21(5):574-576.