LC-MS/MS法研究Cocktail探針?biāo)幬锟Х纫?、右美沙芬、奧美拉唑、咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物在大鼠血漿中的藥代動力學(xué)

徐利云，候叢頌,2，楊志宏，孫曉波

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

LC-MS/MS法研究Cocktail探針?biāo)幬锟Х纫?、右美沙芬、奧美拉唑、咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物在大鼠血漿中的藥代動力學(xué)

徐利云1，候叢頌1,2，楊志宏1，孫曉波1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

目的 建立靈敏、快速、穩(wěn)定的測定大鼠血漿中CYP450探針?biāo)幬?代謝產(chǎn)物，咖啡因/副黃嘌呤、奧美拉唑/5-羥基奧美拉唑、右美沙芬/右啡烷、咪達(dá)唑侖/1′-羥基咪達(dá)唑侖的LC-MS/MS方法，并用于其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。方法 100 μL血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)地西泮及乙酸銨溶液，乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，離心取上清揮干復(fù)溶，LC-MS/MS檢測。選用Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 3.5 μm)，乙腈和0.01%甲酸(1 mmol·L-1甲酸銨)作為流動相，梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。采用電噴霧電離源(ESI)，掃描方式為多反應(yīng)正離子監(jiān)測模式(MRM+)，咖啡因m/z：195.0/138.1；副黃嘌呤m/z：181.1/124.1；奧美拉唑m/z：346.1/198.1；5-羥基奧美拉唑m/z：362.1/214.1；右美沙芬m/z：272.2/147.1；右啡烷m/z：258.1/157.1；咪達(dá)唑侖m/z：326.1/291.1；1′-羥基咪達(dá)唑侖m/z：342.1/324.1；內(nèi)標(biāo)地西泮m/z：285.1/154.0。結(jié)果 咖啡因、副黃嘌呤、奧美拉唑、5-羥基奧美拉唑、右美沙芬、右啡烷、咪達(dá)唑侖和1′-羥基咪達(dá)唑侖的線性范圍分別為1.95～2 000、0.98～250、0.48～2 000、0.98～250、0.98～2 000、0.48～125、1.95～2 000和1.95～250 μg·L-1。RSD<15%且無基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)論 該方法快速、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于血漿中上述探針?biāo)幬?代謝產(chǎn)物濃度的測定，便于深入進(jìn)行代謝酶CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的代謝相關(guān)研究。

Cocktail探針?biāo)幬锓?；探針?biāo)幬铮淮x產(chǎn)物；肝代謝酶；CYP450；LC-MS/MS

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)主要存在于肝臟中，代謝大量的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)。CYP450系統(tǒng)組成復(fù)雜，具有遺傳多態(tài)性，是引起種族間和個(gè)體間對同一底物代謝能力不同的原因之一。CYP450酶主要的代謝酶亞型有CYP1A2(參與代謝約4%臨床用藥)、CYP2C19(2%)、CYP2D6(30%)和CYP3A4(50%)，這4種代謝酶亞型參與臨床85%以上的藥物代謝[1]。藥物代謝酶被抑制或者誘導(dǎo)是引起肝代謝層面上藥物相互作用的機(jī)制之一。FDA指導(dǎo)原則《體內(nèi)藥物代謝/藥物相互作用研究-試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、關(guān)于劑量和藥品說明書的建議》中要求，“應(yīng)在新藥開發(fā)過程中確定該藥物的代謝作用，同時(shí)探究其與其他藥物的相互作用，作為適當(dāng)評價(jià)安全性和有效性的一部分”[2]。檢測藥物代謝酶活性是研究藥物相互作用的基石之一。

雞尾酒(Cocktail)探針?biāo)幬锓ㄊ侵竿瑫r(shí)給予多種相對低劑量的探針?biāo)幬?，測定生物樣本中各探針?biāo)幬锏拇x率或其他代謝分型指標(biāo)，獲取多個(gè)CYP450同工酶表型信息的方法[3]。“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄍㄟ^定量分析探針?biāo)幬?，反映CYP450亞型酶的活性，確定是否被誘導(dǎo)或抑制，從而確定中西藥間可能的相互作用，降低不良反應(yīng)[4]?！癈ocktail”探針?biāo)幬锓蓱?yīng)用于快速測定肝藥酶活性、確證藥物代謝途徑、評價(jià)藥物相互作用、驗(yàn)證臨床結(jié)果等研究領(lǐng)域。為快速評價(jià)藥物(化藥、中藥等)對CYP450酶活性的影響，以及為臨床前高通量篩選提供快速的分析方法，本研究選取特異性探針底物/代謝產(chǎn)物，咖啡因/副黃嘌呤、奧美拉唑/5-羥基奧美拉唑、右美沙芬/右啡烷和咪達(dá)唑侖/1′-羥基咪達(dá)唑侖作為CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶活性的表征指標(biāo)，建立評價(jià)測定酶活性的體內(nèi)研究方法。通過測定探針?biāo)幬锏拇x率或其他代謝分型指標(biāo)，為化藥、中藥對肝藥酶活性影響進(jìn)行早期預(yù)評，對臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司)；3200 QTrap串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)，Turbo Ionspray離子源，Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli-Q Gradient A10超純水器(美國Millipore公司)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國Labconco公司)。

1.2 藥品與試劑 咪達(dá)唑侖(midazolam，MDZ，批號FE042209-01)、1′-羥基咪達(dá)唑侖(1′-hydroxymidazolam，1′OH-MDZ，批號FD050034-02)和副黃嘌呤(paraxanthine，PX，批號FN081810-03)對照品購自美國Cerilliant公司；咖啡因(caffeine，CAF，批號C11693000)對照品購自德國Dr. EhrenStorfer公司；右美沙芬(dextromethorphan，DM，批號D9684)和右啡烷(dextrorphan，DX，批號D127)對照品購自美國Sigma公司；5-羥基奧美拉唑(5-dydroxyomeprazole，5OH-OPZ，批號H948863)對照品購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；注射用奧美拉唑鈉(omeprazole，OPZ，批號F110219)購自江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司；咪達(dá)唑侖注射液(批號20120106)購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；地西泮(diazepam，DZP，批號1217-9201)對照品購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈和甲醇購自美國Fisher Scientific公司，色譜純；乙酸乙酯購自美國Honeywell公司，色譜純；甲酸購自德國Merk公司，色譜純；甲酸銨購自美國Roe Scientific公司，色譜純；其他試劑均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 動物 SPF級健康♂SD大鼠6只，體質(zhì)量(250±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2012-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件 色譜條件：Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；流動相A 0.01%甲酸水(1 mmol·L-1甲酸銨)，B乙腈，梯度洗脫(0～1 min，5%～20% B；1～7.5 min，20%～40% B；7.5～8 min，40%～85% B)，流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子化(ESI)；離子極性 Positive；多反應(yīng)正離子監(jiān)測(MRM+)；離子噴霧電壓(4 500 V)；離子源溫度(450 ℃)；Gas1(60 psi)；Gas2(65 psi)；氣簾氣壓力(20 psi)；CAF m/z：195.0/138.1；PX m/z：181.1/124.1；OPZ m/z：346.1/198.1；5OH-OPZ m/z：362.1/214.1；DM m/z：272.2/147.1；DX m/z：258.1/157.1；MDZ m/z：326.1/291.1；1′OH-MDZ m/z：342.1/324.1；DZP m/z：285.1/154.0。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定CAF、OPZ、DM、DX和IS DZP對照品1 mg，置于1 mL甲醇中，配制成1 g·L-1溶液作為貯備液(于4 ℃下避光保存)。精密量取CAF、OPZ、DM和MDZ貯備液適量，用甲醇稀釋成4.8、9.8、19.5、39.1、78.1、156、625、391、1 250、2 500、5 000、10 000、20 000 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；精密量取PX、5OH-OPZ、DX、1′OH-MDZ貯備液適量，用甲醇稀釋成4.8、9.8、19.5、39.1、78.1、156、391、625、1 250、2 500 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；精密量取DZP貯備液適量，用甲醇稀釋成1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 靜脈注射混合探針?biāo)幬锶芤旱闹苽?精密稱取CAF 3 mg、DM 15 mg和OPZ 20 mg分別溶解于生理鹽水中。分別吸取3 g·L-1CAF 0.5 mL、15 g·L-1DM 0.5 mL、20 g·L-1OPZ 0.375 mL、5 g·L-1MDZ 0.3 mL配制成3 mL混合探針?biāo)幬锶芤骸?/p>

2.4 血漿樣品處理 100 μL血漿精密加入內(nèi)標(biāo)DZP 10 μL(1 mg·L-1)混勻，加入0.2 mol·L-1乙酸銨溶液100 μL及4 mL乙酸乙酯，振蕩提取5 min，離心，吸取3.5 mL上清液真空揮干，用1 mmol·L-1碳酸鈉水和乙腈混合液200 μL復(fù)溶，高速離心，取上清10 μL進(jìn)樣分析。

2.5 血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限 100 μL血漿精密加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品。在上述條件下，CAF、PX、OPZ、5OH-OPZ、DM、DX、MDZ、1′OH-MDZ最低定量限分別為1.95、0.98、0.48、0.98、0.98、0.48、1.95、1.95 μg·L-1，檢測靈敏度較好，見Tab 1。

2.6 專屬性 本實(shí)驗(yàn)條件下，CAF、PX、OPZ、5OH-OPZ、DM、DX、MDZ、1′OH-MDZ及內(nèi)標(biāo)DZP色譜峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物及內(nèi)標(biāo)物的測定。如Fig 1、2所示，本方法具有較好的專屬性。

2.7 精密度、準(zhǔn)確度及提取回收率 100 μL空白血漿，精密加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品。使CAF終濃度為7.81、31.25、125、1 000 μg·L-1，PX終濃度為3.91、15.63、62.5 μg·L-1，OPZ終濃度為7.81、31.25、125、1 000 μg·L-1，5OH-OPZ終濃度為3.91、15.63、62.5 μg·L-1，DM終濃度為7.81、31.25、125、1 000 μg·L-1，DX終濃度為3.91、15.63、62.5 μg·L-1，MDZ終濃度為7.81、31.25、125、1 000 μg·L-1，1′OH-MDZ濃度為3.91、15.63、62.5 μg·L-1。按“2.2”項(xiàng)下處理樣品，測定血漿中CAF、PX、OPZ、5OH-OPZ、DM、DX、MDZ、1′OH-MDZ的批內(nèi)和批間差異及提取回收率(n=5)。

Tab 1 Calibration curves, retention time and sensitivity of probe drugs

測得CAF批內(nèi)和批間RSD分別為(1.65%～9.97%和-2.50%～5.70%)；PX(1.99%～4.18%和5.75%～9.15%)；OPZ(4.09%～5.45%和6.65%～10.92%)；5OH-OPZ(3.10%～4.59%和9.08%～13.20%)；DM(2.89%～5.70%和4.78%～7.12%)；DX(1.21%～6.43%和6.64%～10.03%)；MDZ(2.23%～8.15%和2.92%～10.39%)；1′OH-MDZ(2.44%～12.96%和5.10%～12.15%)。測得探針?biāo)幬?代謝產(chǎn)物的提取回收率分別為：CAF(86.51±3.40)%/PX(81.60±6.67)%、OPZ(61.50±2.27)%/5OH-OPZ(49.98±5.66)%、DM(87.16±5.29)%/DX(89.19±3.09)%、MDZ(93.19±3.16)%/1′OH-MDZ(85.48±9.11)%。

2.8 穩(wěn)定性 100 μL空白血漿精密加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品，使CAF、PX、OPZ、5OH-OPZ、DM、DX、MDZ、1′OH-MDZ濃度同“2.7”。測得CAF在-80 ℃冰箱保存7 d和4 ℃放置24 h后，RSD分別為(2.68%～9.49%和-7.58%～12.94%)；PX(3.41%～13.50%和2.23%～5.56%)；OPZ(3.08%～6.13%和1.87%～6.76%)；5OH-OPZ(4.36%～12.03%和3.24%～5.65%)；DM(6.73%～15.27%和0.71%～4.58%)；DX(3.21%～6.20%和2.43%～11.05%)；MDZ(4.93%～13.16%和2.41%～5.65%)；1′OH-MDZ(4.96%～12.43%和2.97%～10.88%)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血漿樣品穩(wěn)定性較好。

2.9 基質(zhì)效應(yīng) 6只大鼠血漿和超純水各100 μL，按照“2.2”項(xiàng)下處理樣品，不加內(nèi)標(biāo)，揮干后加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，揮干復(fù)溶，使CAF、PX、OPZ、5OH-OPZ、DM、DX、MDZ、1′OH-MDZ濃度同“2.7”。各基質(zhì)每個(gè)濃度平行設(shè)置6個(gè)樣品，分別記錄峰面積為A1和A2。內(nèi)標(biāo)DZP(100 μg·L-1)同時(shí)進(jìn)行考察。測得結(jié)果A1/A2的值在85%～115%之間，表明上述探針?biāo)幬?代謝產(chǎn)物基本無基質(zhì)效應(yīng)。

3 藥代動力學(xué)研究

大鼠股靜脈給予混合探針?biāo)幬?，劑量為CAF 1 mg·kg-1、OPZ 5 mg·kg-1、DM 5 mg·kg-1、MDZ 1 mg·kg-1，于給藥后0.05、0.12、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24 h由眼內(nèi)眥取血250 μL于肝素化試管中，離心取血漿，于-80 ℃冷凍保存。測定探針?biāo)幬锛按x產(chǎn)物濃度，繪制藥時(shí)曲線，結(jié)果如Fig 3所示。WinNonlin軟件以非房室模型計(jì)算其主要的代謝動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見Tab 2。

4 討論

4.1 探針底物選擇 CYP底物具有重疊性，且表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有種屬差異性。實(shí)驗(yàn)中選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動物及特異性探針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果可產(chǎn)生明顯影響。為確保探針的特異性及靈敏性，選擇時(shí)應(yīng)考慮底物是否經(jīng)單一CYP亞型代謝；代謝物是否進(jìn)行連續(xù)代謝等因素[5-6]。本研究建立了同時(shí)測定大鼠血漿中4種探針?biāo)幬锛按x產(chǎn)物的LC-MS/MS方法。目前，“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄓ糜谘芯緾YP450酶活性，探針?biāo)幬锏倪x擇主要有以下幾種，結(jié)果見Tab 3?；谔结?biāo)幬锝M合在體內(nèi)的安全性、對酶活性檢測的靈敏度和特異性，本研究選擇了CAF、OPZ、DM、MDZ作為CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的探針?biāo)幬?。這種組合探針底物之間幾乎不發(fā)生藥物相互作用，且能準(zhǔn)確反映酶活性。

CYP1A2選擇CAF作為特異性探針?biāo)幬?，其代謝產(chǎn)物為PX。以往研究使用茶堿[11]作為測定CYP1A2活性的探針?biāo)幬?，但是由于茶堿類藥物代謝差異大，有效血濃度安全范圍窄，易發(fā)生中毒事件，在臨床使用中要監(jiān)測其血藥濃度[12]，不適合作為探針?biāo)幬餃y定代謝酶活性。非那西丁主要用于體外實(shí)驗(yàn)，但是也有文獻(xiàn)證明其在體內(nèi)研究中也可反映CYP1A2活性[13]。OPZ是評價(jià)人和大鼠CYP2C19活性的常用探針?biāo)幬铩PZ經(jīng)CYP450催化代謝，主要的代謝途徑由CYP2C19介導(dǎo)，代謝產(chǎn)物為5OH-OPZ[14]，OPZ已經(jīng)成為CYP2C19的特異性探針，經(jīng)與S-美芬妥英比較得到一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15]。S-美芬妥英是最經(jīng)典的CYP2C19的探針?biāo)幬?，但由于其存在潛在的毒性、催眠和?zhèn)靜作用，限制了其在體內(nèi)測定代謝酶活性研究中的應(yīng)用。CYP2D6在肝臟中約占CYP酶量的1%～2%，卻代謝30%的處方藥，DM是其代謝的特異性探針?biāo)幬?，O-去甲基作用由CYP2D6特異性催化[16]。而美托洛爾在口服使用中，存在巨大的個(gè)體差異，70%的代謝由CYP2D6介導(dǎo)[17]，故本實(shí)驗(yàn)未采用其作為CYP2D6的探針底物。MDZ是咪唑苯并二氮類藥物，在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4/5(人體)或CYP3A1/2(大鼠)代謝轉(zhuǎn)化成1′OH-MDZ[18]，由于其代謝的特異性可以較為準(zhǔn)確地反映CYP3A4的活性，因此MDZ是CYP3A4的推薦探針?biāo)幬铩?/p>

4.2 前處理方法 本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取的方式一次提取出全部的探針?biāo)幬锖痛x產(chǎn)物，成本低、操作簡單。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，比較乙醚和乙酸乙酯的液液萃取、甲醇和乙腈蛋白沉淀的方法，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取率最高。其次，由于探針?biāo)幬锖痛x產(chǎn)物的化合物性質(zhì)不同，在血漿樣品中加入了乙酸銨、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、純水處理，經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，加入碳酸鈉后，OPZ的回收率高，但DM的回收率不穩(wěn)定；提取中加入乙酸銨，OPZ和5OH-OPZ的回收率在40%～60%之間且比較穩(wěn)定，不影響其定量測定，其他的探針?biāo)幬锛按x產(chǎn)物提取回收率穩(wěn)定且大于70%。全部的提取過程中，每個(gè)樣品只需要100 μL血漿，采血量少，能使大鼠保持較好的生理狀態(tài)，從而真實(shí)地反映探針?biāo)幬锛按x產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of probe drugs and±s,n=5)

Fig 1 MS2chromatograms of probe drugs, metabolites and internal standard

Fig 2 XIC of CAF, PX, OPZ, 5OH-OPZ, DM, DX, MDZ, 1′OH-MDZ and DZP

A:Blank plasma; B: Plasma sample spiked with probe drugs/mets and IS(CAF: 1.95 μg·L-1, PX: 0.98 μg·L-1, OPZ: 0.48 μg·L-1, 5OH-OPZ: 0.98 μg·L-1, DM: 0.98 μg·L-1, DX: 0.48 μg·L-1, MDZ: 1.95 μg·L-1, 1′OH-MDZ: 1.95 μg·L-1, DZP: 100 μg·L-1); C: Plasma obtained from rat after intravenous administration of probe drugs(CAF:0.05 h, PX:1.5 h, OPZ:0.05 h, 5OH-OPZ: 0.05 h, DM: 0.05 h, DX: 0.25 h, MDZ: 0.05 h, 1′OH-MDZ:0.25 h)

Fig 3 Mean plasma concentration-time profiles of the CAF,OPZ, DM and MDZ after intravenous administration of probe drugs(n=5)

4.3 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化 質(zhì)譜條件下選擇MRM+進(jìn)行質(zhì)譜掃描，確定CAF/PX、OPZ/5OH-OPZ、DM/DX、MDZ/1′OH-MDZ在正離子模式響應(yīng)更好。在流動相選擇方面，乙腈的洗脫強(qiáng)度大于甲醇，在流動相中加入0.01%甲酸和1 mmol·L-1甲酸銨，能提高各離子對的質(zhì)譜響應(yīng)值。采用梯度洗脫，有利于待測藥物以較好的峰形在較短時(shí)間內(nèi)出峰，縮短分析時(shí)間至12 min內(nèi)。液液萃取后的樣品在復(fù)溶過程中，加入1 mmol·L-1碳酸鈉可以提高OPZ、5OH-OPZ、MDZ、1′OH-MDZ的質(zhì)譜響應(yīng)值。

4.4 體內(nèi)研究 目前肝藥酶研究中，主要是基于“Cocktail”探針?biāo)幬锓?，通過體外微粒體溫孵的方法評價(jià)P450酶的活性[19]。通過體外的研究可以直接觀察酶對底物的選擇性及底物對酶的抑制和誘導(dǎo)，簡單快速，但是體內(nèi)代謝環(huán)境復(fù)雜，體外實(shí)驗(yàn)不能完全真實(shí)反映代謝酶在體內(nèi)的變化，所以應(yīng)綜合考慮藥物對代謝酶活性影響的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在研究肝藥酶活性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，主要集中在通過測定探針?biāo)幬镌偷乃幋鷧?shù)，反映肝藥酶的活性[20-21]。由于單一探針?biāo)幬锏木窒扌?，不能較系統(tǒng)全面地反映肝藥酶活性?！癈ocktail”探針?biāo)幬锓赏瑫r(shí)使用多種探針?biāo)幬铮芯慷鄠€(gè)代謝途徑，使多種同工酶的表型信息被同時(shí)檢測出來，真實(shí)地反映藥物的代謝途徑[22]。這種方法能在同一只動物上得到多個(gè)數(shù)據(jù)， 減小個(gè)體間差異對數(shù)據(jù)波動的影響， 是藥物研發(fā)早期高通量篩選、 藥物代謝機(jī)制研究以及上市藥物再評價(jià)等的有效手段[23]。所以選擇探針?biāo)幬锖痛x產(chǎn)物同時(shí)測定的方法，才能更加準(zhǔn)確反映肝藥酶活性，得到有效、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

在動物的給藥劑量方面，與以往文獻(xiàn)報(bào)道探針?biāo)幬锝o藥劑量比較，高劑量CAF能引起CYP1A2 mRNA表達(dá)增加，誘導(dǎo)其活性[24]；高劑量MDZ具有鎮(zhèn)靜催眠作用，并可能影響酶的活性及改變動物的生理狀態(tài)，從而掩蓋化合物對CYP3A的抑制作用[25]，同時(shí)混合探針?biāo)幬锊捎渺o脈給藥方式，可避免MDZ被腸CYP3A代謝所引起的實(shí)驗(yàn)誤差?；谏鲜鲈?，我們選擇了比以往研究報(bào)道更低的給藥劑量，可以使探針?biāo)幬飳Υ笫笊頎顩r的影響降至更低水平，有利于得到更為準(zhǔn)確的肝藥酶代謝活性數(shù)據(jù)。

本研究建立的LC-MS/MS檢測方法，運(yùn)用多反應(yīng)正離子監(jiān)測模式同時(shí)檢測探針?biāo)幬锏哪鸽x子和子離子碎片信息可有效排除干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性。該檢測方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，適用于藥物對肝藥酶CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4代謝活性影響的深入研究。

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Pharmacokinetics studies on caffeine, dextromethorphan,omeprazole, midazolam and their metabolites in rat plasma by LC-MS/MS

XU Li-yun1, HOU Cong-song1,2, YANG Zhi-hong1, SUN Xiao-bo1

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China; 2.HebeiNorthUniversity,ZhangjiakouHebei075000,China)

Aim To develop a sensitive, rapid and accurate LC-MS/MS method for the simultaneous determination of cytochrome P450 probe substrates, including caffeine and its metabolite paraxanthine for CYP1A2, omeprazole and its metabolite 5-hydroxyomeprazole for CYP2C19, dextromethorphan and its metabolite dextrorphan for CYP2D6, midazolam and its metabolite 1′-hydroxymidazolam for CYP3A4.Methods Probe drugs with the IS diazepam were extracted using ethyl acetate. Gradient elution was performed on an Agilent Eclipse Plus-C18column(50 mm×2.1 mm, 3.5 μm). The mobile phase consisted of 0.01% formic acid(1 mmol·L-1ammonium formate) and acetonitrile. The flow rate was 0.3 mL·min-1, and the injection volume was 10 μL. The analyte was detected using electrospray ionization(ESI) in positive multiple reaction monitoring(MRM+) mode. The reaction selected ions were 195.0/138.1 m/z for caffeine, 181.1/124.1 m/z for paraxanthine, 346.1/198.1 m/z for omeprazole, 362.1/214.1 m/z for 5-hydroxyomeprazole, 272.2/147.1 m/z for dextromethorphan, 258.1/157.1 m/z for dextrorphan, 326.1/291.1 m/z for midazolam, 342.1/324.1 m/z for 1′-hydroxymidazolam and 285.1/154.0 m/z for diazepam as internal standard.Results The linear ranges of caffeine, paraxanthine, omeprazole, 5-hydroxyomeprazole, dextromethorphan, dextrophan, midazolam and 1′-hydroxymidazolam were 1.95～2 000, 0.98～250, 0.48～2 000, 0.98～250, 0.98～2 000, 0.48～125, 1.95～2 000 and 1.95～250 μg·L-1respectively. The RSD of all probe drugs was less than 15% and matrix effects in plasma on the ionization of probe drugs were negligible.Conclusion This sensitive and rapid LC-MS/MS method is suitable for determination of the drug/metabolite concentrations in plasma, so as to study the metabolism of CYP1A2, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 in depth.

Cocktail probe drugs method; probe drug; metabolite; liver metabolism enzyme; CYP450; LC-MS/MS

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.046.html

2016-11-06,

2016-12-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473579，81273654，81102879)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No 20101106120049)；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(No 2013ZX09103002-022)

徐利云(1990-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥物代謝動力學(xué)，E-mail：xuliyun579@163.com; 候叢頌(1985-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥物代謝動力學(xué)，共同第一作者，E-mail：houcongsong@126.com; 楊志宏(1976-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物代謝動力學(xué)及中藥復(fù)方配伍機(jī)制，通訊作者，E-mail：zhyang@implad.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.023

A

1001-1978(2017)02-0268-08

R-332；R322.47；R345.99；R446.11；R969.1；R977.3