參麥注射液主要成分與卒中關聯(lián)的網(wǎng)絡藥理作用機制和實驗驗證

呂燕妮, 付龍生, 周 健，潘曉林，陳璿瑛，萬 青

(南昌大學第一附屬醫(yī)院藥學部，江西 南昌 330006)

參麥注射液主要成分與卒中關聯(lián)的網(wǎng)絡藥理作用機制和實驗驗證

呂燕妮, 付龍生, 周 健，潘曉林，陳璿瑛，萬 青

(南昌大學第一附屬醫(yī)院藥學部，江西 南昌 330006)

Network pharmacological mechanism of main components of Shenmai injection related with stroke and experimental verification

LYU Yan-ni, FU Long-sheng, ZHOU Jian, PAN Xiao-lin, CHEN Xuan-ying, WAN Qing

(DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

網(wǎng)絡藥理學; 參麥注射液; 卒中; 作用機制; 信號通路; 腦缺血/再灌注損傷

network pharmacology; Shenmai injection; stroke: action mechanism; signaling pathway; cerebral ischemia/reperfusion injury

參麥注射液是傳統(tǒng)中藥紅參與麥冬的復方制劑，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈等功效。除對心臟和免疫功能疾病的防治外，對缺血性卒中也有明顯療效，其可協(xié)同降壓藥、溶栓藥等西藥，改善腦缺血預后。兩味主藥中，紅參可保護血管內(nèi)皮細胞，抗脂質過氧化和清除自由基，麥冬亦可通過保護血管內(nèi)皮細胞，增強免疫力和耐缺氧能力。然而，由于化學成分的復雜性和功能主治的多樣性，其與缺血性卒中關聯(lián)的作用機制仍不明確， 仍停留在整體動物指標，缺乏深入的分子生物學水平，尤其缺乏分子信號通路水平研究，其更能有效地作為生物標記物反映藥理效應和作用機制的變化。本研究通過網(wǎng)絡藥理學[1-2]與實驗驗證等方法，挖掘參麥注射液中主要成分與缺血性卒中間的關聯(lián)，闡釋其與臨床療效相關的分子機制，有利于加強中藥基礎與臨床研究的溝通，更好地服務于臨床。

1 材料與方法

1.1 文本挖掘 在 TCMGeneDIT系統(tǒng)中，以兩味主藥紅參、麥冬中的20個成分為研究對象(其中魯司可皂苷元和薯蕷皂苷元以這2個皂苷元的英文名為搜索詞)，搜索條件的閾值為大于概率0.95，以自動文本挖掘方式搜索與化合物相互作用的蛋白信息。同樣在Agilent Literature Search中，以人參和麥冬英文名進行搜索，對TCMGeneDIT數(shù)據(jù)庫中的蛋白信息進行補充。

1.2 反向對接 在Pharmmapper數(shù)據(jù)庫中，以成分的mol2格式輸入search欄中，設置參數(shù)為不選擇構象變化，其余設置參數(shù)為默認選項，截斷值為2.0，選擇人類數(shù)據(jù)庫，產(chǎn)生默認的300個構象后，按照打分最終選取50個蛋白構象。將反向對接產(chǎn)生的構象與“1.1”節(jié)中文本挖掘所產(chǎn)生的構象，合并為參麥注射液作用蛋白集。

1.3 參麥注射液多成分-蛋白網(wǎng)絡與信號通路的映射 在Genecards數(shù)據(jù)庫中，以stroke進行搜索，搜索出與stroke相關聯(lián)的2 494個蛋白，與“1.2”節(jié)中蛋白集進行交集，最終得參麥注射液化合物相互作用蛋白群。以相互作用蛋白群中的蛋白名為檢索詞，從Genecards、BIND、BioGRID、IntAct、MINT等數(shù)據(jù)庫中，建立蛋白關聯(lián)詞條，Cytoscape中建立蛋白相互作用網(wǎng)絡。ClusterONE插件提取具有顯著性差異(P<0.05)的子網(wǎng)絡，并將網(wǎng)絡中關鍵蛋白進行Biocart信號通路映射。

1.4 小鼠局灶性中動脈梗死(MCAO)模型制備及參麥注射液給藥 C57BL/6J小鼠，體質量18～22 g，揚州大學比較醫(yī)學中心提供。參麥注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司)。術前1 h參麥注射液5 mL·kg-1腹腔注射。

1.5 Western blot法與統(tǒng)計學分析 Western blot法檢測小鼠皮層邊緣組織p38、ERK1、ERK2、IKKα、IKKβ表達(抗體1 ∶1 000稀釋)。實驗數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行單因變量多因素方差分析。

2 結果

2.1 參麥注射液主要成分-蛋白網(wǎng)絡的分析 參麥注射液的20個成分，共作用于61個蛋白，參麥注射液多成分蛋白網(wǎng)絡平均Degree為4.165，其中14個成分其連接度達到5以上，人參皂苷與全部蛋白網(wǎng)絡中的蛋白均有相互作用。2個麥冬皂苷元成分與CASP3、CHUK、HSAP90AA1、MAPK1、MAPK14、NFKB1 6個蛋白有相互作用，這6個蛋白在網(wǎng)絡中 占據(jù)高連接度，對網(wǎng)絡健康度有極大影響。

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡的分析 60個蛋白構成無孤立結點的蛋白相互作用網(wǎng)絡，提取差異有顯著性(P<0.01)的子網(wǎng)絡1個，子網(wǎng)絡中含有關鍵蛋白19 個(Tab 1)，在Biaocart信號通路上映射及富集分析(Tab 2)，涉及MAPK、NF-κB、AKT與Toll樣受體等信號通路。

2.3 關鍵蛋白和信號通路的驗證 MAPK信號通路是富集指數(shù)P最小的信號通路，是參麥注射液作用于MCAO模型最有可能的潛在信號通路，與MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14蛋白所調控的MAPK受體及信號通路變化一致。參麥注射液干預后，對MCAO模型中上調的p38、ERK1、IKKβ的磷酸化表達有明顯下調作用(P<0.01)。

Tab 1 Protein interaction network with significant difference extracted via ClusterONE (protein represented using its gene name)

Tab 2 Biaocart signaling pathways mapped on protein interaction network with significant difference

3 討論

本研究中，參麥注射液主要成分蛋白網(wǎng)絡平均Degree為4.165，不僅表明中藥多成分、多靶點的特點，同時也說明參麥注射液主要成分對網(wǎng)絡的健康度影響較大。麥冬皂苷作用于含6個蛋白的子網(wǎng)絡，剔除這6個蛋白后，網(wǎng)絡度由4.165下降到2.332，平均蛋白連接度下降1.833，表明麥冬皂苷雖然作用的蛋白較少，但是能夠作用于網(wǎng)絡的關鍵蛋白結點。

參麥注射液主要成分作用的蛋白包括絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT、PI3K蛋白、絲裂原激酶蛋白家族、熱休克蛋白90、Toll樣受體4等，其參與炎癥反應、細胞代謝與細胞免疫等作用。而作用的主要信號通路中，p38MAPK信號通路可調節(jié)腦中水通道蛋白9的表達，調節(jié)局部腦缺血[3]。AKT-GSK3-CREB信號通路參與提高腦缺血后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF表達，保護腦缺血[4]。Toll 4受體所代表的Toll信號通路，可作用于HMGB-1，參與腦缺血/再灌注作用[5]。NF-κB和TNF信號通路所代表的經(jīng)典炎癥通路[6]，參與炎癥因子的釋放，與缺血性卒中的機制密切相關。參麥注射液干預MCAO模型后，p38、ERK1和IKKβ的表達降低，證實了網(wǎng)絡藥理學可為實驗驗證提供先導信息，初步揭示其防治疾病的分子機制，為進一步實驗研究奠定科學基礎。

(致謝：本實驗于南昌大學第一附屬醫(yī)院科研平臺實驗室完成。感謝實驗室老師與全體同學的大力幫助！)

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時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.058.html

2016-10-12，

2016-11-10

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)課題資助(No 2014A04)

呂燕妮(1986-), 女，博士，主管藥師, 研究方向：臨床藥理學和藥物不良反應監(jiān)測,通訊作者，E-mail：lvyanni@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.029

A

1001-1978(2017)02-0293-02

R-332；R282.71；R284.1；R329.25；R743.310.22