刺槐素對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的影響

司玲玲，馬 俊，任歡歡，任博雪，李德芳，鄭秋生，

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002;2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

刺槐素對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的影響

司玲玲1，馬 俊2，任歡歡1，任博雪1，李德芳2，鄭秋生1，2

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002;2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

目的 研究刺槐素對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的影響，探究刺槐素雌激素樣作用的主要介導(dǎo)受體。方法 磺酰羅丹明B(SRB)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，qPCR檢測(cè)雌激素受體-α(ERα)、雌激素受體-β(ERβ)、細(xì)胞增殖抗原標(biāo)記物(Ki67)mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)ERα、ERβ蛋白表達(dá)。結(jié)果 刺槐素濃度為0.001～10 μmol·L-1，能促進(jìn)T47D細(xì)胞增殖，使S和G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加，增殖指數(shù)升高，同時(shí)增加Ki67 mRNA的表達(dá)，此作用可被雌激素受體拮抗劑ICI 182.780所拮抗。刺槐素及17β-雌二醇(E2)均可上調(diào)ERα和ERβ的表達(dá)，刺槐素聯(lián)合ERα受體拮抗劑(MPP)可逆轉(zhuǎn)刺槐素的促增殖作用，使S和G2/M期的細(xì)胞比例明顯降低，減少Ki67 mRNA的表達(dá)；但刺槐素聯(lián)合ERβ受體拮抗劑(PHTPP)處理雖可抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)，使S和G2/M期的細(xì)胞比例降低，減少Ki67 mRNA的表達(dá)，但作用不明顯。結(jié)論 刺槐素具有雌激素樣作用，在0.001～10 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，可通過調(diào)節(jié)ERα受體表達(dá)來促進(jìn)T47D細(xì)胞的增殖。

刺槐素；雌激素；T47D細(xì)胞；雌激素α受體；雌激素β受體；雌激素樣作用；細(xì)胞增殖

乳腺癌為女性最普遍的惡性腫瘤之一，并且引起女性死亡極高，每年約達(dá)40萬人，僅次于肺癌[1]。乳腺癌治療取決于乳腺癌的類型和分期，至今，傳統(tǒng)的治療手段包括手術(shù)、激素治療、全身化療、放療和分子靶向治療等[2]。尋找高效的治療藥物，并能有效地提高乳腺癌綜合治療效果，減少副作用，降低死亡率，已成為當(dāng)前乳腺癌治療研究重點(diǎn)之一。

黃酮類化合物是存在于植物中的天然化合物，目前，已知的黃酮類化合物大概有8 000多種。據(jù)報(bào)道，黃酮類化合物具有降血壓、抗真菌、抗病菌等作用，其中補(bǔ)骨脂黃酮、異補(bǔ)骨脂黃酮等多種黃酮類化合物對(duì)雌激素敏感性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7均具有雌激素樣活性[3]。刺槐素(acacetin，5,7-二羥基-4-甲氧基黃酮)是從刺槐中提取的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗瘧原蟲的功能[4]，它可以抑制胃癌AGS細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]；拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ誘導(dǎo)的DNA損傷是刺槐素產(chǎn)生細(xì)胞毒性的潛在因素[6]。據(jù)報(bào)道，刺槐素、染料木素和其他植物雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，并有弱雌激素活性[7]，刺槐素用于乳腺癌的治療已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注。本課題研究刺槐素對(duì)雌激素依賴性腫瘤細(xì)胞T47D增殖的影響，為揭示其發(fā)揮雌激素樣作用的機(jī)制提供初步的理論基礎(chǔ)，給植物雌激素產(chǎn)品的研發(fā)提供確切的依據(jù)，而且可以為指導(dǎo)臨床婦科用藥，特別是為更年期婦女保健及乳腺癌等雌激素依賴性腫瘤患者的用藥提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人乳腺導(dǎo)管癌T47D細(xì)胞，購自ATCC。

1.2 藥品與試劑 刺槐素、17β-雌二醇(E2)、二甲基亞砜(DMSO)、磺基羅丹明B(SRB)、預(yù)染蛋白Marker、First Strand cDNA Synthesis Kit，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMEM、無酚紅DMEM、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清(CDT-FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；雌激素受體(ER)拮抗劑(ICI 182.780)、ERα拮抗劑(MPP)、ERβ拮抗劑(PHTPP)，anti-estrogen receptor alpha(anti-ERα)抗體、anti-estrogen receptor beta(anti-ERβ)抗體、goat anti-rabbit IgG，Abcam公司；NC膜、蛋白酶抑制劑(PMSF)、4×蛋白上樣緩沖液、RIPA 裂解液，Solarbio公司。

1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 3131)、多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001)，美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)(ZHJH-1112B)，上海智誠分析儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡(MIC00266)，德國(guó)ZEISS公司；倒置生物顯微鏡(BDS200-PH)，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) T47D細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。實(shí)驗(yàn)開始前3 d，PBS洗滌3次，改成無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)，直至耗盡細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的雌激素。

2.2 SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)分成9組：control、刺槐素組(A)、刺槐素+ICI 182.780組、E2組、E2+ICI 182.780組、刺槐素+MPP組、E2+MPP組、刺槐素+PHTPP組、E2+PHTPP組。T47D細(xì)胞使用無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)3 d。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，8×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，各組加入相應(yīng)藥物(刺槐素的給藥濃度為0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L-1，ICI 182.780給藥濃度為1 μmol·L-1，E2給藥濃度為0.01 μmol·L-1，MPP給藥濃度為1 μmol·L-1，PHTPP給藥濃度為1 μmol·L-1)；每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入三氯乙酸(TCA，終濃度為10%)，4 ℃固定1～2 h。固定結(jié)束后，吸棄孔內(nèi)液體，去離子水洗滌4～5次，室溫干燥。每孔加入100 μL 0.4% SRB，染色10 min，吸棄板孔內(nèi)SRB染液，1%乙酸洗滌5遍，室溫干燥。加入150 μL DMSO，充分振蕩溶解10 min，Thermo 3001多功能酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光值(A510 nm)[8]，計(jì)算平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

增殖率(proliferation rate，PR)/%=(實(shí)驗(yàn)組A值/溶劑對(duì)照組A值)×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 T47D細(xì)胞用無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，以5×105/皿接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，改成無酚紅DMEM(含0.5% CDT-FBS)完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d，細(xì)胞統(tǒng)一在G0期，換成無酚紅DMEM培養(yǎng)液(5% CDT-FBS，且含藥物濃度同“2.2”項(xiàng))，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇，混勻，4℃冰箱過夜，棄去乙醇，PBS洗2遍，加入碘化丙啶染液(0.03 g·L-1)、RNase A(0.3 g·L-1)，37℃避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布比例，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)[9]。

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)

2.4 qPCR檢測(cè)雌激素受體相關(guān)基因的mRNA表達(dá) T47D細(xì)胞經(jīng)無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)3 d，1×106/皿接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，各組更換含相應(yīng)藥物(給藥濃度同“2.2”項(xiàng))的無酚紅培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，最后得PCR產(chǎn)物，并分析數(shù)據(jù)。PCR引物序列見Tab 1[10]。

Tab 1 Primer sequences of qPCR

2.5 Western blot法檢測(cè)ERα和ERβ蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理同“2.4”。收集各處理組細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS(pH 7.4)洗2遍，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清。蛋白經(jīng)煮沸處理后，各組取 30 μg蛋白樣品，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印NC膜上，加入一抗，4 ℃過夜，次日以TBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗，室溫孵育1 h；以TBST搖床洗膜3次，每次10 min，加入ECL顯色液，經(jīng)免疫印跡成像系統(tǒng)顯影檢測(cè)目的蛋白。

3 結(jié)果

3.1 刺槐素對(duì)T47D細(xì)胞增殖的影響 首先，分別使用0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L-1刺槐素處理人乳腺癌T47D細(xì)胞。如Fig 1所示,與對(duì)照組相比，刺槐素對(duì)T47D細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)；并且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，刺槐素對(duì)T47D細(xì)胞的促增殖效應(yīng)增強(qiáng)，72 h作用最明顯(P<0.01)。0.01、1、10 μmol·L-1刺槐素處理人乳腺癌T47D細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示(Fig 2)，與對(duì)照組相比，刺槐素作用于T47D細(xì)胞72 h后，可以增加S期和G2/M細(xì)胞的比例，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。同時(shí)，qPCR結(jié)果如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，刺槐素給藥后，可上調(diào)Ki67基因表達(dá)。

Fig 1 Effect of acacetin on proliferation rate of T47D cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2 刺槐素的雌激素活性檢測(cè) 使用10 μmol·L-1刺槐素及0.01 μmol·L-1E2分別處理T47D細(xì)胞24、48、72 h，結(jié)果表明(Fig 4)，刺槐素和E2能促進(jìn)T47D細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。然后，使用1 μmol·L-1ICI 182.780與刺槐素或E2共同處理T47D細(xì)胞，結(jié)果表明(Fig 4)，與刺槐素或E2單獨(dú)處理組比較，細(xì)胞增殖率明顯降低。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 5)，與對(duì)照組相比，10 μmol·L-1刺槐素作用于T47D細(xì)胞72 h后，可以增加S期和G2/M細(xì)胞的比例(P<0.01)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，但該作用稍弱于E2組；當(dāng)加入ICI 182.780后，S期和G2/M細(xì)胞的比例明顯下降。同時(shí)，Ki67檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 6)，與對(duì)照組相比，刺槐素可以升高Ki67 mRNA的水平，刺槐素聯(lián)合ICI 182.780處理組與刺槐素單獨(dú)處理組相比，可抑制Ki67 mRNA的表達(dá)。

3.3 刺槐素雌激素活性的主要介導(dǎo)受體 分別使用刺槐素(10 μmol·L-1)、E2(0.01 μmol·L-1)、MPP(1 μmol·L-1)和PHTPP(1 μmol·L-1)處理T47D細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERα和ERβ的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，MPP下調(diào)ERα的表達(dá)，PHTPP下調(diào)ERβ的表達(dá)。與刺槐素組相比，刺槐素聯(lián)合MPP組中ERα的mRNA表達(dá)明顯降低，蛋白表達(dá)也有所降低，另外，刺槐素聯(lián)合PHTPP處理可明顯降低ERβ的mRNA表達(dá)(Fig 7)。

Fig 2 Effect of acacetin on cell cycle of T47D cells

A:Cell cycle distribution;B:Proliferation index.**P<0.01vscontrol

Fig 3 Effect of acacetin on Ki67 mRNA expression in T47D cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 4 Effects of acacetin, E2 and

T47D cells were treated respectively with acacetin(A),17β-estradiol(E2) and estrogen receptor inhibitor ICI 182.780(ICI).1:Control;2:A;3:A+ICI;4:E2;5:E2+ICI.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsacacetin or E2 group

使用上述濃度的藥物處理T47D細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。Fig 8A為MPP對(duì)T47D細(xì)胞增殖率的結(jié)果，與刺槐素或者E2的單獨(dú)處理組相比，刺槐素聯(lián)合MPP組、E2聯(lián)合MPP組的細(xì)胞增殖率降低，無時(shí)間依賴效應(yīng)。Fig 8B為PHTPP處理對(duì)T47D細(xì)胞增殖率的結(jié)果，結(jié)果顯示，與刺槐素或者E2的單獨(dú)處理組相比，刺槐素聯(lián)合PHTPP組、E2聯(lián)合PHTPP組的細(xì)胞增殖率無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 9)，與單獨(dú)加刺槐素組比較，刺槐素聯(lián)合MPP組S期和G2/M期細(xì)胞的比例明顯下降。而刺槐素聯(lián)合PHTPP組S期和G2/M期細(xì)胞的比例無明顯改變。同時(shí)，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 10)，與單獨(dú)加刺槐素組比較，刺槐素聯(lián)合MPP組可抑制Ki67的mRNA表達(dá)。而刺槐素聯(lián)合PHTPP組無明顯變化。以上結(jié)果均說明，在T47D細(xì)胞中，刺槐素可能主要是通過ERα發(fā)揮其雌激素活性，即主要通過ERα受體介導(dǎo)促進(jìn)ER陽性乳腺癌細(xì)胞增殖。

4 討論

T47D細(xì)胞是雌激素敏感性人乳腺癌細(xì)胞，ERα、ERβ均為陽性，可以特異性地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)，影響T47D細(xì)胞增殖，故該細(xì)胞普遍應(yīng)用于快速篩選和評(píng)價(jià)雌激素。ER存在于正常乳腺組織上皮細(xì)胞，而在乳腺癌組織ER陽性表達(dá)，說明癌組織部分保存了正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，所以這類患者通常惡性程度低，內(nèi)分泌治療比較有效。大約30%的乳腺癌患者屬于雌激素依賴性，乳腺癌患者在絕經(jīng)后，此比例則占據(jù)一大半，此類雌激素依賴性的患者體內(nèi)具有雌激素受體且需要雌激素來維持腫瘤的生長(zhǎng)[12-13]。本研究主要針對(duì)植物性雌激素藥物在乳腺癌內(nèi)分泌治療中的應(yīng)用進(jìn)行探究，為植物性雌激素在婦女保健和婦科病癥治療的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

Fig 5 Effects of acacetin, E2 and ICI 182.780 on cell cycle of T47D cells

A: Cell cycle distribution; B: Proliferation index.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsacacetin or E2 group

Fig 6 Effects of acacetin, E2 and ICI 182.780 on Ki67 mRNA expression in T47D cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsacacetin or E2 group

本實(shí)驗(yàn)中SRB增殖檢測(cè)結(jié)果表明，刺槐素在0.001～10 μmol·L-1范圍內(nèi)能促進(jìn)T47D細(xì)胞的增殖，此作用與E2作用相同。細(xì)胞周期受到精確的調(diào)控，復(fù)雜卻有序。Ki67是G1、S、G2、M期細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，由于G0期沒有這種蛋白，所以Ki67蛋白的表達(dá)能夠作為判斷腫瘤細(xì)胞增殖活性的一種可靠指標(biāo)[11]。mRNA檢測(cè)結(jié)果表明刺槐素可明顯提高Ki67的mRNA水平。同時(shí)刺槐素對(duì)細(xì)胞增殖周期的影響與E2趨勢(shì)相同，即提高細(xì)胞分裂增殖指數(shù)，主要表現(xiàn)在S期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例也有所上升。以上結(jié)果表明，刺槐素在0.001～10 μmol·L-1內(nèi)可有效促進(jìn)T47D細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出明顯的雌激素樣作用。接著探討刺槐素是否通過雌激素受體發(fā)生作用，E2組和刺槐素組同時(shí)加入ICI 182.780，結(jié)果證明刺槐素誘導(dǎo)T47D細(xì)胞增殖作用能被ICI 182.780完全拮抗。進(jìn)而用刺槐素聯(lián)合MPP或PHTPP共同作用細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)刺槐素組和雌二醇組加入MPP后，細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，與刺槐素和雌二醇組相比差異具有顯著性；而PHTPP對(duì)細(xì)胞的增殖與刺槐素或雌二醇組相比，差異無顯著性。說明刺槐素的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用可能主要是由ERα介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)中，刺槐素促增殖效應(yīng)隨ERα拮抗劑的加入而被削弱了，說明刺槐素不僅會(huì)促進(jìn)ERα基因表達(dá)，而且還可能通過ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路發(fā)揮促增殖效應(yīng)。

Fig 7 Effects of acacetin, E2, ERα inhibitor and ERβ inhibitor on mRNA and protein expressions of ERα and ERβ in T47D cells

A:ERα mRNA expression; B: ERβ mRNA expression; C: ERα protein expression; D: ERβ protein expression.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsacacetin or E2 group.

Fig 8 Effects of acacetin, E2, ERα inhibitor and ERβ inhibitor on proliferation rate of T47D cells

A: ERα inhibitor (MPP). 1: Control; 2: A; 3: A+MPP; 4: E2; 5: E2+MPP. B: ERβ inhibitor (PHTPP). 1: Control; 2: A; 3: A+PHTPP; 4: E2; 5: E2+PHTPP.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsacacetin or E2 group

Fig 9 Effects of acacetin, E2, ERα inhibitor and ERβ inhibitor on cell cycle of T47D cells

A:Cell cycle distribution; B: ERα inhibitor(MPP);C:ERβ inhibitor(PHTPP).*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsacacetin or E2 group.

Fig 10 Effects of acacetin, E2, ERα inhibitor and ERβ inhibitor on Ki67 mRNA expression in T47D cells

A:ERα inhibitor(MPP);B:ERβ inhibitor(PHTPP).*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsacacetin or E2 group.

研究表明，雌激素通過ERs的基因組途徑或非基因組途徑，調(diào)控某些分子的表達(dá)來影響細(xì)胞的分化、增殖、凋亡逃避和侵襲轉(zhuǎn)移等。Han等[14]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，E2可以通過ERα途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)LRP16基因表達(dá)增加，調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)一步影響乳腺癌的侵襲能力。Stettner等[15]發(fā)現(xiàn)，E2可以通過對(duì)ERK1/2的快速磷酸化，調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的增殖，而這種作用與ERα表達(dá)呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，刺槐素及E2可上調(diào)雌激素受體的表達(dá)，與單用刺槐素組相比，刺槐素聯(lián)合MPP組中ERα的mRNA和蛋白表達(dá)有明顯降低，與MPP組相比，刺槐素聯(lián)合MPP組中ERα的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，而刺槐素聯(lián)合PHTPP處理可明顯降低ERβ的mRNA和蛋白表達(dá)。這說明刺槐素的雌激素樣作用可能通過上調(diào)ERα蛋白表達(dá)，影響ER受體通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

目前的大量研究報(bào)道表明，在一定濃度范圍內(nèi)，黃酮類化合物會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。已有研究表明，雌激素、大豆異黃酮類化合物在一定濃度范圍內(nèi)均具有促癌細(xì)胞增殖作用，即雌激素樣活性。據(jù)報(bào)道，刺槐素、染料木素和其他植物雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，具有雌激素樣活性，其中刺槐素用于乳腺癌的治療已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注。因此，本課題通過研究低劑量的刺槐素對(duì)雌激素依賴性腫瘤細(xì)胞T47D增殖的影響，揭示刺槐素發(fā)揮雌激素樣作用的機(jī)制，為植物雌激素產(chǎn)品的開發(fā)和臨床婦科用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of acacetin on T47D cell proliferation

SI Ling-ling1, MA Jun2, REN Huan-huan1, REN Bo-xue1,LI De-fang2,ZHENG Qiu-sheng1,2

(1.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China;2.BinzhouMedicalUniversity,YantaiShandong264005,China)

Aim To investigate the effect of acacetin on cell proliferation and the influence of acacetin on estrogen receptor expressioninvitro.Methods The proliferation rates and the cell cycle changes of acacetin-treated T47D cells were measured by sulforhodamine B(SRB) assay and flow cytometry, respectively. Moreover, the mRNA expressions of estrogen receptor-alpha(ERα), estrogen receptor-beta(ERβ) and proliferating antigen(Ki67) were determined by quantitative real time PCR(qPCR). Western blot was employed to detect the ERα and ERβ protein expression.Results Acacetin significantly promoted the proliferation and increased the amount of cells arrested in S and G2/M phase under the concentration of 0.001～10 μmol·L-1. Ki67 mRNA level and the ERα protein level in T47D cells were remarkably upregulated after acacetin treatment. To clarify which estrogen receptors played a role in acacetin induced the proliferation of T47D cells, the combination treatment of acacetin and ERα inhibitor(MPP)/ERβ inhibitor(PHTPP) was employed. We found that MPP could reverse the cell proliferation, the cell arrested in S and G2/M phase and the increased Ki67 mRNA level induced by acacetin. PHTPP also alleviated the T47D cell proliferation induced by acacetin, whereas no significant changes were found in cell cycle and Ki67 mRNA level.Conclusion Acacetin stimulates the cell proliferation of T47D cells in the concentration from 0.001 μmol·L-1to 10 μmol·L-1, which is mainly mediated by ERα.

acacetin; estrogen; T47D cell; estrogen receptor alpha; estrogen receptor beta; estrogenic effects; cell proliferation

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.044.html

2016-10-31，

2016-11-28

濱州醫(yī)學(xué)院科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(No BY2014KYQD01)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31471338)；山東省高等學(xué)校優(yōu)勢(shì)學(xué)科人才團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃

司玲玲(1990-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail:1481570144@qq.com; 鄭秋生(1968-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: zqsyt@ sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.022

A

1001-1978(2017)02-0260-08

R284.1；R329.24；R392.11；R737.9；R977.12