結(jié)核感染T細胞斑點試驗對脊柱結(jié)核的診斷價值

劉漢輝，李 輝，余嘉洪

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核中最常見的類型，其中脊柱結(jié)核占50%以上，尤以兒童與青少年多見[1]。早期診斷和早期治療能夠阻止脊柱結(jié)核病變的進一步發(fā)展，大大縮短療程，避免或減少畸形發(fā)生，甚至不用手術(shù)就能達到治愈目的[2]。但脊柱結(jié)核發(fā)病早期一般較隱匿，缺乏典型的臨床癥狀；加上近年來椎間盤型結(jié)核、單椎體中心型結(jié)核、非連續(xù)性結(jié)核等非典型性脊柱結(jié)核病例不斷增多，早期X線、CT及其他影像學(xué)檢查缺乏特異性，導(dǎo)致脊柱結(jié)核在早期易發(fā)生漏診或誤診[3]，延誤治療，引發(fā)脊柱畸形、截癱等嚴(yán)重后果。

結(jié)核病的傳統(tǒng)診斷手段包括結(jié)核菌素純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）皮試、血清結(jié)核抗體檢測、結(jié)核桿菌DNA PCR檢測、細菌學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、組織病理學(xué)檢查等[4]。結(jié)核菌素皮試試驗（tuberculin skin test，TST）臨床最為常用，但有較多缺陷[5]，在易受結(jié)核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低，而在普遍接種卡介苗的地區(qū)則出現(xiàn)非常高的假陽性率；其他幾種檢測手段因陽性率偏低、結(jié)果誤差較大或檢測技術(shù)要求高等原因，對脊柱結(jié)核的輔助診斷作用亦有限[6]。因此建立更加快速準(zhǔn)確的診斷方法，對于早期發(fā)現(xiàn)和診斷脊柱結(jié)核至關(guān)重要。近年來出現(xiàn)的結(jié)核感染T細胞斑點（T-cell spot of tuberculosis，T-SPOT.TB）試驗是診斷結(jié)核感染的新方法，在國外已廣泛應(yīng)用于結(jié)核感染的診斷[7-8]。本研究應(yīng)用T-SPOT.TB試劑盒對經(jīng)確診的脊柱結(jié)核及非結(jié)核患者進行檢測，并與其他常規(guī)檢測方法進行比較，目的在于評估T-SPOT.TB檢測對于脊柱結(jié)核的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年12月佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科收治并確診的脊柱結(jié)核及非結(jié)核患者各50例。結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查符合脊柱結(jié)核的特征；②術(shù)前或術(shù)中活檢病灶標(biāo)本涂片或細菌培養(yǎng)結(jié)果證實存在結(jié)核分枝桿菌，或病理檢查符合結(jié)核改變；③抗結(jié)核治療少于2周。排除合并脊柱外結(jié)核病例。非結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無結(jié)核患者接觸史；②影像學(xué)檢查無結(jié)核表現(xiàn)；③排除結(jié)核分枝桿菌感染及診斷不明的脊柱疾病。

結(jié)核組患者男31例，女19例，年齡9～43歲，平均年齡35.3歲；其中頸椎結(jié)核8例、胸椎結(jié)核23例、腰椎結(jié)核19例。非結(jié)核組患者中男28例，女22例，年齡13～56歲，平均年齡41.8歲；其中化膿性感染21例、轉(zhuǎn)移瘤16例、多發(fā)性骨髓瘤9例、布魯氏菌病4例。

1.2 檢測方法

1.2.1 PPD皮試 抽取結(jié)核菌素皮試液0.1 mL（5 IU）于受試者左前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射，注射后72 h硬結(jié)的橫徑與縱徑平均值≥5 mm為陽性、＜5 mm為陰性。

1.2.2抗結(jié)核抗體檢測 抽取受試者3 mL外周血，采用結(jié)核桿菌抗體檢測試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司）及全自動生化檢測儀進行抗結(jié)核抗體檢測，并記錄檢測結(jié)果。

1.2.3 T-SPOT.TB檢測 分別抽取受試者3～4 mL外周抗凝血，以淋巴細胞分層液分離、提純外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），調(diào)節(jié)細胞濃度至2.5×106/L。在4個檢測孔內(nèi)加入不同的對照物：陰性對照孔加入細胞培養(yǎng)液50 μL；陽性質(zhì)控對照孔加入陽性對照植物血細胞凝集素50 μL；2個測試孔A孔和B孔分別加入結(jié)核桿菌混合多肽A（ESAT-6抗原）和混合多肽B（CFP-10抗原）各50 μL。分別在上述孔內(nèi)加入100 μL 2.5×106/mL的PBMC。將微孔板放入（37±1）℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育l6～20 h。洗板后加入配制的標(biāo)記抗體工作液50 μL，于2～8℃下孵育60 min；再次洗板后加入底物溶液50 μL，于室溫中顯色反應(yīng)7 min，洗滌各孔、終止反應(yīng)，孔內(nèi)可見深藍色清晰斑點。將微孔板避光置于通風(fēng)環(huán)境或37℃溫箱中干燥，采用ELISPOT斑點計數(shù)并加以記錄。

T-SPOT.TB試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：①陽性結(jié)果：當(dāng)空白對照孔≤5 SFCs（斑點形成細胞數(shù)）時，（A孔－空白對照孔）或（B孔－空白對照孔）≥6 SFCs；當(dāng)空白對照孔≥6 SFCs時，A孔或B孔細胞數(shù)≥空白對照孔2倍；②陰性結(jié)果：（A孔－空白對照孔）或（B孔-空白對照孔）＜6 SFCs且陽性對照孔≥20 SFCs；③不確定結(jié)果：（A孔－空白對照孔）或（B孔－空白對照孔）＜6 SFCs且陽性對照＜20 SFCs，建議重新送檢；④技術(shù)誤差：當(dāng)空白對照孔≥10 SFCs時建議重新送檢。

1.3 檢測指標(biāo)

根據(jù)檢測結(jié)果統(tǒng)計3種檢測方法診斷脊柱結(jié)核的敏感度（真陽性率，Se）、特異度（真陰性率，Sp）、陽性似然比（+LR）及陰性似然比（－LR）；對脊柱結(jié)核組3種診斷方法的檢測結(jié)果進行比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 結(jié)果判定

當(dāng)Se、Sp分別＞80%，可判定該檢測方法對脊柱結(jié)核的輔助診斷價值較高；+LR＞10或－LR＜0.1，可判定其檢測結(jié)果真實可信，+LR越大或－LR越小，檢測結(jié)果可信度則越高[9]。

2 結(jié)果

3種診斷方法對脊柱結(jié)核的檢測結(jié)果見表1，表2提示T-SPOT.TB檢測的Se、Sp、+LR、－LR明顯優(yōu)于其他兩種常規(guī)檢測方法。對脊柱結(jié)核組T-SPOT.TB試驗與其他兩種診斷方法的檢測結(jié)果進行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

3 討論

3.1 診斷脊柱結(jié)核的傳統(tǒng)方法

表1 3種檢測方法診斷脊柱結(jié)核的結(jié)果比較（n=50，例）

表2 3種檢測方法敏感度、特異度、陽性似然比和陰性似然比的比較（n=50）

結(jié)核菌培養(yǎng)是目前臨床診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但敏感性太低，對結(jié)核菌培養(yǎng)的實驗室條件及工作人員的素質(zhì)要求也較高，在基層醫(yī)院較難開展。組織病理學(xué)檢測方法對脊柱結(jié)核的診斷陽性率亦只有40%左右[10]。原因可能是脊柱結(jié)核病變位置較深，組織標(biāo)本取材難度較高；此外，結(jié)核病變早期呈非特異性炎癥反應(yīng)，而特異性干酪性壞死及結(jié)核結(jié)節(jié)樣壞死在疾病晚期才出現(xiàn)，因此限制了其對脊柱結(jié)核的早期診斷。

表3 脊柱結(jié)核組T-SPOT.TB檢測與結(jié)核菌素PPD皮試、抗核抗體檢測的比較（n=50，例）

3.3 T-SPOT.TB檢測原理

結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以細胞免疫為主。作為免疫應(yīng)答的一部分，T細胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化的效應(yīng)T淋巴細胞，包括CD4和CD8。將這些活化的效應(yīng)T淋巴細胞從全血中單獨分離出來，在體外受特異抗原刺激并計數(shù)；在細胞分泌的細胞因子擴散稀釋前，ELISPOT技術(shù)能夠立即捕獲細胞周圍所分泌的細胞因子，可以檢測出1/10 000～1/50 000 PBMC中經(jīng)結(jié)核菌抗原刺激后釋放γ-干擾素的細胞，其靈敏度遠超傳統(tǒng)的檢測方法[11-12]。

而T-SPOT.TB試驗是一種以ELISPOT技術(shù)檢測結(jié)核感染的新方法，其對每個活化的結(jié)核特異效應(yīng)T細胞進行計數(shù)，操作更加簡單。該方法使用的抗原是結(jié)核分枝桿菌RD1和RD16區(qū)編碼的蛋白，這些蛋白在卡介苗中缺失，因此能夠較好地區(qū)分卡介苗接種和結(jié)核分枝桿菌感染[13]。由于排除了卡介苗接種及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的影響，故T-SPOT.TB檢測的特異性和敏感性均較高。

3.3 T-SPOT.TB試驗對脊柱結(jié)核的診斷價值

自英國Oxford Immunotec公司成功研制T-SPOT.TB試劑盒以來，已經(jīng)在多個國家獲準(zhǔn)用于結(jié)核病的診斷。目前國內(nèi)部分醫(yī)院及檢測機構(gòu)已采用該檢測方法輔助診斷肺結(jié)核，但對脊柱結(jié)核及骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷應(yīng)用仍較少[14-15]。本研究采用T-SPOT.TB試劑盒對確診的脊柱結(jié)核及非結(jié)核患者進行檢測，靈敏度為88%，特異度達到94%，明顯高于PPD皮試及抗結(jié)核抗體檢測，證實T-SPOT.TB檢測對脊柱結(jié)核也具有較高的輔助診斷價值。而在揭示檢測方法準(zhǔn)確性的參數(shù)中，陽性似然比、陰性似然比屬于能同時反映靈敏度和特異度的復(fù)合指標(biāo)，可全面體現(xiàn)篩檢試驗的診斷價值，非常穩(wěn)定可靠；此外，似然比的計算只涉及到靈敏度與特異度，不受患病率的影響，因此是一個相對獨立的診斷性試驗評估指標(biāo)。當(dāng)陽性似然比＞10或陰性似然比＜0.1時，診斷或排除某種疾病的可能性將顯著增加[16]。本研究中，T-SPOT.TB試驗的陽性似然比為14.667、陰性似然比為0.126，而PPD皮試及抗結(jié)核抗體檢測的陽性似然比分別為2.176、3.222，陰性似然比分別為0.393、0.512，綜上結(jié)果可判定，T-SPOT.TB檢測的試驗結(jié)果更為真實可信。

3.4 T-SPOT.TB檢測特點

與傳統(tǒng)結(jié)核檢測方法比較，T-SPOT.TB具有以下優(yōu)點：①敏感性及特異性高：不受卡介苗接種及環(huán)境分枝桿菌干擾，亦不受機體免疫狀態(tài)的影響；②取樣簡單：僅需抽取少量外周血；③診斷快速：24 h可報告結(jié)果。其不足之處在于：①不能有效區(qū)分潛伏感染、活動性結(jié)核病及已治愈的結(jié)核病患者；②檢測結(jié)果不能明確結(jié)核感染的具體部位。

綜上所述，T-SPOT.TB試驗檢測脊柱結(jié)核操作難度小，診斷快速，具有較高的靈敏度及特異度，檢測結(jié)果真實可靠。結(jié)合患者臨床癥狀、體征、影像學(xué)資料及其他輔助檢查，該方法可脊柱結(jié)核感染的早期臨床診斷提供有力依據(jù)。

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