高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定

王曉婧，曹夢錦，張雪松，王國棟，王 竹

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所/國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定

王曉婧，曹夢錦，張雪松，王國棟，王 竹

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所/國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

建立高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定數(shù)學(xué)模型，計(jì)算β-胡蘿卜素測量結(jié)果的不確定度。胡蘿卜和菠菜中β-胡蘿卜素的擴(kuò)展不確定分別為0.684和0.444 mg/100g(k=2、P=95%)。影響β-胡蘿卜素HPLC法測定的不確定度來源主要是樣品均勻性、前處理過程及HPLC儀器定量重復(fù)性，不確定度評定有利于完善測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

不確定度；β-胡蘿卜素；蔬菜；高效液相色譜法

β-胡蘿卜素由于其如顯著的維生素A原活性、抗氧化、防癌、利于心血管健康等而備受關(guān)注[1-3]。天然攝入的β-胡蘿卜素主要來源于植物性食物，其含量測定方法中高效液相色譜法(HPLC)因其準(zhǔn)確度高、操作相對簡便，可將胡蘿卜素各單體物質(zhì)分離并分別予以定性和定量的優(yōu)點(diǎn)而成為β-胡蘿卜素分析的主流方法[4-7]。本研究組在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中β-胡蘿卜素的測定》的標(biāo)準(zhǔn)整合過程中，為提高提取效率、改善色譜分離效果及增進(jìn)β-胡蘿卜素結(jié)果的科學(xué)表達(dá)，提出了以下幾點(diǎn)改進(jìn)之處：一是前處理過程中增加了低溫醇提步驟，有效提高胡蘿卜素的提取效率；二是在HPLC測定中采用C30Carotenoid色譜柱，將α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素及其順反異構(gòu)體進(jìn)行分離，從而實(shí)現(xiàn)分別計(jì)量；三是按照AOAC方法將β-胡蘿卜素的各順反式異構(gòu)體分別定性定量并綜合評定β-胡蘿卜素的含量[9]，以避免造成結(jié)果的低估或偏估。本試驗(yàn)根據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[10]，對蔬菜中β-胡蘿卜素含量測定的不確定度進(jìn)行了測量和評定，以期為評定測量結(jié)果提供參考。

1 材料與方法

1.1 測量所需材料與步驟

1.1.1 儀器與試劑 儀器與耗材：高效液相色譜儀(Waters 2 695，美國Waters公司)；紫外檢測器(Waters 2 487，美國Waters公司)；YMC Carotenoid C30色譜柱(3μm，4.6×150 mm)；紫外分光光度計(jì)(722G型，上海精科)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2010型，鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司)；恒溫振蕩水浴鍋(SHZ-88，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；分析天平(Mettler MS204S，瑞士梅特勒托利多公司)；所有玻璃器皿均為A級。

標(biāo)準(zhǔn)品與試劑：β-胡蘿卜素(CAS號：7235-40-7，純度>95%)，購于Sigma公司；甲醇為色譜級 (Fisher Scientific公司，批號152469)；乙腈為色譜級(Fisher Scientific公司，批號150942)；甲基叔丁基醚為色譜純(Fisher Scientific公司，批號147314)；二氯甲烷為色譜純(Fisher Scientific公司，批號148424)；正己烷為色譜純(Fisher Scientific公司，批號152474)；試驗(yàn)用水為超純水(電阻率≥18.2MΩ·cm)。無水乙醇為優(yōu)級純(北京化工廠，批號20150618)；石油醚(沸程30～60℃，北京化工廠，批號20151012)；氫氧化鉀(西隴化工股份有限公司，批號120716)；無水硫酸鈉(西隴化工股份有限公司，批號140913)；均為分析純。

1.1.2 測量步驟 (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定：將β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用二氯甲烷溶解，配制成濃度約500 μg/mL儲備液，分裝保存在-20℃冰箱內(nèi)；試驗(yàn)當(dāng)日，取β-胡蘿卜素儲備液100 mL，加正己烷稀釋并定容至10 mL。以正己烷為空白，入射光波長為450 nm測定其吸光度值，平行測定3次，取均值，按式(1)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

(1)

式(1)中：CR為β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的標(biāo)定濃度；A為β-胡蘿卜素的吸光度值；E為以正己烷為溶劑時β-胡蘿卜素的比吸光系數(shù)(0.262 0)；V2為定容體積(mL)；V1為移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液的體積(mL)。

(2)全反式β-胡蘿卜素響應(yīng)因子(RF)的測定：將β-胡蘿卜素儲備液稀釋為濃度約3 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，注入HPLC儀中，根據(jù)保留時間測定-胡蘿卜素各異構(gòu)體峰面積，平行測定6次。全反式β-胡蘿卜素的色譜純度(CP)和響應(yīng)因子(RF)分別按式(2)和式(3)計(jì)算：

(2)

(3)

式(2)和(3)中：CP為全反式β-胡蘿卜素的色譜純度；Rsum為標(biāo)準(zhǔn)使用液中β-胡蘿卜素各異構(gòu)體(包括全反式β-胡蘿卜素、9-順式β-胡蘿卜素、13-順式β-胡蘿卜素、15-順式β-胡蘿卜素及其他順式結(jié)構(gòu))的峰面積總和；Rall-E為標(biāo)準(zhǔn)使用液中全反式β-胡蘿卜素的峰面積；R9Z為標(biāo)準(zhǔn)使用液中9-順式β-胡蘿卜素的峰面積；R13Z為標(biāo)準(zhǔn)使用液中13-順式β-胡蘿卜素的峰面積；R15Z為標(biāo)準(zhǔn)使用液中15-順式β-胡蘿卜素的峰面積；RxZ為標(biāo)準(zhǔn)使用液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積；Cr為β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度。

(3)樣品前處理：取勻質(zhì)化的蔬菜樣品0.5～1 g(精確至0.001g)于100mL錐形瓶中，加入0.5 g抗壞血酸，30 mL無水乙醇，于60 ℃水浴振蕩30 min，后加入10 mL飽和氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至53℃恒溫振蕩水浴箱中，皂化30 min。取出，靜置，冷卻到室溫。將皂化液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，室溫下振蕩10 min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中按上述方法進(jìn)行第二次提取。合并有機(jī)相，用水洗至近中性。棄水相，有機(jī)相通過無水硫酸鈉過濾脫水。濾液收入250 mL蒸發(fā)瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃減壓濃縮，近干。用氮?dú)獯蹈?，用移液管?zhǔn)確加入5.0 mL二氯甲烷，蓋上瓶塞，充分溶解提取物。經(jīng)0.45 μm膜過濾后供液相色譜分析用。

(4)色譜條件：YMC Carotenoid C30色譜柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長450 nm；流動相為A(甲醇∶乙腈∶水73.5∶24.5∶2)、B(甲基叔丁基醚)，洗脫程序：100%～59% A線性變換(0～15 min)，59%～20% A線性變換(15～19 min)，20%～0% A線性變換(19～20 min)。根據(jù)保留時間和相對位置定性，通過計(jì)算各異構(gòu)體的峰面積來定量。

1.2 測量數(shù)學(xué)模型的建立

本試驗(yàn)中β-胡蘿卜素的計(jì)算公式為式(4)：

(4)

式(4)中：X為待測樣品中β-胡蘿卜素的含量(μg/100g)；S為待測液中β-胡蘿卜素各異構(gòu)體經(jīng)校正后的色譜峰總面積；V為試樣液定容體積(mL)；RF為全反式β-胡蘿卜素響應(yīng)因子(計(jì)算方法見1.1.2)；m為試樣質(zhì)量(g)；其中：S=Sall-E+S9Z+S13Z×1.2+S15Z×1.4+SxZ，Sall-E為待測液中全反式β-胡蘿卜素峰面積、S9Z為待測液中9-順式-β-胡蘿卜素的峰面積、S13Z為待測液中13-順式-β-胡蘿卜素的峰面積、S15Z為待測液中15-順式-β-胡蘿卜素的峰面積，SxZ為待測液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積，1.2和1.4分別為13-順式-β-胡蘿卜素和15-順式-β-胡蘿卜素的相對校正因子。

測量結(jié)果的不確定性除受到公式中S、V、RF和m的影響外，樣品均勻性和前處理過程的一致性都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，考慮其影響量，公式中需加入校正因子frep，式(4)則轉(zhuǎn)化為式(5)：

(5)

(6)

1.3 不確定度來源分析

蔬菜中β-胡蘿卜素測量結(jié)果的不確定度來源主要包括：標(biāo)準(zhǔn)儲備液的標(biāo)定、標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液稀釋定容過程中的玻璃量器、樣品的天平稱量、HPLC定量、樣品均勻性和前處理引入的不確定度等方面。

1.4 不確定度分量的評定方法

1.4.1 A類評定 由觀測列統(tǒng)計(jì)分布所作的不確定度評定，即對被測量進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)觀測，A類評定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度以所得到的一系列測得值的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。此類評定包括了測量過程中的各種隨機(jī)效應(yīng)，包括樣品的均勻性和代表性、環(huán)境條件、儀器狀態(tài)、人員操作及前處理等導(dǎo)致的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素色譜峰總面積(S)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2 全反式β-胡蘿卜素響應(yīng)因子(RF)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本試驗(yàn)采用紫外-可見分光光度計(jì)(722G型)進(jìn)行標(biāo)定，其檢定證書顯示其相對擴(kuò)展不確定度為0.5%，k=2，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.005/2=0.002 5。

2.2.3 HPLC測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(LC) 計(jì)算方法見2.1。

2.3 樣品稱重(m)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品稱重引入的不確定度由天平的最大允許誤差構(gòu)成。稱重使用Mettler MS204S電子天平，其檢定證書給出稱量砝碼重量為10 mg時的擴(kuò)展不確定度為0.002 mg，k=2，由天平稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.002/2/10=0.000 1。

2.4 樣品定容體積(V)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5 樣品均勻性和樣品前處理過程中(frep)引入的不確定度

表1 測量重復(fù)性結(jié)果 單位：mg/100g

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)及前處理引入的不確定評定

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 urel(X)

將表3中各種相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照式(6)合成，可以得到兩種蔬菜中β-胡蘿卜素含量測量結(jié)果的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

表3 兩種蔬菜樣品中β-胡蘿卜素不確定度來源及合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.7 擴(kuò)展不確定度及測量結(jié)果

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[10]，對大多數(shù)測量不確定評估，取置信水平95%，k=2，則擴(kuò)展不確定度為 U(X)= 2×uc(X) 。測得胡蘿卜中β-胡蘿卜素的含量及不確定度為5.68 mg/100g (U =0.684 mg/100g，k=2)，菠菜中β-胡蘿卜素的含量及不確定度為3.00 mg/100g (U =0.444 mg/100g，k=2)。

3 討論

本試驗(yàn)以富含β-胡蘿卜素的胡蘿卜和菠菜為代表，評估了HPLC法測量β-胡蘿卜素含量的不確定度，得出影響測量結(jié)果的不確定度的主要來源為HPLC儀器測量重復(fù)性、樣品測量重復(fù)性及前處理過程。前者引入的不確定度由方法本身決定，主要體現(xiàn)在全反式β-胡蘿卜素的響應(yīng)因子RF的測定和樣品結(jié)果測量過程中均需要計(jì)入4種順反式異構(gòu)體的峰面積。因此今后在使用HPLC法測量β-胡蘿卜素含量時，根據(jù)不確定度分量加強(qiáng)準(zhǔn)確測量，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)減少前處理及其他隨機(jī)過程引入的系統(tǒng)誤差，注意取樣的均勻性、代表性，保證操作規(guī)范和一致，平行測量；(2)定期對儀器進(jìn)行期間核查和維護(hù)保養(yǎng)，以保證儀器的穩(wěn)定性；(3)將標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備得到標(biāo)準(zhǔn)使用液過程中，經(jīng)歷了兩次稀釋步驟，增加了不確定度來源，可考慮將制備得的標(biāo)準(zhǔn)使用液再次標(biāo)定，將標(biāo)定所得的標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度Cr代入計(jì)算，減少測定結(jié)果的不確定度。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來看，不確定度評價(jià)不僅可用于評估測量方法的可靠性和測量結(jié)果的可信程度，而且可以通過分析測量過程的主要誤差來源完善方法的準(zhǔn)確性。◇

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(責(zé)任編輯 劉宏)

Uncertainty Evaluation on Determination ofβ-carotene in Vegetables by HPLC

WANG Xiao-jing，CAO Meng-jin，ZHANG Xue-song，WANG Guo-dong，WANG Zhu

(National Institute for Nutrition and health，CDC/Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China，Beijing 100050，China)

A mathematical model was established for determiningβ-carotene in vegetables by HPLC and the measurement uncertainty was evaluated.The expand uncertainties ofβ-carotene were 0.684 mg/100g (k=2，P=95%，for carrot)and 0.444 mg/100g (k=2，P=95%，for spinach)，respectively.The uncertainty from sample uniformity，pretreatment and HPLC instrument were the main sources of uncertainty and uncertainty evaluation was helpful to promote the accuracy of measurement.

uncertainty；β-carotene；vegetable；high performance liquid chromatography (HPLC)

“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目“功能食品資源優(yōu)化和評價(jià)共性關(guān)鍵技術(shù)研究”(項(xiàng)目編號：2012BAD33B01)；衛(wèi)計(jì)委標(biāo)準(zhǔn)司“國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中β-胡蘿卜素的測定方法研究”。

王曉婧(1985— )，女，博士，助理研究員，研究方向：食物營養(yǎng)。

王竹(1970— )，女，博士，研究員，研究方向：食物營養(yǎng)。