黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧后自噬性損傷相互作用的研究

丁 煌，李靜嫻，唐 標(biāo)，劉曉丹，李 玲，唐映紅，鄧常清，黃小平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧后自噬性損傷相互作用的研究

丁 煌，李靜嫻，唐 標(biāo)，劉曉丹，李 玲，唐映紅，鄧常清，黃小平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

目的 探討黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬性損傷的影響及其相互作用。方法 以PC12細(xì)胞建立OGD/R自噬性損傷模型，分別設(shè)立黃芪甲苷和人參皂苷Rg1不同劑量，藥物干預(yù)細(xì)胞后，以激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬體評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞自噬性損傷的作用，并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration, IC50)。以黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的IC50為1個(gè)劑量單位，按Isobologram法分別設(shè)立黃芪甲苷與人參皂苷Rg1不同比例(1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1)的配伍，研究藥物對(duì)細(xì)胞自噬的影響，計(jì)算各比例配伍的IC50，采用Isobologram及95%可信區(qū)間和相互作用指數(shù)γ分析黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抑制自噬的相互作用性質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，以黃芪甲苷與人參皂苷Rg1的IC50劑量進(jìn)行1 ∶1配伍，以細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)漏出率、自噬體數(shù)量及p62蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)藥物配伍對(duì)細(xì)胞損傷和細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1抑制自噬的IC50及其95%可信區(qū)間分別為(27.22±0.614)mg·L-1[25.96, 29.03]、(13.68±1.334)mg·L-1[10.27, 16.95]。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在1 ∶1配伍時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，而黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在1 ∶2和2 ∶1配伍時(shí)，呈拮抗作用。以黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的IC50劑量進(jìn)行1 ∶1配伍驗(yàn)證，結(jié)果顯示單用黃芪甲苷和人參皂苷Rg1以及配伍均能增強(qiáng)細(xì)胞存活率，減輕LDH漏出，減少自噬體數(shù)量和LC3-Ⅱ蛋白數(shù)量，增加p62蛋白表達(dá)，且配伍組效應(yīng)強(qiáng)于黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單用組。析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析表明，以黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的IC50劑量進(jìn)行1 ∶1配伍時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活、LDH漏出及自噬體形成均存在交互作用。結(jié)論 在缺糖缺氧2h再復(fù)糖復(fù)氧24 h，細(xì)胞出現(xiàn)過度自噬和細(xì)胞損傷，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1以IC50劑量進(jìn)行1 ∶1配伍時(shí)，對(duì)細(xì)胞自噬性損傷具有協(xié)同抑制作用。

黃芪甲苷；人參皂苷Rg1；配伍；PC12細(xì)胞；細(xì)胞自噬；Isobologram分析；相互作用

細(xì)胞自噬(autophagy)是細(xì)胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器更新的過程[1]。自噬既可以作為一種防御機(jī)制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物，進(jìn)行亞細(xì)胞水平上的重構(gòu)，保護(hù)受損的細(xì)胞，同時(shí)它作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡[2-3]。已有研究表明，在神經(jīng)細(xì)胞氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧模擬的腦缺血/再灌注模型中，缺糖缺氧可誘發(fā)自噬[4-5]。近期研究也表明，PC12細(xì)胞在缺糖缺氧2 h/復(fù)糖復(fù)氧不同時(shí)間均可出現(xiàn)不同程度的損傷，在復(fù)糖復(fù)氧6～12 h，自噬可減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，而在復(fù)糖復(fù)氧24～36 h后，過度的自噬可加重神經(jīng)細(xì)胞損傷，提示過度自噬是腦缺血/再灌注損傷的重要原因。

前期研究表明，中藥黃芪的有效成分和三七的有效成分具有抗缺血性腦損傷的作用，二者聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)其抗缺血性腦損傷的作用，進(jìn)一步的研究表明，其作用可能來自于其主要有效成分黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的相互作用[6]。但其對(duì)腦缺血/再灌注后神經(jīng)細(xì)胞自噬性損傷有何影響還不清楚，二者配伍具有怎樣的相互作用也未闡明。因此，本研究采用PC12細(xì)胞氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬性損傷模型，研究了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對(duì)細(xì)胞自噬性損傷的影響及其相互作用，為其臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胰蛋白酶(中國(guó)Solarbio，批號(hào)：T1350-100)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone，批號(hào)：NZM1290)；無糖Earle′s(中國(guó)Biotopped，批號(hào)：Top0063)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone，批號(hào)：NWK0489)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)(美國(guó)Sigma，批號(hào)：N2513)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(美國(guó)MP Biomedicals，批號(hào)：196055)；噻唑藍(lán)[(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT](中國(guó)Solarbio公司，批號(hào)：M8181)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(中國(guó)南京建成生物有限公司，批號(hào)：20140327)；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, MAP1LC3, LC3)一抗(日本MBL，批號(hào)：PM036)；熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(fluorescein four methyl isocyanate Luo Danming, TRITC)標(biāo)記羊抗兔二抗(中國(guó)Boster，批號(hào)：BA1090)；兔抗大鼠sequesto-some-1(SQSTM1/p62)一抗(美國(guó)Proteintech，批號(hào)18420-1-AP)；小鼠抗大鼠β-actin一抗(美國(guó)Proteintech，批號(hào)60008-1-lg)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(美國(guó)Proteintech，批號(hào)SA00001-1、SA00001-2)；ECL化學(xué)發(fā)光劑(Tamper Evident seal，批號(hào)203-14401)；曲拉通X-100(上海國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：T20100705)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(美國(guó)Sigma，批號(hào)：A1933-100G)；Hoechst 33258(中國(guó)Solarbio，批號(hào)：COO20-10)；鏈霉素青霉素(10 kU·mL-1青霉素、10 g·L-1鏈霉素)混合溶液、0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)購自美國(guó)Gibco公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenin, 3-MA)(美國(guó)Selleck，批號(hào)S2767)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)(美國(guó)Gene Operation，批號(hào)53123-88-9)。

1.1.2 細(xì)胞株 PC12細(xì)胞，來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，高分化，永生性，在美國(guó)模式培養(yǎng)物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)中的編號(hào)CRL-1721，購自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心。

1.1.3 受試藥物 黃芪甲苷(批號(hào)：A0070)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：A0237)，購自中國(guó)成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%。黃芪甲苷以含0.1% DMSO-PBS溶解，人參皂苷Rg1以PBS溶解。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及氧糖剝奪后再復(fù)氧復(fù)糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)自噬性損傷模型的建立 根據(jù)以往的研究，PC12細(xì)胞在缺糖缺氧2 h再復(fù)糖復(fù)氧24 h，細(xì)胞產(chǎn)生自噬性損傷，且損傷程度達(dá)高峰。因此，在本研究中，采用缺糖缺氧2 h再復(fù)糖復(fù)氧24 h制作細(xì)胞自噬性損傷模型。細(xì)胞以DMEM高糖培養(yǎng)基(含葡萄糖4.5 g·L-1、10%胎牛血清和1%青鏈霉素)于37℃、20% O2、75% N2、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以1×107·L-1接種于12孔或96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后再加終濃度50 μg·L-1的NGF誘導(dǎo)分化48 h后[7]，棄原培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期。然后進(jìn)行如下處理：細(xì)胞加無糖Earle′s培養(yǎng)液，置于三氣培養(yǎng)箱中(5% CO2、1% O2、94% N2)模擬缺糖缺氧培養(yǎng)2 h后，換成DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)糖復(fù)氧24 h，造成OGD/R模型。

假設(shè)入侵者依次攻擊單條入侵路徑上的n個(gè)脆弱性的過程中，相鄰兩次攻擊之間無時(shí)間間隔，且完成對(duì)任意一個(gè)脆弱性攻擊所需要的時(shí)間周期均為τ，則突破單條路徑上的n個(gè)脆弱性所需的總時(shí)間周期為nτ.將入侵者在T內(nèi)通過具有n個(gè)脆弱性的單條入侵路徑實(shí)施入侵的次數(shù)記為k，則

1.2.2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1抗自噬性損傷的相互作用

1.2.2.1 黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用 細(xì)胞接種于24孔板中，制作細(xì)胞爬片。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、OGD/R模型組和藥物干預(yù)組。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后進(jìn)行如下處理：正常對(duì)照組換DMEM高糖培養(yǎng)液同上常規(guī)培養(yǎng)。模型組同前造模。藥物組于缺糖缺氧前30 min加入黃芪甲苷0、9.81、19.63、39.25、78.5 mg·L-1，人參皂苷Rg1 0、10、20、40、80 mg·L-1[8]。復(fù)糖復(fù)氧24 h后吸去上清，PBS洗滌后加4%多聚甲醛固定，以PBS洗3次，加0.5%曲拉通后，PBS洗3次，再以1%牛血清白蛋白封閉液封閉，加兔抗大鼠LC3一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜，PBS洗3次，加TRITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(1 ∶100)室溫孵育，PBS洗3次后，加Hoechst 33258(1 ∶200)，PBS洗滌后，甘油封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察斑片狀熒光體。斑片狀熒光體為L(zhǎng)C3-Ⅱ，斑片的數(shù)量可作為自噬體的相對(duì)定量，也可在一定程度上反映細(xì)胞自噬活性。然后，隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，用Image Pro-Plug6.0圖像分析軟件測(cè)定細(xì)胞面積及斑片狀熒光體個(gè)數(shù)，計(jì)算單位面積的斑片狀熒光體個(gè)數(shù)，以(模型組自噬體數(shù)量-藥物組自噬體數(shù)量)/模型組自噬體數(shù)量×100%計(jì)算藥物對(duì)自噬的抑制率。以藥物濃度為自變量，抑制率為因變量進(jìn)行曲線回歸分析(即以藥物濃度的自然對(duì)數(shù)為自變量，抑制率為因變量)，并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration, IC50)和95%可信區(qū)間。

1.2.2.2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1不同比例配伍對(duì)自噬的抑制作用 以上述黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單獨(dú)作用的IC50為1個(gè)劑量單位，選擇黃芪甲苷與人參皂苷Rg1 3個(gè)不同比例的劑量單位(2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2)進(jìn)行相互作用實(shí)驗(yàn)。同上進(jìn)行自噬抑制實(shí)驗(yàn)，測(cè)定兩藥配伍后的自噬抑制率，計(jì)算黃芪甲苷和人參皂苷Rg1不同劑量單位配伍的IC50及其95%可信區(qū)間。

1.2.2.3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗自噬性損傷的相互作用分析 Isobologram[9-10]分析法可用于判斷藥物的相互作用性質(zhì)。在Isobolograph圖中，橫軸為一個(gè)藥物單用的IC50(或ED50)和標(biāo)準(zhǔn)差，縱軸為另一個(gè)藥物單用的IC50(或ED50)和標(biāo)準(zhǔn)差。將兩個(gè)藥物的IC50(或ED50)均值用直線連接后即為相加線。如果兩藥合用后測(cè)得的IC50(或ED50)落在相加線上則相互作用為相加，落在左下方則為協(xié)同，落在右上方則為拮抗。按Isobologram分析法分析黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以不同比例配伍后的相互作用。該方法常結(jié)合95%可信區(qū)間進(jìn)行分析，分析兩個(gè)藥物配伍時(shí)IC50的95%可信區(qū)間與其分別單用時(shí)IC50的95%可信區(qū)間是否互相重疊，若無重疊，則差異存在顯著性，否則無顯著性差異。此外，相互作用指數(shù)γ也可判斷相互作用的性質(zhì)，若γ<1則相互作用為協(xié)同，γ>1則相互作用為拮抗，γ=1則相互作用為相加。

式中，IC50總A與IC50總B分別為配伍時(shí)A、B兩藥的IC50，IC50A與IC50B分別為A、B兩藥單獨(dú)作用時(shí)的IC50值。

1.3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抗PC12細(xì)胞OGD/R后自噬性損傷的驗(yàn)證 由于自噬在腦缺血后發(fā)揮了雙刃劍的作用[11-12]，抑制自噬不一定就表明對(duì)抗了OGD/R后細(xì)胞的損傷。因此，為了了解黃芪甲苷與人參皂苷Rg1協(xié)同作用配伍下對(duì)OGD/R后細(xì)胞損傷是否具有抑制作用，對(duì)兩藥具有抗OGD/R后細(xì)胞自噬協(xié)同作用的劑量單位為1 ∶1配伍時(shí)是否具有協(xié)同抗細(xì)胞損傷的作用進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。根據(jù)“1.2.2.2”實(shí)驗(yàn)，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1 劑量單位為1 ∶1配伍時(shí)IC50的劑量分別為：黃芪甲苷IC503.45 mg·L-1，人參皂苷Rg1 IC501.71 mg·L-1。將兩藥的IC50劑量作為1個(gè)劑量單位進(jìn)行1 ∶1配伍，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、OGD/R模型組、3-MA(25 mmol·L-1)組、雷帕霉素(200 nmol·L-1)組、黃芪甲苷(3.45 mg·L-1)單用組、人參皂苷Rg1(1.71 mg·L-1)單用組、配伍(3.45 mg·L-1黃芪甲苷+1.71 mg·L-1人參皂苷Rg1)組及不同藥物+3-MA或雷帕霉素組。實(shí)驗(yàn)方法同前。處理結(jié)束后進(jìn)行以下檢測(cè)：

自噬體的電鏡檢測(cè)：吸去上清，細(xì)胞以PBS洗滌后，加入2.5%戊二醛固定液固定過夜，再1%鋨酸后固定2 h，依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，包埋、染色后，以透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI，型號(hào)Tecnai G2 spirit)觀察細(xì)胞自噬體形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞單位面積(μm2)自噬體的數(shù)量。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算自噬體數(shù)量的平均值。

細(xì)胞活力測(cè)定(MTT法)：分別取上述各組細(xì)胞，加入20 μL的MTT(5 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加200 μL DMSO，震蕩10 min，于490 nm處檢測(cè)光密度值(OD)。OD值越大，則細(xì)胞存活越多。

細(xì)胞LC3Ⅱ定位及相對(duì)定量檢測(cè)：同前用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定單位面積的LC3Ⅱ陽性斑片熒光體數(shù)量(10-1個(gè)/μm2)。

細(xì)胞p62蛋白定量檢測(cè)：以Western blot法測(cè)定。細(xì)胞培養(yǎng)及處理同前，吸去上清，PBS洗滌，刮下細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄去上清，加入100 μL的蛋白裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑，冰上充分混勻后靜置20 min后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取30 μg蛋白100℃水浴10 min變性后，120 V恒壓電泳70 min，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別與兔抗大鼠p62一抗(1 ∶500)和小鼠抗大鼠β-actin一抗(1 ∶1 000)溶液混合，4℃靜置過夜，TBS洗3次后，TBST洗1次；然后分別加羊抗兔二抗(1 ∶2 000)或羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000)，37℃孵育1 h，TBS洗3次后，TBST洗1次，暗室下加ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影。Image Pro-Plug6.0圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的累積光密度值(IOD)，以目的條帶的IOD與β-actin條帶的IOD的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷、人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R細(xì)胞自噬的抑制作用 不同濃度的黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單用對(duì)OGD/R后細(xì)胞自噬具有抑制作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，見Fig 1。根據(jù)各藥物對(duì)自噬的抑制率計(jì)算其IC50及95%可信區(qū)間，見Tab 1。

Fig 1 Inhibition of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 alone of different concentrations

**P<0.01vsmodel

Tab 1 IC50and 95% confidence interval of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 alone restraining PC12 cell autophagy(n=3)

2.2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍抑制OGD/R后細(xì)胞自噬的相互作用分析 以黃芪甲苷與人參皂苷Rg1單用的IC50為1個(gè)劑量單位(分別為27.22、13.68 mg·L-1)，分別設(shè)定黃芪甲苷、人參皂苷Rg1 3個(gè)不同劑量單位(2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2)配伍，測(cè)定不同配伍對(duì)自噬的抑制率，并計(jì)算配伍時(shí)各藥的IC50和95%可信區(qū)間，見Tab 2、3。

Tab 2 Inhibitory effects of different ratio combinations of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 on autophagy following OGD/R(n=3)

**P<0.01vsmodel

Tab 3 IC50and 95% confidence interval of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 combinations restraining PC12 cell autophagy(n=3)

采用Isobologram分析法分析兩藥配伍后相互作用的性質(zhì)。根據(jù)藥物單獨(dú)作用時(shí)的IC50值及95%可信區(qū)間繪制Isobologram曲線。將黃芪甲苷的IC50及95%可信區(qū)間繪制在X軸上，人參皂苷Rg1的IC50及95%可信區(qū)間繪制在Y軸上，將兩IC50值相連后構(gòu)成相加線，并作出相加線的95%可信區(qū)間(Fig 2)。由Fig 2可知，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為1 ∶1配伍時(shí)的IC50落在相加線的左下方，且兩個(gè)藥物配伍時(shí)IC50的95%可信區(qū)間與其分別單用時(shí)IC50的95%可信區(qū)間無重疊，表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為1 ∶1配伍時(shí)具有協(xié)同抗細(xì)胞自噬的相互作用，各自的IC50劑量分別為黃芪甲苷(3.45±0.573)mg·L-1、人參皂苷Rg1(1.71±0.284)mg·L-1。而黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為2 ∶1和1 ∶2配伍時(shí)IC50及95%可信區(qū)間均落在相加線的右上方，表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以2 ∶1及1 ∶2配伍時(shí)對(duì)細(xì)胞自噬的作用呈現(xiàn)拮抗的相互作用。

Fig 2 Isobologram analysis of different ratio combinations of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1

( )represents the lower limit and upper limit of 95% confidence interval of each drug IC50

不同比例配伍的相互作用指數(shù)γ見Tab 4。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為2 ∶1和1 ∶2配伍時(shí)γ值均大于1，而1 ∶1配伍時(shí)則小于1。提示黃芪甲苷與人參皂苷Rg1以劑量單位為1 ∶1配伍時(shí)具有協(xié)同抗細(xì)胞自噬的相互作用，與Isobologram的分析結(jié)果一致。

Tab 4 Interaction index of different ratio combinations between Astragaloside IV and Ginsenoside Rg1(γ)

2.3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1劑量單位為1 ∶1配伍下對(duì)OGD/R后細(xì)胞存活和LDH漏出的影響 見Tab 5,細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTT法)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細(xì)胞存活減少、LDH漏出率增加(P<0.01)。與模型組比較，3-MA組細(xì)胞存活均增加、LDH漏出率減少(P<0.01)，雷帕霉素組則作用相反(P<0.01)；黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組及配伍組細(xì)胞存活增加、LDH漏出率減少(P<0.01)，且配伍組細(xì)胞存活的增加和LDH漏出率的減少高于黃芪甲苷單用和人參皂苷Rg1單用(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲苷+3-MA、人參皂苷Rg1+3-MA和配伍+3-MA組細(xì)胞存活進(jìn)一步增加、LDH漏出率進(jìn)一步降低(P<0.01)，且黃芪甲苷+3-MA、人參皂苷Rg1+3-MA和配伍+3-MA組增加細(xì)胞存活、降低LDH漏出率的效應(yīng)分別強(qiáng)于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1和配伍組(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲苷+雷帕霉素、人參皂苷Rg1+雷帕霉素和配伍+雷帕霉素組細(xì)胞存活增加、LDH漏出率降低(P<0.01)，但黃芪甲苷+雷帕霉素、人參皂苷Rg1+雷帕霉素和配伍+雷帕霉素組增加細(xì)胞存活、減少LDH漏出率的效應(yīng)低于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1及配伍組(P<0.01)。

GroupMTT/ODLDHleakagerate/%Normal0．683±0．03414．370±2．553Model0．218±0．023▲▲58．790±3．258▲▲AstragalosideⅣ0．530±0．022△△★★28．950±1．779△△★★GinsenosideRg10．506±0．021△△★★30．670±2．517△△★★Combination0．628±0．023△△23．120±3．101△△AstragalosideⅣ+3?MA0．668±0．027△△☆☆●●17．490±2．367△△☆☆●GinsenosideRg1+3?MA0．664±0．027△△##●●17．670±2．517△△##●Combination+3?MA0．703±0．024△△★★●●13．270±1．804△△★★●●AstragalosideⅣ+Rapamycin0．348±0．025△△☆☆〇〇36．960±2．669△△☆☆〇〇GinsenosideRg1+Rapamycin0．342±0．025△△##〇〇37．000±2．000△△##〇〇Combination+Rapamycin0．420±0．026△△★★〇〇32．670±2．517△△★★〇〇3?MA0．620±0．029△△22．570±2．629△△Rapamycin0．178±0．023△△65．110±2．437△△

▲▲P<0.01vsnormal;△△P<0.01vsmodel;☆☆P<0.01vsAstragaloside Ⅳ;##P<0.01vsGinsenoside Rg1;★★P<0.01vscombination;●P<0.05,●●P<0.01vs3-MA;〇〇P<0.01 Rapamycin

2.4 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1劑量單位為1 ∶1配伍下對(duì)OGD/R后細(xì)胞自噬的影響 電鏡顯示(Fig 3、Tab 6)：正常對(duì)照組未見明顯自噬體形成。OGD/R后，細(xì)胞內(nèi)可見大量自噬體形成，大部分呈完整的雙膜或單膜結(jié)構(gòu)，少部分被溶酶體溶解。與正常對(duì)照組比較，模型組自噬體數(shù)量增加(P<0.01)。與模型組比較，雷帕霉素組自噬體數(shù)目增加(P<0.01)，3-MA組自噬體數(shù)量減少(P<0.01)；黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、配伍組自噬體數(shù)量均減少(P<0.01)，且配伍組低于黃芪甲苷單用和人參皂苷Rg1單用組(P<0.05或P<0.01)。析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的交互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍后抑制自噬體形成的交互作用差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Ultrastructure of autophagosome in PC12 cells of each group(×15 000,bar=2 μm)

A:Normal;B:Model;C:Astragaloside Ⅳ;D:Ginsenoside Rg1;E:Combination;F:3-MA;G:Rapamycin. Arrows indicate autophagosome

Fig 4 Localization detection of LC3 Ⅱ(×600,bar=20 μm)

A:Normal;B:Nodel;C:Astragaloside Ⅳ;D:Ginsenoside Rg1;E:Combination;F:3-MA;G:Rapamycin.Arrows indicate LC3 Ⅱ positive puncta

Tab 6 Comparisons of the numbers of autophagosome and LC3 Ⅱ positive puncta as well as expression of p62 protein among each±s,n=3)

▲▲P<0.01vsnormal;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel;★P<0.05,★★P<0.01vscombination

激光共聚焦結(jié)果顯示(Fig 4、Tab 6)：正常對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見均勻分布的紅色熒光點(diǎn)，無斑片狀熒光體形成。OGD/R后，胞質(zhì)內(nèi)可見斑片狀熒光體聚集。與正常組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ陽性斑片狀熒光體數(shù)目增多(P<0.01)。與模型組比較，雷帕霉素組斑片狀熒光體數(shù)目增加(P<0.01)，3-MA組斑片狀熒光體數(shù)目均減少(P<0.01)；黃芪甲苷單用組、人參皂苷Rg1單用組、配伍組斑片狀熒光體數(shù)目均減少(P<0.01)，且配伍組斑片狀熒光體數(shù)目低于黃芪甲苷和人參皂苷Rg1單用組(P<0.01)。析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的交互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍后降低斑片狀熒光體數(shù)目的交互作用具有顯著性意義(P<0.01)。

p62蛋白檢測(cè)表明(Fig 5、Tab 6)：OGD/R后，p62蛋白表達(dá)下降(P<0.01)。與模型組比較，雷帕霉素組p62蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，3-MA組p62蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、配伍組p62蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，且配伍的效應(yīng)大于各藥物單用(P<0.05)。析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的交互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍后增加p62蛋白表達(dá)的交互作用具有顯著性意義(P<0.01)。

Fig 5 Western blot pattern of p62 protein expression among each group

1:Normal;2:Model;3:Astragaloside Ⅳ;4:Ginsenoside Rg1;5:combination;6:3-MA;7:Rapamycin

3 討論

中醫(yī)學(xué)常將具有不同功效的中藥進(jìn)行配伍，使不同藥物成分作用于不同的靶點(diǎn)，從而對(duì)疾病發(fā)揮綜合治療的作用。因此，中藥配伍主要是通過藥物的相互作用而實(shí)現(xiàn)的，這種相互作用常表現(xiàn)為協(xié)同、相加和拮抗3種形式。Isobologram分析法[9-10]是國(guó)際上常用于判斷藥物相互作用性質(zhì)的一種方法，常被稱為評(píng)價(jià)藥物相互作用的黃金標(biāo)準(zhǔn)。在運(yùn)用Isobologram分析法評(píng)價(jià)藥物相互作用的性質(zhì)時(shí)，常結(jié)合其95%可信區(qū)間和相互作用指數(shù)γ，來進(jìn)一步判斷藥物相互作用的性質(zhì)，這些方法相互佐證，可以更加客觀地評(píng)價(jià)藥物的相互作用。因此，本研究采用Isobologram分析法并結(jié)合相互作用指數(shù)，研究黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的相互作用。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在建立PC12細(xì)胞OGD/R后細(xì)胞自噬性損傷模型的基礎(chǔ)上，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3，以判斷藥物對(duì)自噬的影響。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C 端即被Atg4 蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，并始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上參與自噬體的形成直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記物[1,14]。正常情況下LC3蛋白主要以LC3-Ⅰ形式散在分布于胞質(zhì)中，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)LC3蛋白可見胞質(zhì)中出現(xiàn)彌散狀熒光。若細(xì)胞出現(xiàn)自噬則表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ的形成和在胞質(zhì)的聚集，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)LC3蛋白可見胞質(zhì)中出現(xiàn)斑片狀熒光體，這種斑片狀熒光體的多少可在一定程度上反映自噬體的數(shù)量或自噬的強(qiáng)度[15-16]。

本研究結(jié)果表明，在缺糖缺氧2 h復(fù)糖復(fù)氧24 h，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)LC3-Ⅱ形成及胞質(zhì)中含量增加，自噬體形成增加，且細(xì)胞存活減少、LDH漏出率增加。給予自噬抑制劑3-MA干預(yù)后，可使細(xì)胞存活增加、LDH漏出減少，減輕了OGD/R引起的細(xì)胞損傷；而自噬誘導(dǎo)劑則使細(xì)胞存活進(jìn)一步減少、LDH漏出率增加，細(xì)胞損傷加重。表明OGD/R后，細(xì)胞出現(xiàn)過度自噬，參與了OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，細(xì)胞損傷可能與細(xì)胞自噬被過度激活有關(guān)。黃芪甲苷和人參皂苷Rg1對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬具有抑制作用，且作用呈量效關(guān)系。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在劑量單位為1 ∶1配伍時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，其協(xié)同作用的IC50分別是黃芪甲苷(3.45±0.573)mg·L-1、人參皂苷Rg1(1.71±0.284)mg·L-1。而黃芪甲苷與人參皂苷Rg1在劑量單位為1 ∶2和2 ∶1配伍時(shí)，則呈拮抗作用。因此，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1合理的配伍對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷是有益的。

為進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍抗OGD/R后細(xì)胞自噬的協(xié)同作用，研究了兩藥在IC50劑量配伍下對(duì)細(xì)胞損傷、自噬體數(shù)量和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、p62表達(dá)的影響。p62可與LC3-Ⅱ結(jié)合，參與了自噬形成過程的選擇性自噬，從而靶向自噬體并促進(jìn)泛素化蛋白的清除和自身的特異性降解，其蛋白水平與自噬活性在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)[17]，與LC3-Ⅱ共同用于自噬活性的判斷。研究發(fā)現(xiàn)，因LC3缺陷引起的自噬途徑阻滯，p62及其連接的泛素化蛋白會(huì)出現(xiàn)明顯的堆積[18]。

本研究結(jié)果表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1可抑制OGD/R后細(xì)胞活性的降低和LDH漏出。析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析表明，二者在IC50劑量下配伍時(shí)具有協(xié)同增效作用。自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可部分抵消藥物抗細(xì)胞損傷的作用，而自噬抑制劑3-MA與藥物合用可進(jìn)一步減輕細(xì)胞的損傷。提示黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時(shí)對(duì)細(xì)胞損傷具有協(xié)同抑制作用，其作用與抑制OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬性損傷有關(guān)。自噬體數(shù)目和p62蛋白表達(dá)結(jié)果也表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1可抑制OGD/R后細(xì)胞自噬體形成，增加p62蛋白表達(dá)。析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析也表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時(shí)對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬具有協(xié)同抑制作用。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時(shí)抗細(xì)胞損傷與其協(xié)同抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。

綜上所述，在缺糖缺氧2 h時(shí)再復(fù)糖復(fù)氧24 h，細(xì)胞出現(xiàn)過度自噬和細(xì)胞損傷，提示過度自噬參與了細(xì)胞損傷。黃芪甲苷和人參皂苷Rg1 在IC50劑量配伍時(shí)，對(duì)細(xì)胞過度自噬和細(xì)胞損傷具有抑制作用。相互作用分析表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1在IC50劑量配伍時(shí)對(duì)細(xì)胞自噬的抑制呈協(xié)同作用。這表明在臨床應(yīng)用黃芪和三七或其有效成分防治缺血性腦血管病時(shí)，合理的配伍將起到協(xié)同增效作用。

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Interaction of Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 against autophagy injury of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation

DING Huang, LI Jing-xian, TANG Biao, LIU Xiao-dan, LI Ling, TANG Ying-hong, DENG Chang-qing,HUANG Xiao-ping

(MolecularPathologyLaboratory,KeyLaboratoryofHunanProvinceforPreventionandTreatmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineonCardio-CerebralDiseases,KeyLaboratoryofHunanUniversitiesforCellBiologyandMolecularTechniques,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,Hunan)

Aim To probe the effect and the interaction of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 on autophagy injury of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R).Methods Autophagy injury model of PC12 cells induced by OGD/R was established, Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 were divided into different dosages to interfere PC12 cells, the autophagosome was detected to assess the effect of drugs on autophagy injury with confocal microsopy, and median inhibitory concentration(IC50) of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 was calculated. Taking IC50of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 as 1 unit, the combinations of different ratios of Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1(1 ∶2, 1 ∶1, 2 ∶1) were set up according to Isobologram method, the effect of the drugs against cells autophagy injury was determined and IC50of different ratio combinations was acquired, then the nature of interaction was analysed that Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 inhibited autophagy through Isobologram analysis, 95% confidence and interaction index γ. On this basis, using the combination of IC50that Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 exerting synergy effect to assess the effect on cell injury and autophagy via cell survival rate, lactate dehydrogenase(LDH) leakage rate, the number of autophagosome and the expressionof p62 protein. Results IC50and 95% confidence that Astragaloside Ⅳ and Ginsenoside Rg1 inhibited autophagy was (27.22±0.614) mg·L-1[25.96, 29.03], (13.68±1.334) mg·L-1[10.27,16.95], respectively. Astragaloside Ⅳ combined with Ginsenoside Rg1 obtained a synergitic effect under 1 ∶1 ratio while presented the antagonism under 1 ∶2 or 2 ∶1. The verification results showed that Astragaloside Ⅳ, Ginsenoside Rg1 and the combination could enhance cell survival rate, relieve LDH leakage, reduce the numbers of autophagosome and LC3-Ⅱ, and increase the expression of p62; the effects of the combination were better than those of drugs alone. Furthermore, factorial analysis manifested that Astragalus IC50combined Ginsenoside Rg1 IC50with 1 ∶1 ratio presented the interactions on cell survival, LDH leakage and autophagosome formation.Conclusions After OGD 2 h followed by reoxygenation 24 h, PC12 cells suffer excessive autophagy and damage, which are prevented by Astragaloside Ⅳ combined Ginsenoside Rg1 with 1 ∶1 ratio. Moreover, the combination plays the synergitic inhibition on autophagy injury.

Astragaloside Ⅳ; Ginsenoside Rg1; combination; PC12 cells; autophagy; Isobologram analysis; interaction

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.036.html

2016-10-04,

2016-11-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81573875，81503385)；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金資助項(xiàng)目(No 14K068)；湖南省科技廳資助項(xiàng)目(No 2014SK3001)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(No CX2016B372)；湖南省教育廳資助項(xiàng)目(No 14C0844)；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目(No 201301，201508)；中醫(yī)內(nèi)科重大疾病防治及成果轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No ZYNK201405)；“中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究”湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)；“中醫(yī)藥防治心腦血管疾病基礎(chǔ)研究”湖南省自然科學(xué)創(chuàng)新群體基金

丁 煌(1990-)，女，碩士生，研究方向：心腦血管疾病的防治，E-mail: 287351273@qq.com； 鄧常清(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管疾病的防治，通訊作者，E-mail: dchangq@sohu.com； 黃小平(1974-)，女，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管疾病的防治，通訊作者，E-mail: jialeliu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.018

A

1001-1978(2017)02-0235-09

R284.1；R289.1；R329.24；R845.22