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    高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定

    2017-02-22 08:54:58王曉婧曹夢錦張雪松王國棟
    中國食物與營養(yǎng) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:反式胡蘿卜素批號

    王曉婧,曹夢錦,張雪松,王國棟,王 竹

    (中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所/國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)

    高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定

    王曉婧,曹夢錦,張雪松,王國棟,王 竹

    (中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所/國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)

    建立高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定數(shù)學(xué)模型,計(jì)算β-胡蘿卜素測量結(jié)果的不確定度。胡蘿卜和菠菜中β-胡蘿卜素的擴(kuò)展不確定分別為0.684和0.444 mg/100g(k=2、P=95%)。影響β-胡蘿卜素HPLC法測定的不確定度來源主要是樣品均勻性、前處理過程及HPLC儀器定量重復(fù)性,不確定度評定有利于完善測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    不確定度;β-胡蘿卜素;蔬菜;高效液相色譜法

    β-胡蘿卜素由于其如顯著的維生素A原活性、抗氧化、防癌、利于心血管健康等而備受關(guān)注[1-3]。天然攝入的β-胡蘿卜素主要來源于植物性食物,其含量測定方法中高效液相色譜法(HPLC)因其準(zhǔn)確度高、操作相對簡便,可將胡蘿卜素各單體物質(zhì)分離并分別予以定性和定量的優(yōu)點(diǎn)而成為β-胡蘿卜素分析的主流方法[4-7]。本研究組在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中β-胡蘿卜素的測定》的標(biāo)準(zhǔn)整合過程中,為提高提取效率、改善色譜分離效果及增進(jìn)β-胡蘿卜素結(jié)果的科學(xué)表達(dá),提出了以下幾點(diǎn)改進(jìn)之處:一是前處理過程中增加了低溫醇提步驟,有效提高胡蘿卜素的提取效率;二是在HPLC測定中采用C30Carotenoid色譜柱,將α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素及其順反異構(gòu)體進(jìn)行分離,從而實(shí)現(xiàn)分別計(jì)量;三是按照AOAC方法將β-胡蘿卜素的各順反式異構(gòu)體分別定性定量并綜合評定β-胡蘿卜素的含量[9],以避免造成結(jié)果的低估或偏估。本試驗(yàn)根據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[10],對蔬菜中β-胡蘿卜素含量測定的不確定度進(jìn)行了測量和評定,以期為評定測量結(jié)果提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 測量所需材料與步驟

    1.1.1 儀器與試劑 儀器與耗材:高效液相色譜儀(Waters 2 695,美國Waters公司);紫外檢測器(Waters 2 487,美國Waters公司);YMC Carotenoid C30色譜柱(3μm,4.6×150 mm);紫外分光光度計(jì)(722G型,上海精科);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2010型,鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司);恒溫振蕩水浴鍋(SHZ-88,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);分析天平(Mettler MS204S,瑞士梅特勒托利多公司);所有玻璃器皿均為A級。

    標(biāo)準(zhǔn)品與試劑:β-胡蘿卜素(CAS號:7235-40-7,純度>95%),購于Sigma公司;甲醇為色譜級 (Fisher Scientific公司,批號152469);乙腈為色譜級(Fisher Scientific公司,批號150942);甲基叔丁基醚為色譜純(Fisher Scientific公司,批號147314);二氯甲烷為色譜純(Fisher Scientific公司,批號148424);正己烷為色譜純(Fisher Scientific公司,批號152474);試驗(yàn)用水為超純水(電阻率≥18.2MΩ·cm)。無水乙醇為優(yōu)級純(北京化工廠,批號20150618);石油醚(沸程30~60℃,北京化工廠,批號20151012);氫氧化鉀(西隴化工股份有限公司,批號120716);無水硫酸鈉(西隴化工股份有限公司,批號140913);均為分析純。

    1.1.2 測量步驟 (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定:將β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用二氯甲烷溶解,配制成濃度約500 μg/mL儲備液,分裝保存在-20℃冰箱內(nèi);試驗(yàn)當(dāng)日,取β-胡蘿卜素儲備液100 mL,加正己烷稀釋并定容至10 mL。以正己烷為空白,入射光波長為450 nm測定其吸光度值,平行測定3次,取均值,按式(1)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

    (1)

    式(1)中:CR為β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的標(biāo)定濃度;A為β-胡蘿卜素的吸光度值;E為以正己烷為溶劑時β-胡蘿卜素的比吸光系數(shù)(0.262 0);V2為定容體積(mL);V1為移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液的體積(mL)。

    (2)全反式β-胡蘿卜素響應(yīng)因子(RF)的測定:將β-胡蘿卜素儲備液稀釋為濃度約3 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液,注入HPLC儀中,根據(jù)保留時間測定-胡蘿卜素各異構(gòu)體峰面積,平行測定6次。全反式β-胡蘿卜素的色譜純度(CP)和響應(yīng)因子(RF)分別按式(2)和式(3)計(jì)算:

    (2)

    (3)

    式(2)和(3)中:CP為全反式β-胡蘿卜素的色譜純度;Rsum為標(biāo)準(zhǔn)使用液中β-胡蘿卜素各異構(gòu)體(包括全反式β-胡蘿卜素、9-順式β-胡蘿卜素、13-順式β-胡蘿卜素、15-順式β-胡蘿卜素及其他順式結(jié)構(gòu))的峰面積總和;Rall-E為標(biāo)準(zhǔn)使用液中全反式β-胡蘿卜素的峰面積;R9Z為標(biāo)準(zhǔn)使用液中9-順式β-胡蘿卜素的峰面積;R13Z為標(biāo)準(zhǔn)使用液中13-順式β-胡蘿卜素的峰面積;R15Z為標(biāo)準(zhǔn)使用液中15-順式β-胡蘿卜素的峰面積;RxZ為標(biāo)準(zhǔn)使用液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積;Cr為β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度。

    (3)樣品前處理:取勻質(zhì)化的蔬菜樣品0.5~1 g(精確至0.001g)于100mL錐形瓶中,加入0.5 g抗壞血酸,30 mL無水乙醇,于60 ℃水浴振蕩30 min,后加入10 mL飽和氫氧化鉀溶液,蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至53℃恒溫振蕩水浴箱中,皂化30 min。取出,靜置,冷卻到室溫。將皂化液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中,加入50 mL石油醚,輕輕搖動,排氣,蓋好瓶塞,室溫下振蕩10 min后靜置分層,將水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中按上述方法進(jìn)行第二次提取。合并有機(jī)相,用水洗至近中性。棄水相,有機(jī)相通過無水硫酸鈉過濾脫水。濾液收入250 mL蒸發(fā)瓶中,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃減壓濃縮,近干。用氮?dú)獯蹈?,用移液管?zhǔn)確加入5.0 mL二氯甲烷,蓋上瓶塞,充分溶解提取物。經(jīng)0.45 μm膜過濾后供液相色譜分析用。

    (4)色譜條件:YMC Carotenoid C30色譜柱(4.6 mm×150 mm,3 μm);流速1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長450 nm;流動相為A(甲醇∶乙腈∶水73.5∶24.5∶2)、B(甲基叔丁基醚),洗脫程序:100%~59% A線性變換(0~15 min),59%~20% A線性變換(15~19 min),20%~0% A線性變換(19~20 min)。根據(jù)保留時間和相對位置定性,通過計(jì)算各異構(gòu)體的峰面積來定量。

    1.2 測量數(shù)學(xué)模型的建立

    本試驗(yàn)中β-胡蘿卜素的計(jì)算公式為式(4):

    (4)

    式(4)中:X為待測樣品中β-胡蘿卜素的含量(μg/100g);S為待測液中β-胡蘿卜素各異構(gòu)體經(jīng)校正后的色譜峰總面積;V為試樣液定容體積(mL);RF為全反式β-胡蘿卜素響應(yīng)因子(計(jì)算方法見1.1.2);m為試樣質(zhì)量(g);其中:S=Sall-E+S9Z+S13Z×1.2+S15Z×1.4+SxZ,Sall-E為待測液中全反式β-胡蘿卜素峰面積、S9Z為待測液中9-順式-β-胡蘿卜素的峰面積、S13Z為待測液中13-順式-β-胡蘿卜素的峰面積、S15Z為待測液中15-順式-β-胡蘿卜素的峰面積,SxZ為待測液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積,1.2和1.4分別為13-順式-β-胡蘿卜素和15-順式-β-胡蘿卜素的相對校正因子。

    測量結(jié)果的不確定性除受到公式中S、V、RF和m的影響外,樣品均勻性和前處理過程的一致性都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,考慮其影響量,公式中需加入校正因子frep,式(4)則轉(zhuǎn)化為式(5):

    (5)

    (6)

    1.3 不確定度來源分析

    蔬菜中β-胡蘿卜素測量結(jié)果的不確定度來源主要包括:標(biāo)準(zhǔn)儲備液的標(biāo)定、標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液稀釋定容過程中的玻璃量器、樣品的天平稱量、HPLC定量、樣品均勻性和前處理引入的不確定度等方面。

    1.4 不確定度分量的評定方法

    1.4.1 A類評定 由觀測列統(tǒng)計(jì)分布所作的不確定度評定,即對被測量進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)觀測,A類評定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度以所得到的一系列測得值的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。此類評定包括了測量過程中的各種隨機(jī)效應(yīng),包括樣品的均勻性和代表性、環(huán)境條件、儀器狀態(tài)、人員操作及前處理等導(dǎo)致的不確定度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 β-胡蘿卜素色譜峰總面積(S)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    2.2 全反式β-胡蘿卜素響應(yīng)因子(RF)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    本試驗(yàn)采用紫外-可見分光光度計(jì)(722G型)進(jìn)行標(biāo)定,其檢定證書顯示其相對擴(kuò)展不確定度為0.5%,k=2,則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.005/2=0.002 5。

    2.2.3 HPLC測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(LC) 計(jì)算方法見2.1。

    2.3 樣品稱重(m)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    樣品稱重引入的不確定度由天平的最大允許誤差構(gòu)成。稱重使用Mettler MS204S電子天平,其檢定證書給出稱量砝碼重量為10 mg時的擴(kuò)展不確定度為0.002 mg,k=2,由天平稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.002/2/10=0.000 1。

    2.4 樣品定容體積(V)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    2.5 樣品均勻性和樣品前處理過程中(frep)引入的不確定度

    表1 測量重復(fù)性結(jié)果 單位:mg/100g

    表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)及前處理引入的不確定評定

    2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 urel(X)

    將表3中各種相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照式(6)合成,可以得到兩種蔬菜中β-胡蘿卜素含量測量結(jié)果的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

    表3 兩種蔬菜樣品中β-胡蘿卜素不確定度來源及合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    2.7 擴(kuò)展不確定度及測量結(jié)果

    依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[10],對大多數(shù)測量不確定評估,取置信水平95%,k=2,則擴(kuò)展不確定度為 U(X)= 2×uc(X) 。測得胡蘿卜中β-胡蘿卜素的含量及不確定度為5.68 mg/100g (U =0.684 mg/100g,k=2),菠菜中β-胡蘿卜素的含量及不確定度為3.00 mg/100g (U =0.444 mg/100g,k=2)。

    3 討論

    本試驗(yàn)以富含β-胡蘿卜素的胡蘿卜和菠菜為代表,評估了HPLC法測量β-胡蘿卜素含量的不確定度,得出影響測量結(jié)果的不確定度的主要來源為HPLC儀器測量重復(fù)性、樣品測量重復(fù)性及前處理過程。前者引入的不確定度由方法本身決定,主要體現(xiàn)在全反式β-胡蘿卜素的響應(yīng)因子RF的測定和樣品結(jié)果測量過程中均需要計(jì)入4種順反式異構(gòu)體的峰面積。因此今后在使用HPLC法測量β-胡蘿卜素含量時,根據(jù)不確定度分量加強(qiáng)準(zhǔn)確測量,應(yīng)注意以下幾點(diǎn):(1)減少前處理及其他隨機(jī)過程引入的系統(tǒng)誤差,注意取樣的均勻性、代表性,保證操作規(guī)范和一致,平行測量;(2)定期對儀器進(jìn)行期間核查和維護(hù)保養(yǎng),以保證儀器的穩(wěn)定性;(3)將標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備得到標(biāo)準(zhǔn)使用液過程中,經(jīng)歷了兩次稀釋步驟,增加了不確定度來源,可考慮將制備得的標(biāo)準(zhǔn)使用液再次標(biāo)定,將標(biāo)定所得的標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度Cr代入計(jì)算,減少測定結(jié)果的不確定度。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來看,不確定度評價(jià)不僅可用于評估測量方法的可靠性和測量結(jié)果的可信程度,而且可以通過分析測量過程的主要誤差來源完善方法的準(zhǔn)確性。◇

    [1]靳青,畢宇霖,劉曉牧,等.類胡蘿卜素代謝及功能研究進(jìn)展[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,26 (12):3561-3571.

    [2]孫玉敬,喬麗萍,鐘烈洲,等.類胡蘿卜素生物活性的研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報(bào),2012,12 (1):160-166.

    [3]翟艷麗,惠伯棣,蔡靳,等.類胡蘿卜素與癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的研究[J].食品科學(xué),2013,34 (13):307-313.

    [4]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T5009.83-2003 食品中胡蘿卜素的測定[S]. 北京:中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會,2003.

    [5]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) GB 5413.35-2010嬰幼兒食品和乳品中β-胡蘿卜素的測定[S]. 北京:中華人民共和國衛(wèi)生部,2010.

    [6]趙大球,薛銀芳,周春華.植物類胡蘿卜素分析方法研究進(jìn)展[J].北方園藝,2011(2):195-199.

    [7]惠伯棣,歐陽清波,曾悅.植物食品中類胡蘿卜素的高壓液相色譜檢測[J].中國食品添加劑,2002(5):72-82.

    [8]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) GB 5009.83-2016 食品中胡蘿卜素的測定[S]. 北京:中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會,2016.

    [9]Association of Official Agricultural Chemists.AOAC Official Method 2005.07.β-Carotene in supplements and raw materials reversed-phase high pressure liquid chromatographic method[S].USA.2005.

    [10]中華人民共和國國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范.JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S]. 北京:國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2012.

    [11]ELLISON S L R,WILLIAMS A.Quantifying uncertainty in analytical measurement[M]. 3rd ed.UK:EURACHEM /CITAC Guide CG4.2012.

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    [16]宋業(yè)萍,肖亮,宗萬里.氣相色譜法測定海帶中多氯聯(lián)苯含量的不確定度評定[J].衛(wèi)生研究,2015,44 (4):604-609.

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    (責(zé)任編輯 劉宏)

    Uncertainty Evaluation on Determination ofβ-carotene in Vegetables by HPLC

    WANG Xiao-jing,CAO Meng-jin,ZHANG Xue-song,WANG Guo-dong,WANG Zhu

    (National Institute for Nutrition and health,CDC/Key Laboratory of Trace Element Nutrition,National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China,Beijing 100050,China)

    A mathematical model was established for determiningβ-carotene in vegetables by HPLC and the measurement uncertainty was evaluated.The expand uncertainties ofβ-carotene were 0.684 mg/100g (k=2,P=95%,for carrot)and 0.444 mg/100g (k=2,P=95%,for spinach),respectively.The uncertainty from sample uniformity,pretreatment and HPLC instrument were the main sources of uncertainty and uncertainty evaluation was helpful to promote the accuracy of measurement.

    uncertainty;β-carotene;vegetable;high performance liquid chromatography (HPLC)

    “十二五”國家科技支撐項(xiàng)目“功能食品資源優(yōu)化和評價(jià)共性關(guān)鍵技術(shù)研究”(項(xiàng)目編號:2012BAD33B01);衛(wèi)計(jì)委標(biāo)準(zhǔn)司“國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中β-胡蘿卜素的測定方法研究”。

    王曉婧(1985— ),女,博士,助理研究員,研究方向:食物營養(yǎng)。

    王竹(1970— ),女,博士,研究員,研究方向:食物營養(yǎng)。

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