煙酸通過下調(diào)PCSK9的表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C

歐 露，麻燕妮，張彩平，劉 英，張 敏，丁新新，段理人，龍石銀，田 英

(1. 常德市婦幼保健院遺傳科，湖南 常德 415000；2.南華大學(xué)生物技術(shù)系，湖南 衡陽 421001；3.常德市職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南 常德 415000)

煙酸通過下調(diào)PCSK9的表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C

歐 露1,2，麻燕妮2，張彩平2，劉 英3，張 敏2，丁新新2，段理人2，龍石銀2，田 英2

(1. 常德市婦幼保健院遺傳科，湖南 常德 415000；2.南華大學(xué)生物技術(shù)系，湖南 衡陽 421001；3.常德市職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南 常德 415000)

目的 探討煙酸對HepG2細(xì)胞攝取及代謝LDL-C的影響，尋找煙酸改善血脂異常，減緩動脈粥樣硬化進(jìn)程的相

煙酸；低密度脂蛋白受體；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2；前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9型；人源性缺脂蛋白血清；25羥膽固醇

煙酸(niacin)又稱維生素B3或尼克酸，具有重要的生理作用，然而，讓它備受關(guān)注的是其調(diào)脂作用[1]。早在20世紀(jì)60年代，煙酸就作為調(diào)脂藥物開始應(yīng)用于臨床[2]。研究表明[2-3]，煙酸通過影響Apo AI、CETP、ABCA1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)HDL-C水平。在藥理劑量下，煙酸是最有效的升高血漿HDL含量的調(diào)脂藥物，同時能降低血漿低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol, LDL)、脂蛋白a(lipoprotein a, Lip a)以及甘油三酯(triglycerides, TG)等的含量，具有預(yù)防和治療心血管疾病的作用[4-5]。作為既能升高HDL，又能降低LDL的調(diào)脂藥物，煙酸升高HDL的作用已被廣泛認(rèn)可，但是其降低LDL的作用及機(jī)制卻有待完善。

血漿高LDL-C水平是心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的危險因素之一[6]。超過70%的血漿LDL-C通過LDLR途徑經(jīng)肝細(xì)胞代謝[7]。而LDLR的表達(dá)同時受到固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(sterol regulatory element binding proteins 2, SREBP2)等因子的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)[8]，又受到前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)等因子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[9]。SREBP2是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的固醇敏感器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平處于失平衡狀態(tài)時，它能相應(yīng)調(diào)節(jié)下游靶基因LDLR及PCSK9等因子的表達(dá)[10-11]。PCSK9蛋白成熟體則能與LDLR的EGF-A區(qū)域結(jié)合，并誘導(dǎo)LDLR進(jìn)入溶酶體降解[12]。為證實(shí)煙酸是否通過調(diào)節(jié)SREBP2和PCSK9的表達(dá)而降低LDL-C水平，本研究運(yùn)用煙酸作用HepG2細(xì)胞，檢測調(diào)控LDLR的相關(guān)因子的表達(dá)變化，試圖尋找煙酸的新的降血漿LDL-C的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫。煙酸購自Biosharp公司；人源性LDL購自廣州弈源公司；人源性缺脂蛋白血清(human lipoprotein-deficient serum, LPDS)購自美國Biomedical Technologies Inc.公司；油紅O和DMSO購自Amresco公司；蘇木精購自博士德生物公司；組織總膽固醇/游離膽固醇酶法測定試劑盒(E1015/E1016)購自北京普利萊基因技術(shù)公司；25-羥膽固醇(25-HC)購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒(TRIzon Reagent)購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；Donkey anti-rabbit IgG(Alexa Fluor 647)、兔抗人LDLR和PCSK9抗體購自美國Abcam公司；兔抗人β-actin購自美國CST公司；山羊抗人的SREBP2抗體購自美國R&D公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均購自上海優(yōu)維寧生物科技公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 藥物配制 煙酸工作液：DMSO配制成400 mmol·L-1的母液，胎牛血清稀釋，0.22 μm濾器過濾分裝，-20℃避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 油紅O染色以及膽固醇含量測定實(shí)驗(yàn)分組為：① Basal;② Control;③ Niacin 300 μmol·L-1;④ Vehicle 0.075% DMSO)；其中②～④組加入25 mg·L-1LDL。

在溶媒對實(shí)驗(yàn)無影響的情況下，調(diào)整分組為：① Basal;② Control;③ LPDS(10%);④ 25-HC(10 mg·L-1);⑤ Niacin 300 μmol·L-1；其中②～⑤組加入25 mg·L-1LDL。

1.4 油紅O實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1×105個細(xì)胞/孔接種至預(yù)先放置好無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h。多聚甲醛固定30 min，油紅O染色約7 min，蘇木精染色約4 s，甘油封片，觀察并拍照。

1.5 酶法測定膽固醇含量 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1×105個細(xì)胞/孔接種至6孔板培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h。收集細(xì)胞裂解液，離心，取上清。按照總膽固醇含量酶法測定試劑盒(E1015/E1016)的說明書操作，37℃水浴20 min后，酶標(biāo)儀測定A570膽固醇含量。BCA試劑盒測定的細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量用以標(biāo)化各樣本的膽固醇值，標(biāo)化后的膽固醇濃度單位為總膽固醇(游離膽固醇)/蛋白=μmol·g-1。

1.6 細(xì)胞表面LDLR含量流式檢測 對數(shù)期生長的HepG2 以1×105個細(xì)胞/孔接種至6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌，0.50% BSA封閉，抗體孵育及洗滌。FL3 emission filter 流式細(xì)胞儀檢測，Cell Quest Pro software(BD Biosciences)分析對比各組與Control的平均熒光強(qiáng)度。

1.7 mRNA含量檢測 對數(shù)期生長HepG2細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/孔接種至50 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h。根據(jù)TRIzon Reagent說明書提取總RNA。紫外分光光度儀測定OD260/OD280比值介于1.9～2.1；瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰可見，提取的總RNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增條件為：42℃、30 min，85℃、10 min；再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為20 μL。引物由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司設(shè)計與合成(Tab 1)。qPCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性12 s，62℃延伸40 s，40個循環(huán)。用ΔΔCT來計算基因的表達(dá)水平，計算公式如下：ΔCT=目的基因CT值-β-actin基因CT值；ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組ΔCT-對照組ΔCT；實(shí)驗(yàn)組/對照組基因表達(dá)水平的倍數(shù)=2-ΔΔCT。

1.8 蛋白含量檢測 對數(shù)期生長HepG2細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/孔接種至50 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h。收集細(xì)胞裂解液，離心，取上清，取5 μL蛋白液進(jìn)行BCA蛋白定量。剩余蛋白液加入SDS-loading buffer，100℃條件下煮沸10 min，于-20℃保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。Tanon ECL高敏成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行檢測。各組細(xì)胞目的蛋白與內(nèi)參β-actin的光密度比值，分別代表各目的蛋白表達(dá)水平。

Tab 1 The primer sequence

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色觀察煙酸對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響 油紅O染色觀察，HepG2細(xì)胞中脂滴顆粒被染成橘紅色，核呈藍(lán)色。結(jié)果顯示：與Basal組相比，Control組細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，提示本實(shí)驗(yàn)荷脂成功；與Control相比，Vehicle組細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴無明顯變化，提示溶媒對實(shí)驗(yàn)無影響。Niacin組油紅O陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴明顯增加，見Fig 1。

Fig 1 Oil red O staining of HepG2 cells treated with niacin co-incubated with LDL(×40)

A:Niacin;B:Basal;C:Control;D:Vehicle

2.2 酶法測定HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化 為了進(jìn)一步定量分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，酶法測定結(jié)果顯示：與Basal組相比，Control細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平增高，提示本研究細(xì)胞荷脂造模成功；與Control相比，Vehicle組細(xì)胞內(nèi)TC水平有增高的趨勢，F(xiàn)C水平有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示溶媒對細(xì)胞攝取膽固醇無影響；Niacin組細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平明顯增高(P<0.01)。提示煙酸促使HepG2細(xì)胞攝取膽固醇，見Fig 2。

Fig 2 Effect of niacin on total cholesterol and free cholesterol in HepG2 cells

**P<0.01vscontrol

2.3 煙酸對HepG2細(xì)胞LDLR表達(dá)的影響 本研究推測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加可能是煙酸通過上調(diào)LDLR的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HepG2細(xì)胞對LDL-C的攝取。接下來運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、qPCR及Western blot檢測LDLR的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，煙酸處理的HepG2細(xì)胞中，LDLR mRNA含量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞膜表面LDLR分布豐度及細(xì)胞內(nèi)LDLR蛋白含量卻明顯增加(P<0.05)，見Fig 3。

2.4 煙酸對SREBP2表達(dá)的影響 LDLR的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平受到SREBP2的調(diào)節(jié)，為了探究煙酸是否影響SREBP2，進(jìn)而調(diào)控LDLR的表達(dá)，本研究檢測了煙酸對SREBP2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，煙酸處理組細(xì)胞內(nèi)SREBP2的mRNA和蛋白表達(dá)都無明顯改變。提示煙酸升高LDLR含量并不是通過SREBP2的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，見Fig 4。

2.5 煙酸對PCSK9表達(dá)的影響 PCSK9是LDLR轉(zhuǎn)錄后水平的主要調(diào)控者。在生理?xiàng)l件下，PCSK9前體(PCSK9 precursor, pPCSK9)經(jīng)過加工剪切形成成熟體(mature PCSK9, mPCSK9)，而mPCSK9則可以在翻譯后水平調(diào)節(jié)LDLR的表達(dá)。為了探究在煙酸的作用下，LDLR是否受到PCSK9的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，

Fig 3 Effect of niacin on expression of LDLR in HepG2 cells

A:Cell surface LDLR was determined by FACS analysis. The relative expression of LDLR mRNA(B) and protein(C).*P<0.05vscontrol

Fig 4 Effect of niacin on expression of SREBP2 in HepG2 cells

The relative expression of SREBP2 mRNA(A) and protein(B). SREBP2 precursor(p) and mature form(m).*P<0.05,**P<0.01vscontrol

本研究檢測了煙酸對PCSK9表達(dá)的影響，并檢測了mPCSK9的相對含量。結(jié)果顯示，煙酸明顯減少了PCSK9的mRNA和成熟體蛋白含量(P<0.05)。提示煙酸可能通過下調(diào)PCSK9的表達(dá)，減少PCSK9成熟體蛋白含量，使得LDLR降解減少，進(jìn)而增加LDLR含量，促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C。見Fig 5。

Fig 5 Effect of niacin on expression of PCSK9 in HepG2 cells

The relative expression of PCSK9 mRNA(A) and protein(B). PCSK9 precursor(p) and mature form(m).*P<0.05vscontrol

3 討論

在世界各地，心血管疾病的發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年，心血管疾病死亡率將占據(jù)我國非傳染性死亡率的首位[13]。LDL-C升高是心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素[14]，因此，有效地降低血漿LDL-C對預(yù)防和治療心血管疾病至關(guān)重要。

煙酸作為目前臨床上常用的一種降脂藥物[15-16]，在藥理劑量下，單獨(dú)使用煙酸可以增加血漿HDL-C水平，并且明顯降低血漿中LDL-C、VLDL及LDL水平[17-18]；煙酸聯(lián)合其他降脂藥物(如他汀類、貝特類、膽酸螯合劑類藥物)，可以使HDL-C水平升高，LDL及TG水平明顯下降[19]。煙酸升高血漿HDL的作用已被認(rèn)可，但降低LDL-C的作用卻有待完善。

為找尋煙酸降低血漿LDL-C的分子靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為研究對象，LDL孵育細(xì)胞，模擬高脂環(huán)境，煙酸藥物處理。油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積，并用酶法定量檢測膽固醇含量，充分考慮溶媒對細(xì)胞的影響。在溶媒對實(shí)驗(yàn)無影響的前提下，合理地設(shè)計了LPDS的陽性對照[20]及25-羥膽固醇(25-HC)的陰性對照[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬的高脂環(huán)境下，煙酸能上調(diào)HepG2細(xì)胞LDLR蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞攝取及代謝LDL。檢測LDLR表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子發(fā)現(xiàn)，SREBP2的表達(dá)并沒有受到影響，這也意味著，煙酸并沒有在轉(zhuǎn)錄水平上影響LDLR的表達(dá)。qPCR結(jié)果亦證實(shí)煙酸處理組LDLR的mRNA表達(dá)水平無明顯升高。檢測LDLR轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，煙酸處理組細(xì)胞中的PCSK9成熟體蛋白含量明顯減少。提示煙酸可能通過下調(diào)PCSK9的表達(dá)，阻礙PCSK9蛋白成熟過程，進(jìn)而減少PCSK9的成熟體蛋白含量，使得LDLR降解減少。這一點(diǎn)與前面的結(jié)果相一致：煙酸影響LDLR的蛋白水平，卻對其mRNA含量無影響。本研究只是做了初步探討，要進(jìn)一步確定PCSK9是煙酸降低LDL-C的分子靶點(diǎn)，還有大量的研究工作要做。

(致謝：感謝給予本文實(shí)驗(yàn)提供研究場所的生物技術(shù)系的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、蛋白化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞培養(yǎng)室、技能實(shí)驗(yàn)室及生物信息室的所有老師及同學(xué)，感謝本校省部級重點(diǎn)心血管病研究所、腫瘤研究所、病原微生物研究所對本實(shí)驗(yàn)無償提供流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡等服務(wù)。)

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Niacin accelerates LDL-C uptake in HepG2 cells via downregulation of PCSK9

OU Lu1,2, MA Yan-ni2, ZHANG Cai-ping2, LIU Ying3,ZHANG Min2, YU Xin-xin2,DUAN Li-ren2, LONG Shi-yin2, TIAN Ying2

(1.DeptofGenetics,ChangdeMaternalandChildHealth-CareHospital,ChangdeHunan415000,China; 2.DeptofBiotechnology,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China; 3.DeptofMedicine,ChangdeVocationalTechnicalCollege,ChangdeHunan415000,China)

Aim To explore the effects of niacin on LDL-C uptake and metabolism in HepG2 cells, and to clarify the functions of niacin in lipid-lowering and slowing the atherosclerosis process,thus to provide a scientific basis for niacin as a lipid-lowering drug in clinical development.Methods Oil red O staining was used to observe HepG2 cells after lipid uptake. Enzymatic method was used to determine the content of intracellular free cholesterol(FC) and total cholesterol(TC). The LDLR levels on the surface of cell membrane were detected by immunofluorescence flow cytometer. The mRNA and protein expressions of LDLR, SREBP2 and PCSK9 were analyzed by qPCR and Western blot.Results The results of oil red O staining showed that the rate of oil red O-positive cells and the number of red lipid droplets were significantly increased in niacin group than control group. Niacin significantly increased the levels of TC and FC in HepG2 cells(P<0.05). What’s more, niacin significantly upregulated the expression of LDLR and significantly downregulated the protein expression of PCSK9, while it had no effect on the expression of SREBP2.Conclusion Niacin accelerates LDL-C uptake probably via downregulating the expression of PCSK9 and reducing the degradation of LDLR protein in HepG2 cells.

niacin; LDLR; SREBP2; PCSK9; LPDS; 25-HC

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.038.html

2016-12-18，

2017-01-23

湖南省科技廳項(xiàng)目(No 2015SK2038)；湖南省衛(wèi)生計生委項(xiàng)目(No B2015-49)；湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程項(xiàng)目基金；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2015)；湖南省教育廳項(xiàng)目(No 15C1217)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2014JJ3104)；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計劃項(xiàng)目(No 2015-230)；衡陽市科技局項(xiàng)目(No 2015KJ15)；南華大學(xué)“十二五”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金；南華大學(xué)留學(xué)回國人員啟動基金(No 2013XQD52)；南華大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計劃項(xiàng)目(2014,2015);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81600291)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(No CX2016B474)

歐 露(1989-)，女，碩士生，研究方向：細(xì)胞遺傳學(xué)，E-mail：985800843@qq.com； 麻燕妮(1994-)，女，本科生，研究方向：脂蛋白與動脈粥樣硬化，共同第一作者，E-mail：475238299@qq.com； 田 英(1963-)，男，博士，教授，研究方向：脂蛋白與動脈粥樣硬化，通訊作者，E-mail：uscty@163.com； 龍石銀(1973-)，女，博士，教授，研究方向：脂蛋白與動脈粥樣硬化，通訊作者,E-mail： longshiyin@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.019

A

1001-1978(2017)02-0243-06

R329.24；R341.35；R392.11；R972.6；R977.6

關(guān)分子機(jī)制，為其臨床用藥提供指導(dǎo)。方法 采用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；酶法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；熒光流式檢測細(xì)胞表面LDLR豐度分布；qPCR及Western blot檢測LDLR、SREBP2以及PCSK9的mRNA及蛋白含量變化。結(jié)果 經(jīng)煙酸處理的HepG2細(xì)胞，油紅O陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴增多，細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平明顯增高(P<0.05)；LDLR mRNA含量無差異(P>0.05)，而細(xì)胞膜表面LDLR分布豐度及細(xì)胞內(nèi)LDLR的含量明顯增加(P<0.05)； 煙酸對SREBP2的表達(dá)無影響，卻能明顯下調(diào)PCSK9的表達(dá)。結(jié)論 煙酸可能通過下調(diào)PCSK9的表達(dá)，減少PCSK9成熟體蛋白含量，使得LDLR降解減少，進(jìn)而增加LDLR含量，促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C。