鹽地堿蓬葉中可溶性膳食纖維的提取與抗氧化活性

薛菲+劉順剛+張祥勝

摘要：以鹽地堿蓬葉為試材，采用雙酶法從中提取可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)研究不同提取條件對(duì)堿蓬葉中SDF提取率的影響；通過測定羥自由基清除率、還原力和DPPH自由基清除率鑒定其抗氧化性。結(jié)果表明，雙酶法提取SDF的最佳工藝條件為料液比1 g ∶25 mL、木瓜蛋白酶用量16%、酶解時(shí)間3 h、酶解溫度55 ℃、糖化酶用量1.0%；提取液具有顯著的羥自由基清除率、DPPH自由基清除能力和鐵還原力。

關(guān)鍵詞：鹽地堿蓬葉；可溶性膳食纖維；抗氧化；正交試驗(yàn)；提取工藝

中圖分類號(hào)： TS201.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0175-03

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）為藜科、堿蓬屬草本植物，別稱鹽蓬、黃須菜、鹽蒿，是典型的鹽地指示植物。幼苗可作蔬菜，種子可榨油。富含不飽和脂肪酸、維生素和微量元素，具有降糖、降壓、擴(kuò)張血管、防治心臟病和增強(qiáng)人體免疫力等藥用效能[1]。膳食纖維一般指包含纖維素、半纖維素、樹脂、果膠及木質(zhì)素等成分，在人體中不易被消化吸收的多糖類食物成分，主要存在于植物的細(xì)胞壁中。根據(jù)膳食纖維的溶解性不同，它包括可溶性膳食纖維（SDF）和不溶性膳食纖維（IDF）[2-3]。膳食纖維對(duì)人的生理具有積極的促進(jìn)作用，包括通便、降血脂、降血糖等[4]。近年來，對(duì)鹽地堿蓬葉化學(xué)成分方面的研究，主要為無機(jī)元素，而有機(jī)成分僅限于對(duì)其營養(yǎng)成分和總黃酮提取測定方面的研究，關(guān)于其中SDF提取工藝及其抗氧化活性方面極少，因此，本試驗(yàn)主要研究鹽地堿蓬葉中SDF的提取條件，通過優(yōu)化條件，獲得最高提取率，并通過不同方法評(píng)價(jià)其提取物的抗氧化性，旨在為鹽地堿蓬葉作為天然抗氧化劑來源的可行性開發(fā)提供前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試堿蓬葉，采摘于江蘇省鹽城市灘涂自然保護(hù)區(qū)。供試藥劑有木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g），江蘇銳陽生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鹽地堿蓬葉中SDF提取工藝流程 堿蓬葉干燥至恒質(zhì)量→粉碎→過篩（40目）→稱取樣品1 g→加磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH值為6.6）溶解、調(diào)pH值至7.0→加入植物蛋白酶酶解→滅酶（100 ℃，5 min）→調(diào)pH值至4.0～4.6、加入糖化酶、酶解（酶解溫度60 ℃）→滅酶（100 ℃，5 min）→（用2層紗布過濾）離心（9 000 r/min，4 min）取濾液濃縮至 5 mL→醇析（4倍體積95%熱乙醇）→離心（9 000 r/min，4 min）、取濾渣、洗滌濾渣（用丙酮、78%乙醇）→干燥至恒質(zhì)量，即得SDF，計(jì)算SDF提取率[4-5]。

1.2.2 SDF提取率的計(jì)算 SDF提取率=[提取所得的SDF質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）]×100%。

1.2.3 鹽地堿蓬葉SDF提取條件優(yōu)化 選取對(duì)SDF提取率有影響的料液比、植物蛋白酶酶解時(shí)間、植物蛋白酶添加量、植物蛋白酶酶解溫度、糖化酶添加量等5個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，做5因素4水平的正交試驗(yàn)，考察其對(duì)SDF提取率的影響（表1）。

1.2.4 鹽地堿蓬葉中SDF提取物抗氧化活性研究

1.2.4.1 羥自由基清除率的測定 羥自由基的清除能力是體外常用的評(píng)估抗氧化方法之一[6]。本試驗(yàn)采用紫外分光光度法，取9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，加入不同濃度的SDF提取液1 mL，靜置30 min，用蒸餾水作空白對(duì)照，510 nm處測量其吸光度，代入以下公式計(jì)算[7-8]：

清除率=[1-（D1-D2）/D3]×100%。

式中：D1表示加了樣液的吸光度；D2表示不加顯色劑的樣液的本底吸光度，是為了減去樣液本身顏色對(duì)于試驗(yàn)的影響；D3表示以蒸餾水代替樣液的空白管的吸光度。

1.2.4.2 還原力的測定 取1 mL不同濃度的SDF提取液分別置于試管中，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為6.6）0.2 mL和1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL，50 ℃水浴 20 min，快速冷卻后加入10%三氯乙酸溶液1 mL，以 2 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液1.5 mL，加入3 mL蒸餾水和0.1% FeCl3溶液1 mL，以蒸餾水作為空白對(duì)照，充分混勻，靜置10 min后，在700 nm下測定其吸光度值D[9]。

1.2.4.3 DPPH自由基清除率的測定 取不同料液比的SDF提取液各1.0 mL加入試管中，加含0.057 mg/mL DPPH自由基的乙醇溶液1.0 mL，置于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水作為空白，計(jì)算清除率[10-11]。

清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。

式中：Di表示1 mL提取液+1 mL DPPH溶液的吸光度；Dj表示1 mL提取液+1 mL無水乙醇的吸光度；D0表示1 mL DPPH+1 mL無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)SDF提取率的影響 設(shè)定植物蛋白酶添加量12%，稱取1 g樣品，在50 ℃下酶解4 h，糖化酶添加量 1.0%，分別按照料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g ∶mL）提取SDF，考察料液比對(duì)SDF提取率的影響（圖1）。

由圖1可知，隨著溶劑的量的增大，SDF提取率先上升后下降，且在1 g ∶15 mL處時(shí)提取率最高，為16.21%。因此，確定設(shè)計(jì)料液比在1 g ∶15 mL左右為宜?？赡苁且?yàn)槿軇┻^少時(shí)溶解度低，反應(yīng)體系較為黏稠，酶與底物接觸不夠充分；但當(dāng)溶劑過多時(shí)，底物濃度過低，酶被稀釋，使底物與酶之間的結(jié)合受阻，因此SDF提取率隨著溶劑的量的增大呈先升后降的趨勢。

2.1.2 植物蛋白酶添加量對(duì)SDF提取率的影響 設(shè)定料液比為1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%，分別按8%、12%、16%、20%、24%的植物蛋白酶添加量，50 ℃下酶解4 h，計(jì)算SDF提取率（圖2）。由圖2可知，隨著植物蛋白酶添加量的提高，SDF提取率先增加后降低，且在添加量為16%時(shí)，達(dá)到最大提取率 18.66%?？赡苁且?yàn)橹参锏鞍酌冈黾雍?，使底物與酶反應(yīng)更徹底，所以SDF提取率越來越高；而繼續(xù)增加植物蛋白酶量時(shí)，過多的酶反而抑制了反應(yīng)的進(jìn)行，致使SDF提取率反而降低。所以植物蛋白酶添加量在16%時(shí)最佳。

2.1.3 植物蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響 設(shè)定料液比為1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%， 植物蛋白酶添加量16%，酶解溫度50 ℃，分別酶解2、3、4、5、6 h，計(jì)算SDF提取率（圖3）。由圖3可知，隨著植物蛋白酶酶解時(shí)間的增加，SDF提取率先增加后降低，且在3 h時(shí)SDF提取率最大，為21.15%?？赡苁且?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，堿蓬葉中的SDF被充分提取出來，而隨著時(shí)間越來越長，SDF暴露在空氣中被氧化，提取量反而減少。因此蛋白酶酶解時(shí)間3 h為最佳提取條件。

2.1.4 植物蛋白酶酶解溫度對(duì)SDF提取率的影響 設(shè)定料液比為1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%，植物蛋白酶添加量16%，酶解3 h，分別于40、45、50、55、60 ℃對(duì)蛋白酶進(jìn)行酶解提取SDF，考察植物蛋白酶酶解溫度對(duì)SDF提取率的影響（圖4）。由圖4可知，隨著酶解溫度的提高，SDF提取率先增加后降低，且在50 ℃時(shí)最大，達(dá)19.29%?？赡苁且?yàn)殡S著酶解溫度提高，植物蛋白酶的活性也越來越高，從而SDF的提取率增加，而當(dāng)酶解溫度超過最適溫度后，蛋白酶漸漸失活，提取率也降低。所以50 ℃為適宜的蛋白酶酶解溫度。

2.1.5 糖化酶添加量對(duì)SDF提取率的影響 設(shè)定料液比為1 g ∶15 mL，植物蛋白酶添加量15%，50 ℃酶解3 h，分別加入糖化酶0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，考察其添加量對(duì)SDF提取率的影響（圖5）。由圖5可知，隨著糖化酶添加量的提高，SDF提取率先增加后降低，且當(dāng)添加量為1.0%時(shí)，提取率達(dá)到19.68%。因此，確定糖化酶添加量在1.0%時(shí)為最佳提取條件。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，因?yàn)镽A>RB>RC>RD>RE，所以各因素對(duì)SDF提取率影響的大小依次為A>B>C>D>E，各種因素的k值表明各因素水平的影響程度分別是A4>A3>A2>A1，B3>B4>B2>B1，C2>C4>C3>C1，D3>D4>D1>D2，E3>E4>E2>E1，各因素水平的最佳組合為A4B3C2D3E3，即堿蓬葉中SDF提取的最佳條件為料液比1 g ∶25 mL，植物蛋白酶添加量為16%，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為55 ℃，糖化酶添加量為 1.0%。

2.3 鹽地堿蓬葉中SDF的抗氧化作用

2.3.1 羥自由基清除率的測定 不同料液比的SDF提取液對(duì)羥自由基的清除作用見圖6。由圖6可知，料液比分別為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g ∶mL）的提取液清除自由基時(shí)，它的羥自由基清除率隨著料液比的增加而降低，與樣品的濃度呈正相關(guān)，當(dāng)樣品濃度達(dá)到一定程度時(shí)，羥自由基清除率將趨于穩(wěn)定，這與張志旭等的研究結(jié)果[12]一致。

2.3.2 還原力的測定 對(duì)不同料液比的SDF提取液測其吸光度，吸光度D值越大，表示還原力越強(qiáng)，其相應(yīng)的還原力測定值見圖7。由圖7可知，隨著料液比的增加，它的吸光值呈下降趨勢，說明鹽地堿蓬葉中可溶性膳食纖維隨著料液比的增加還原力降低。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，根據(jù)吸光度的變化可測得樣品中清除率的大小[13]。不同料液比的SDF提取液其對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖8。由圖8可知，不同料液比的SDF溶液對(duì)DPPH自由基清除能力呈正相關(guān)關(guān)系，隨著料液比的增加，DPPH自由基清除率越小。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)以鹽地堿蓬葉中的SDF提取率為指標(biāo)，采取單因素試驗(yàn)，確定單因素的合適范圍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，各因素水平的最佳組合為A4B3C2D3E3，即堿蓬葉中SDF提取的最佳條件為料液比 1 g ∶25 mL，植物蛋白酶添加量為16%，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為55 ℃，糖化酶添加量為1.0%。通過羥自由基清除率、還原力和DPPH自由基清除率鑒定其提取液的抗氧化性，提取液具有顯著的羥自由基清除率、DPPH自由基清除能力和鐵還原力，為其作為功能性食品開發(fā)提供了參考。

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