不同脂肪酸組成的油脂對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥的影響

趙 曉，張 永，張新勝，徐 慶，于曉明，李惠子，楊雪艷，劉英華*，薛長(zhǎng)勇*

(1解放軍總醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京 100853；2火箭軍總醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京 100853)

不同脂肪酸組成的油脂對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥的影響

趙 曉1，張 永1，張新勝1，徐 慶1，于曉明1，李惠子2，楊雪艷1，劉英華1*，薛長(zhǎng)勇1*

(1解放軍總醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京 100853；2火箭軍總醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京 100853)

目的：比較不同脂肪酸組成的油脂對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道急性炎癥的影響，為重癥腸道感染提供腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的數(shù)據(jù)參考。方法：取12w齡雄性C57BL/6J小鼠40只，腹腔注射LPS(3.5mg/kg)24h后，測(cè)量空腹體重，隨機(jī)分為5組：玉米油組(ω-6脂肪酸)、橄欖油組(ω-9脂肪酸)、紫蘇油組(ω-3脂肪酸)、中長(zhǎng)鏈油組(中鏈脂肪酸)、LPS損傷組(灌胃葡萄糖)。根據(jù)組別灌胃小鼠，7d后取小鼠腹主動(dòng)脈血及小腸組織，測(cè)定細(xì)胞因子水平和TLR4信號(hào)通路中相關(guān)分子的mRNA表達(dá)，并進(jìn)行小腸組織病理切片觀察。研究期間每日測(cè)量小鼠體重。結(jié)果：研究結(jié)束時(shí)，各組小鼠體重均升高，以橄欖油組和紫蘇油組最高，且與LPS損傷組和玉米油組比較均有顯著性差異(P<0.05)；血和小腸中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及小腸TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表達(dá)以中長(zhǎng)鏈油組最低，與LPS損傷組和玉米油組比較均有顯著性差異(P<0.05)，而與橄欖油組和紫蘇油組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。小腸組織病理切片結(jié)果顯示：各組小鼠小腸粘膜均有不同程度的損傷，以LPS損傷組損傷最明顯，玉米油組次之，橄欖油組處于中等水平，中長(zhǎng)鏈油組與紫蘇油組損傷較輕。結(jié)論：中鏈脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸來(lái)源的油脂對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸道炎癥的修復(fù)作用均優(yōu)于ω-6脂肪酸來(lái)源的油脂和葡萄糖，機(jī)制可能為抑制腸道TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)因子表達(dá)，減少促炎細(xì)胞因子釋放。

脂肪酸；LPS；腸粘膜損傷；炎癥反應(yīng)

重癥感染是全身性感染導(dǎo)致的以器官功能損害為特征的臨床綜合征[1]，其中，腸道炎癥是重癥感染的主要表現(xiàn)。當(dāng)機(jī)體遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、腸缺血以及嚴(yán)重感染等重癥應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，大量腸道細(xì)菌移位導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷，并激活一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生和釋放，引發(fā)腸道炎癥甚至全身炎癥反應(yīng)。適時(shí)和恰當(dāng)?shù)貞?yīng)用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不僅能有效改善患者的營(yíng)養(yǎng)狀況，還可以有效改善腸粘膜損傷[2-3]，其可能通過(guò)加速緩解腸道炎癥來(lái)實(shí)現(xiàn)。本課題組前期研究結(jié)果顯示中鏈脂肪酸和ω-3脂肪酸可以有效降低肥胖小鼠小腸組織炎癥因子水平及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)傳導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。但針對(duì)腸道感染狀態(tài)下不同脂肪酸來(lái)源的油脂是否可以通過(guò)TLR4傳導(dǎo)通路減輕腸道炎癥反應(yīng)并改善腸功能尚有待進(jìn)一步研究。此外，有關(guān)重癥研究多集中在腸外營(yíng)養(yǎng)。故本次研究擬通過(guò)觀察不同脂肪酸組成的油脂對(duì)腸道炎癥的影響，為重癥腸道感染患者實(shí)施腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)治療時(shí)選擇何種脂肪來(lái)源的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及分組

SPF級(jí)健康12w齡雄性C57BL/6J小鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2014-0004，使用許可證號(hào)為SYXK(軍)2012-0010。小鼠由普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，按5、4.5、4、3.5、3、2.5mg/kg的劑量腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)。每日測(cè)量體重，選擇第2d體重下降>5%且3d內(nèi)不死亡的最低劑量作為實(shí)驗(yàn)研究用劑量，為3.5mg/kg。另購(gòu)買40只12w齡雄性C57BL/6J小鼠，腹腔注射3.5mg/kg LPS 24h后，測(cè)量空腹體重，隨機(jī)分為5組，每組8只小鼠：玉米油組(ω-6脂肪酸)、橄欖油組(ω-9脂肪酸)、紫蘇油組(ω-3脂肪酸)、中長(zhǎng)鏈油組(中鏈脂肪酸)、LPS損傷組。5組小鼠分別灌胃玉米油(100μL/d)、橄欖油(100μL/d)、紫蘇油(100μL/d)、中長(zhǎng)鏈油(100μL/d)、葡萄糖(200μL/d、濃度為1g/mL)，連續(xù)灌胃7d，研究期間仍以普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及引物

紫蘇油，由上海益壽金生物制品有限公司提供；中長(zhǎng)鏈油，由日清奧利友(中國(guó))投資有限公司提供；玉米油、橄欖油，分別購(gòu)自中糧品牌和歐麗薇蘭品牌；LPS(Escherichia coli 026：B6)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(Cat.No.23225)，購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、ELISA試劑盒(Cat.No.MCYTOMAG-70K-PMX)，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；核糖核酸(RNA)提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；TLR4抗體(ab13556)、髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)抗體(ab2064)、TNF-α抗體(ab6671)，均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Trizol、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；其他試劑為進(jìn)口分析純?cè)噭Ｒ锖铣捎杀本W科鼎盛生物科技有限公司提供，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 動(dòng)物體重及血、小腸組織的處理 研究期間每日固定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量小鼠體質(zhì)量并記錄。各組灌胃7d后處死小鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血樣，3 000～4 000 r/min離心，取血清儲(chǔ)存于-80℃，待ELISA試劑盒檢測(cè)相關(guān)炎癥因子水平。分離出全部小腸組織，共分3部分：第一部分立即放于液氮中備檢mRNA；第二部分用0.9% 氯化鈉注射液按10% 濃度制成勻漿，700 r/min 離心15 min，取上清液，凍存于液氮中，待ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子水平；第三部分小腸組織用蒸餾水漂洗后，浸泡于多聚甲醛中進(jìn)行固定，待進(jìn)行病理切片觀察。

1.3.2 血和小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平測(cè)定 取凍存的血清和小腸組織上清液，運(yùn)用BCA法測(cè)定小腸組織蛋白濃度，再根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)血清和小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.3 小腸組織中TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表達(dá)測(cè)定 每個(gè)小腸組織樣本約100mg，首先按Trizol 試劑的操作說(shuō)明進(jìn)行RNA提取，以總RNA 3 μg為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板，采用隨機(jī)引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟說(shuō)明在普通PCR 儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，按照熒光實(shí)時(shí)定量PCR (real-time RT-PCR)試劑盒說(shuō)明書(shū)，冰上配置50 μL的PCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行小腸組織中mRNA表達(dá)測(cè)定。實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性120 s，95 ℃變性20 s，59 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)。目的基因表達(dá)采用Ct (threshold cycle，Ct)值法，以各樣本基因的Ct值與其相應(yīng)內(nèi)參照β-actin基因的Ct值之差(ΔCt)來(lái)表示，表示方法為2- ΔΔ Ct，即為2Δ Ct(actin)-Δ Ct(target gene)。

1.3.4 小腸組織病理標(biāo)本處理及染色 將固定的小腸組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為2 μm，行HE染色后于光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠模型建立、分組及體重變化情況

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)小鼠體重為28.44±1.01g，腹腔注射3.5mg/kg LPS 24h后體重為26.43±1.45g，體重下降百分比為7.1%，存活率100%。按空腹體重隨機(jī)分為5組，經(jīng)不同油脂灌胃干預(yù)1w后，各組小鼠體重均升高，橄欖油、紫蘇油組和中長(zhǎng)鏈油組體重增長(zhǎng)顯著高于LPS損傷組和玉米油組(P<0.05)，其中，紫蘇油組和橄欖油組體重增長(zhǎng)值較高，但與中長(zhǎng)鏈油組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

2.2 不同脂肪酸組成的油脂對(duì)小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

橄欖油組、紫蘇油組和中長(zhǎng)鏈油組小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著低于玉米油組、LPS損傷組(P<0.05)，其中，以中長(zhǎng)鏈油組因子水平最低(表2)。

表2 小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

2.3 不同脂肪酸組成的油脂對(duì)小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及TLR4、MyD88和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

橄欖油組、紫蘇油組和中長(zhǎng)鏈油組小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及TLR4、MyD88和TNF-αmRNA表達(dá)均顯著低于玉米油組、LPS損傷組(P<0.05)，其中，以中長(zhǎng)鏈油組因子水平最低(表3、圖2)。

表3 小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

圖2 小鼠小腸組織中TLR4、MyD88、TNF-α mRNA表達(dá)注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

2.4 不同脂肪酸來(lái)源油脂對(duì)小鼠小腸病理切片影響

各組小鼠小腸粘膜均有不同程度的損傷，以LPS損傷組損傷最明顯，玉米油組次之，橄欖油組小腸粘膜損傷處于中等水平，中長(zhǎng)鏈油組與紫蘇油組未見(jiàn)明顯異常(圖3)。

3 討論

腸道作為人體最大的消化器官和免疫器官，其正常粘膜屏障作用的維持有賴于腸粘膜連續(xù)性的完整和正常的腸粘膜支持系統(tǒng)，眾多應(yīng)激因素和感染的存在可能使兩者發(fā)生異常，從而導(dǎo)致腸粘膜屏障的損傷，促發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。因此，改善與維持腸粘膜屏障功能是多種疾病尤其是重癥感染治療中的重要保證。多項(xiàng)研究結(jié)果證明，腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可有效改善腸粘膜屏障功能，改善腸粘膜損傷[4]。腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不但能直接供給營(yíng)養(yǎng)，還具有較腸外營(yíng)養(yǎng)更優(yōu)越的地方，如促使腸蠕動(dòng)功能的恢復(fù)、加速門(mén)靜脈系統(tǒng)的血液循環(huán)、促進(jìn)胃腸道激素的分泌等。本次研究結(jié)果顯示，LPS損傷建立小鼠腸道感染模型后，無(wú)論是灌胃葡萄糖還是灌胃不同脂肪酸組成的油脂，小鼠體重都有不同程度的升高，說(shuō)明腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)重癥感染的恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。

機(jī)體在重癥應(yīng)激狀態(tài)下，會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥，進(jìn)一步加劇腸上皮細(xì)胞的損傷并刺激腸粘膜免疫細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)一系列的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生和釋放。TLR4在先天性免疫反應(yīng)的炎癥信號(hào)通路中具有重要作用，其通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式的特有抗原成分而進(jìn)行信號(hào)識(shí)別和傳導(dǎo)。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分脂多糖LPS是TLR4最重要的配體[5]，通過(guò)結(jié)合CD14、LBP、TLR4形成受體復(fù)合物，與MyD88結(jié)合觸發(fā)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活NF-κB，加劇促炎因子和COX2的釋放[6]。在這樣的背景下，本次研究旨在針對(duì)腸道感染狀態(tài)下，不同脂肪酸來(lái)源的油脂是否可以通過(guò)TLR4傳導(dǎo)通路減輕炎癥反應(yīng)以改善腸功能。研究結(jié)果顯示，中鏈脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸來(lái)源的油脂的干預(yù)可以在短期內(nèi)有效降低小腸炎癥水平，改善腸粘膜損傷，并抑制TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，說(shuō)明這3種油脂干預(yù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的體重減輕和炎癥反應(yīng)的有益作用要優(yōu)于葡萄糖和ω-6脂肪酸來(lái)源的油脂，機(jī)制可能與TLR4信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

圖3 不同脂肪酸來(lái)源的油脂組小腸病理切片(×100)

我們課題組前期進(jìn)行過(guò)ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)干預(yù)可以改善LPS誘導(dǎo)的小鼠體重降低的研究[7]；同時(shí)進(jìn)行過(guò)MCFA可以有效降低肥胖小鼠的小腸炎癥水平的實(shí)驗(yàn)。以往也有研究結(jié)果顯示，ω-9單不飽和脂肪酸可以有效減少機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)[8]。為此，本實(shí)驗(yàn)將三種脂肪酸來(lái)源的油脂與常用的ω-6脂肪酸來(lái)源的油脂及葡萄糖進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：中鏈脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸來(lái)源的油脂對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸道炎癥的修復(fù)作用較好，以MCFA效果最佳，提示其作為腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑的組成成分將有助于改善重癥腸道感染患者疾病狀況。但其以何種比例進(jìn)行腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可以達(dá)到更好的效果還有待進(jìn)一步研究?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effects of Oil Composed of Different Fatty Acids on Intestinal Inflammation Induced by LPS in C57BL/6J Mice

ZHAO Xiao1，ZHANG Yong1，ZHANG Xin-sheng1，XU Qing1，YU Xiao-ming1，LI Hui-zi2，YANG Xue-yan1，LIU Ying-hua1，XUE Chang-yong1

(1Department of Nutrition，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2Department of Nutrition，The Rockets Army General Hospital of PLA，Beijing 100853，China)

fatty acid；LPS；intestinal mucosal injury；inflammation

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81541067、81202203)；解放軍總醫(yī)院科技創(chuàng)新苗圃基金(項(xiàng)目編號(hào)：15KMM45)。

趙曉(1991— )，女，在讀碩士，研究方向：臨床營(yíng)養(yǎng)與脂代謝。

*共同通信作者：劉英華(1977— )，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：臨床營(yíng)養(yǎng)；薛長(zhǎng)勇(1962— )，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：臨床營(yíng)養(yǎng)與脂代謝。