CD34、MMP-9、VEGF、PCNA在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

彭仲華，梁亮科

骨巨細(xì)胞瘤（giant cell tumor of bone，GCTB）是一類臨床常見的骨腫瘤，多見于20～40歲人群，女性發(fā)病率高于男性[1]。大多數(shù)GCTB為良性腫瘤，25%～50%的患者治療后復(fù)發(fā)，少數(shù)進(jìn)展轉(zhuǎn)移至肺部，一些患者復(fù)發(fā)或放療后轉(zhuǎn)為惡性[2]。近年來腫瘤病因機(jī)制的研究成果表明，腫瘤血管生成與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[3-4]，尋找合適的腫瘤分子標(biāo)志物將有助于進(jìn)一步闡明腫瘤的生物學(xué)行為。CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，具有高再現(xiàn)性和穩(wěn)定性；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）可間接降解膠原蛋白，標(biāo)記后可用于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖[5-6]；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）可以較好地反映細(xì)胞的增殖功能，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)及惡性潛能的重要指標(biāo)[7]；而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進(jìn)血管生長，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8]。本文旨在觀察CD34、MMP-9、VEGF、PCNA在GCTB組織中的表達(dá)水平，分析其與患者年齡、性別、腫瘤大小、Jaffe分級(jí)及預(yù)后的相關(guān)性，為GCTB的診斷與治療提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集佛山市中醫(yī)院三水醫(yī)院及佛山市中醫(yī)院2010年1月至2017年1月收治的80例GCTB患者的臨床資料，其中男38例，女42例。平均年齡34歲（12～60歲）。腫瘤組織取材部位：脊柱7例、尺骨2例、橈骨6例、骶骨11例、股骨24例、脛骨14例、髖骨8例、指骨8例。所有腫瘤組織均經(jīng)活檢明確診斷為GCTB，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色。根據(jù)Jaffe分級(jí)[9]：Ⅰ級(jí)26例、Ⅱ級(jí)42例、Ⅲ級(jí)12例。

1.2 試驗(yàn)材料、儀器和試劑

免疫組化染色試劑盒；濃縮型DAB試劑盒；PBS；抗原修復(fù)液；HE染色試劑盒；CD34鼠抗人單克隆抗體、VEGF兔抗人單克隆抗體、PCNA鼠抗人多克隆抗體、MMP-9兔抗人多克隆抗體。以上試劑均由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.3 檢測(cè)方法

將石蠟包埋的切片脫蠟脫水，PBS洗滌3次（2 min/次），獲取抗原。PBS洗滌3次（5 min/次），3%過氧化氫室溫下洗滌切片15 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后再次用PBS洗滌3次（5 min/次）。室溫下將其滴入5%山羊血清封閉溶液中靜止30 min，除去多余液體。加入CD34（1∶100）、MMP-9（1∶100）、VEGF（1∶100）、PCNA（1∶100）抗體，4 ℃下保存過夜，37℃下孵育1 h后PBS洗滌3次（5 min/次），滴加生物素化二抗及過氧化物酶標(biāo)記的抗體。PBS洗滌切片（3次，5 min/次），DAB試劑染色并在顯微鏡下觀察。最后洗滌5～15 min終止顯色反應(yīng)，蘇木精-伊紅染色并計(jì)數(shù)。每張切片在高倍鏡下觀察5個(gè)不同視野內(nèi)的細(xì)胞染色情況，以胞漿或胞膜淺黃色或棕黃色為陽性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。計(jì)數(shù)資料以例表示，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。CD34與MMP-9、VEGF、PCNA表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD34、MMP-9、VEGF及PCNA在GCTB組織中的表達(dá)

2.1.1 CD34如圖1所見，CD34陽性表達(dá)物（棕黃色表示陽性染色）定位于腫瘤間質(zhì)小血管及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中。

2.1.2 MMP-9 MMP-9呈胞漿著色，陽性物質(zhì)呈棕黃色，在GCTB中高表達(dá)，主要表達(dá)在多核巨細(xì)胞，部分單核基質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)（圖2）。

2.1.3 VEGF VEGF在GCTB中高表達(dá)，主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)小血管及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中（圖3）。

2.1.4 PCNA如圖4所示，PCNA陽性表達(dá)于單核間質(zhì)細(xì)胞的胞核內(nèi)（棕黃色表示陽性染色）。

2.2 CD34、MMP-9、VEGF、PCNA的表達(dá)水平與GCTB臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系

CD34、MMP-9、VEGF、PCNA的陽性表達(dá)水

圖1 CD34在骨巨細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)（免疫組化染色×200）

圖2 基質(zhì)金屬蛋白酶-9在骨巨細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)（免疫組化染色×200）

圖3 血管內(nèi)皮生長因子在骨巨細(xì)胞瘤組織中的表達(dá) 3A免疫組化染色×200 3B免疫組化染色×400

對(duì)于GCTB而言，病理學(xué)評(píng)分和影像學(xué)表現(xiàn)平與GCTB患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性（P＞0.05），與腫瘤大小、Jaffe分級(jí)、預(yù)后之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），見表1～4。

2.3 CD34與MMP-9、VEGF、PCNA表達(dá)的相關(guān)性

CD34與MMP-9、VEGF、PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.311，0.424，0.401；P=0.015，0.025，0.025），提示CD34可能通過某種途徑調(diào)控或影響GCTB患者M(jìn)MP-9、VEGF和PCNA的表達(dá)水平。

3 討論

GCTB屬于局部侵襲性腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，生物學(xué)行為往往與組織學(xué)外觀不一致。在對(duì)GCTB病因機(jī)制的研究中，人們發(fā)現(xiàn)GCTB的生長和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)，因此，從分子水平深入探究腫瘤血管生成相關(guān)基因和蛋白產(chǎn)物表達(dá)水平，可為診斷和治療GCTB提供了新思路、新策略[10-11]。

3.1 CD34、VEGF、MMP-9以及PCNA在GCTB發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義

并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，因此，研究CD34等細(xì)胞因子表達(dá)水平與GCTB臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系，對(duì)于指導(dǎo)GCTB手術(shù)方案、正確評(píng)估患者術(shù)后轉(zhuǎn)歸具有重要的臨床意義。

圖4 增殖細(xì)胞核抗原在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)（免疫組化染色×200）

表1 CD34表達(dá)水平與GCTB臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系（例）

表2 MMP-9表達(dá)水平與GCTB臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系（例）

表3 VEGF表達(dá)水平與GCTB臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系（例）

3.1.1 CD34 CD34屬于高度糖基化的Ⅰ型膜蛋白，在人造血干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面選擇性表達(dá)[12-13]，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[10]。其常與VEGF一起被用于腫瘤血管的研究。

3.1.2 VEGF作為血管生成的重要激活劑，VEGF可促進(jìn)新生血管的形成[14-15]，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。目前的研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和血行轉(zhuǎn)移均與腫瘤新生血管的形成有關(guān)，而VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移中起到了積極的促進(jìn)作用。

表4 PCNA表達(dá)水平與GCTB臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系（例）

王華等[16]對(duì)69例GCTB患者進(jìn)行隨訪研究，結(jié)果提示，CD34、VEGF與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)；葉恒志等[17]亦指出，VEGF、MMP-9的表達(dá)與GCTB的血管生成、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)；韓躍虎等[18]也有類似發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為VEGF、PCNA和MMPs與GCTB腫瘤大小、Jaffe分級(jí)、預(yù)后之間均存在顯著相關(guān)性。

3.1.3 MMP-9 MMP是金屬蛋白酶家族中的一員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白和膠原成分，破壞正常的組織學(xué)屏障，在腫瘤浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色，因此與腫瘤的臨床進(jìn)展及預(yù)后顯著相關(guān)[5]。其中MMP-9主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及炎癥因子合成或分泌，生理狀態(tài)下參與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝過程，并在骨組織改建、胚胎發(fā)育、損傷愈合及機(jī)體排異反應(yīng)等生理過程中發(fā)揮作用，而其異?；罨瘯r(shí)常導(dǎo)致病理改變，除可降解細(xì)胞外基質(zhì)，還能釋放具有生物學(xué)活性的VEGF[19-20]。

Lozonschi等[21]指出MMP-9具有間接調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的作用；Kumta等[10]則發(fā)現(xiàn)MMP-9在GCTB細(xì)胞中明顯上調(diào)。Han等[13]的研究結(jié)果揭示GCTB患者M(jìn)MPs表達(dá)水平與Jaffe分級(jí)關(guān)系密切；Zhou等[5]則發(fā)現(xiàn)，CD34和MMP-9與GCTB患者微血管密度（microvessel density，MVD）值呈明顯正相關(guān)，且與惡性程度分級(jí)密切相關(guān)。MMP-9與GCTB局部復(fù)發(fā)的相關(guān)性目前也得到了有關(guān)研究的證實(shí)[13]。這些觀點(diǎn)與我們的研究結(jié)果相一致，MMP-9與GCTB患者性別、年齡無關(guān)，而與腫瘤大小、Jaffe分級(jí)、預(yù)后之間存在顯著相關(guān)性。

3.1.4 PCNA PCNA是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可以反映腫瘤組織的細(xì)胞代謝水平以及腫瘤DNA、RNA的合成情況，其過度表達(dá)可提示腫瘤細(xì)胞分化、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后等生物學(xué)過程[13]。Saxena等[22]的研究結(jié)果提示，復(fù)發(fā)組（25例）GCTB患者較原發(fā)組PCNA增殖指數(shù)有明顯增加，提示更高的細(xì)胞增殖水平與GCTB復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究結(jié)果也證實(shí)了PCNA與GCTB腫瘤分級(jí)及預(yù)后之間存在相關(guān)性。

3.2 GCTB患者腫瘤組織CD34與VEGF、MMP-9、PCNA表達(dá)水平的相關(guān)性

我們的研究結(jié)果顯示，CD34與GCTB腫瘤組織中MMP-9、VEGF、PCNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)，而GCTB的生長和轉(zhuǎn)移又與血管生成密切相關(guān)，因此推測(cè)CD34可能通過某種途徑調(diào)控或影響MMP-9、VEGF、PCNA表達(dá)，最終介導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤的新生血管形成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和腫瘤邊緣的進(jìn)展，提示在臨床上檢測(cè)上述指標(biāo)有助于判斷腫瘤的侵襲性。

總之，CD34、MMP-9、VEGF、PCNA在GCTB的發(fā)生發(fā)展中擔(dān)負(fù)著重要作用，其表達(dá)水平可作為輔助診斷、評(píng)估腫瘤惡性程度及評(píng)價(jià)預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

[1]胥少汀,葛寶豐,徐印坎.實(shí)用骨科學(xué)[M].4版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2012

[2] Skubitz KM.Giant cell tumor of bone:current treatment options[J].Curr Treat Options Oncol,2014,15(3):507-518.

[3]Sobti A,Agrawal P,Agarwala S,et al.Giant cell tumor of bone:an overview[J].Arch Bone Jt Surg,2016,4(1):2-9.

[4] Li C,Zheng X,Ghert M,et al.Expressions and clinical significance of factors related to giant cell tumor of bone[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(12):22509-22514.

[5] Zhou X,Liu XZ,Fan GT,et al.Expression of matrix metalloproteinase-9 and CD34 in giant cell tumor of bone[J].Orthop Surg,2016,8(2):220-225.

[6]Mak IW,Seidlitz EP,Cowan RW,et al.Evidence for the role of matrix metalloproteinase-13 in bone resorption by giant cell tumor of bone[J].Hum Pathol,2010,41(9):1320-1329.

[7]Byrne-Steele ML,Ng JD.Expression,purification and preliminary X-ray analysis of proliferating cell nuclear antigen from the archaeon thermococcusthioreducens[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun,2009,65(Pt 9):906-909.

[8]Andisheh-Tadbir A,Hamzavi M,Rezvani G,et al.Tissue expression,serum and salivary levels of vascular endothelial growth factor in patients with HNSCC [J].Braz J Otorhinolaryngol,2014,80(6):503-507.

[9]Jaffe HL,Lichtenstein L,Portis RB.Giant cell tumor of the bone:its pathological appearance,grading,supposed variant and treatment[J].Arch Pathol,1940,30:993-995.

[10]Kumta SM,Huang L,Cheng YY,et al.Expression of VEGF and MMP-9 in giant cell tumor of bone and other osteolytic lesions[J].Life Sci,2003,73(11):1427-1436.

[11]Fu S,Bai R,Zhao Z,et al.Overexpression of hypoxiainducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in sacral giant cell tumors and the correlation with tumor microvessel density[J].Exp Ther Med,2014,8(5):1453-1458.

[12]Susarla SM,August M,Dewsnup N,et al.CD34 staining density predicts giant cell tumor clinical behavior[J].J Oral Maxillofac Surg,2009,67(5):951-956.

[13]Han YH,Gao B,Huang JH,et al.Expression of CD147,PCNA,VEGF,MMPs and their clinical significance in the giant cell tumor of bones[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(7):8446-8452.

[14]Zhang J,Dong J,Yang Z,et al.Expression of ezrin,CD44,and VEGF in giant cell tumor of bone and its significance[J].World J Surg Oncol,2015,13:168.

[15]Zheng MH,Xu J,Robbins P,et al.Gene expression of vascular endothelial growth factor in giant cell tumors of bone[J].Hum Pathol,2000,31(7):804-812.

[16]王華,顧潔夫,蔡林,等.血管內(nèi)皮生長因子與骨巨細(xì)胞瘤預(yù)后的關(guān)系[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,26(4):517-519.

[17]葉恒志,張其亮,揚(yáng)樹華.骨巨細(xì)胞瘤MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)及其意義[J].腫瘤學(xué)雜志,2004,10(5):320-322.

[18]韓躍虎,楊柳,黃景輝,等.CD147、PCNA、VEGF和MMPs在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義[J].中國骨與關(guān)節(jié)外科,2012,5(1):65-71.

[19]曾弘,文劍明,李海剛,等.骨巨細(xì)胞瘤中MMP-9和TIMP-3的表達(dá)及臨床意義[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2009,30(1):74-77.

[20]李穎智,金海鴻,秦悅洋,等.VEGF、MMP-9表達(dá)水平與骨巨細(xì)胞瘤侵襲性相關(guān)性[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2013,17(11):1989-1991.

[21]Lozonschi L,Sunamura M,Kobari M,et al.Controlling tumor angiogenesis and metastasis of C26 murine colon adenocarcinoma by a new matrix metalloproteinase inhibitor,KB-R7785,in two tumor models[J].Cancer Res,1999,59(6):1252-1258.

[22]Saxena CC,Safaya R,Kawatra Madan N,et al.Histopathological,immunohistochemical,and image analytic parameters characterizing the stromal component in primary and recurrent giant cell tumor of bone[J].J Clin Orthop Trauma,2016,7(2):109-114.