一起不明原因群體性肺部感染的病原體分離及鑒定

石 一，張 義，張 錚，史 偉，馬國(guó)柱，劉長(zhǎng)宏，雷金娥，馬 琳，曹 磊，張志成，劉 峰，劉東立

一起不明原因群體性肺部感染的病原體分離及鑒定

石 一1，張 義1，張 錚1，史 偉1，馬國(guó)柱1，劉長(zhǎng)宏1，雷金娥2，馬 琳1，曹 磊1，張志成1，劉 峰1，劉東立1

目的 調(diào)查了解一起不明原因群體性肺部感染的病原菌。方法 通過流行病學(xué)分析，運(yùn)用熒光定量PCR、ELISA、膠體金、VITEK2生化鑒定以及MALDI-TOF-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)可疑菌進(jìn)行鑒定，并將分離到的可疑菌與病例血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)。結(jié)果 從環(huán)境標(biāo)本中分離到2株淺白隱球菌，并與病例血清發(fā)生特異性凝集。結(jié)論 此次肺部感染可能與淺白色隱球菌感染有關(guān)。

肺炎；淺白隱球菌；PCR；MALDI-TOF-MS；血清凝集

隱球菌是環(huán)境中常見的一種酵母樣真菌，引起人類感染的隱球菌多為新型隱球菌，屬條件致病菌，一般情況下不會(huì)引起發(fā)病。在免疫力低下的人群中，可引起肺部或腦部感染[1]，近年來由格特隱球菌引起的健康人群暴發(fā)也時(shí)有報(bào)道[2]。然而由淺白隱球菌引起的感染罕見。

2016年3月陜西省榆林市某醫(yī)院陸續(xù)出現(xiàn)以發(fā)熱、咳嗽為主要臨床表現(xiàn)的醫(yī)務(wù)人員，胸部CT顯示肺部存在不同程度的結(jié)節(jié)影，部分醫(yī)務(wù)人員無臨床表現(xiàn)亦發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)影，共14人。本文就此事件展開流行病學(xué)調(diào)查與病原學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 采集病例血清標(biāo)本12份，病例咽拭子標(biāo)本13份。采集CT室及MRI室空調(diào)濾網(wǎng)、排水管等處拭子標(biāo)本6份。

1.2 試劑 黑米瓊脂培養(yǎng)，參照文獻(xiàn)配制[3]；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，梅里埃公司生產(chǎn)；細(xì)菌性肺炎、病毒性肺炎多重PCR試劑盒，韓國(guó)Seeplex公司生產(chǎn)；新型隱球菌莢膜多糖抗原膠體金試劑盒，美國(guó)IMMY公司生產(chǎn)；新型隱球菌熒光定量PCR試劑盒，上海芝江公司生產(chǎn)；隱球菌ELISA試劑盒，天津丹娜公司生產(chǎn)；酵母菌核酸提取試劑盒，北京天根公司生產(chǎn)；VITEK YST鑒定卡，梅里埃公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 MALDI-TOP-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK-MS)，全自動(dòng)微生物生化分析鑒定系統(tǒng)(VITEK-2)，AB StepOnePlus熒光定量PCR儀。

1.4 方法

1.4.1 對(duì)病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌及病毒性肺炎多重凝膠PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書。

1.4.2 對(duì)病例血清進(jìn)行隱球菌莢膜多糖抗原膠體金、ELISA、熒光定量PCR檢測(cè)[4]，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書。

1.4.3 將咽拭子及環(huán)境拭子標(biāo)本涂布黑米瓊脂培養(yǎng)基，置28 ℃，培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

1.4.4 莢膜染色 取可疑菌落涂片，滴加印度墨汁，覆蓋玻片，置顯微鏡下觀察。

1.4.5 莢膜多糖抗原膠體金試驗(yàn) 挑取可疑菌落用新型隱球菌莢膜多糖抗原膠體金試劑盒內(nèi)提供的樣本稀釋液80 μL稀釋，再作倍比稀釋，分別放入膠體金檢測(cè)試劑條，10 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.4.6 熒光定量PCR 用酵母菌核酸提取試劑盒提取菌落核酸，用新型隱球菌熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為37 ℃，2 min；94 ℃，2 min。再按照93 ℃，15 s，60 ℃，60 s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60 ℃，反應(yīng)體系為40 μL，F(xiàn)AM通道Ct值≤38為陽性。

1.4.7 VITEK-2生化鑒定 利用VITEK YST鑒定卡對(duì)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。

1.4.8 VITEK-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜分析鑒定 取1 μL標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8739涂在靶板中心點(diǎn)位，再取1 μL待鑒定菌落，平行加樣2份至靶板，再加0.5 μL VITEK MS-FA試劑，待干燥后再加1 μL VITEK MS-CHCA基質(zhì)，自然干燥后上機(jī)分析。1.4.9 血清凝集實(shí)驗(yàn) 用分離到的可疑菌株與病例血清分別進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)做生理鹽水對(duì)照及同院內(nèi)非病例血清對(duì)照。出現(xiàn)塊狀、顆粒狀凝集現(xiàn)象為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查 通過病例定義共發(fā)現(xiàn)14例患者。首發(fā)病例李某，男，53歲，3月初出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱，持續(xù)20 d左右。其余有癥狀患者主要表現(xiàn)為乏力8例，發(fā)熱6例，咳嗽6例，納差5例，畏寒3例，胸痛、咳痰各2例。年齡最大53歲，最小22歲，以青壯年為主，男、女各7例。所有病例肺部CT檢查均發(fā)現(xiàn)有不同程度的結(jié)節(jié)狀陰影。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.2.1 咽拭子多重PCR檢測(cè) 13例病例咽拭子中有1例檢出冠狀病毒核酸陽性，有4例檢出肺炎鏈球菌核酸陽性；流感病毒檢測(cè)，結(jié)果均為陰性；呼吸道常見病原菌9項(xiàng)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。由于臨床癥狀及流行病學(xué)資料均不支持，故排除上述感染。

2.2.2 病例血清檢測(cè) 12例病人血清標(biāo)本隱球菌莢膜多糖抗原膠體金實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。隱球菌熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

2.2.3 分離培養(yǎng) 在19份病例咽拭子及環(huán)境標(biāo)本中， 14號(hào)標(biāo)本(CT閱片室空調(diào))培養(yǎng)皿上觀察到表面淡紅色的菌落，17號(hào)(CT室空調(diào)排水管的表面拭子)、18號(hào)(MRI室空調(diào)排水管的表面拭子)標(biāo)本培養(yǎng)皿上觀察到大小約2 mm，表面隆起，表面光滑，不規(guī)則狀白褐色菌落。

2.2.4 莢膜染色 在高倍鏡下觀察到可疑菌落呈橢圓形菌體形態(tài)，外周有一層莢膜未被著色，呈亮白顏色。見圖1。

圖1 隱球菌莢膜染色(10×100)Fig.1 Cryptococcal capsular staining(10×100)

2.2.5 莢膜多糖抗原膠體金試驗(yàn) 從17號(hào)培養(yǎng)皿上挑取可疑菌落檢測(cè)莢膜多糖，結(jié)果顯示新型隱球菌莢膜多糖膠體金檢測(cè)陽性，且有明顯的效價(jià)梯度。見圖2。 18號(hào)菌落也呈陽性結(jié)果，14號(hào)呈陰性結(jié)果。

圖2 17號(hào)菌懸液隱球菌莢膜多糖膠體金試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 No.17 bacterial suspension cryptococcal capsular polysaccharide colloid gold test results

2.2.6 新型隱球菌熒光定量PCR 17、18號(hào)可疑菌株FAM通道Ct值分別為33.08、31.09，陽性結(jié)果，但擴(kuò)增曲線不典型。14號(hào)為陰性。

2.2.7 VITEK2生化鑒定 17號(hào)可疑菌株鑒定結(jié)果為淺白隱球菌(Cryptococcusalbidus)，18號(hào)為清酒酵母(Candida Sake)，14號(hào)為粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)。

2.2.8 MALDI-TOF-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定結(jié)果 采用梅里埃VITEK-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定，與臨床數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果提示17、18號(hào)菌株均為淺白隱球菌，其置信度分別為99.2%、99.4%。見圖3A，3B。14號(hào)菌株為粘紅酵母。

圖3A 17號(hào)菌株飛行時(shí)間質(zhì)譜圖譜(VITEK MS)Fig.3A Strain No. 17 flight time mass spectrum(VITEK MS)

圖3B 18號(hào)菌株飛行時(shí)間質(zhì)譜圖譜(VITEK MS)Fig.3B Strain No. 18 flight time mass spectrum(VITEK MS)

2.2.9 血清凝集試驗(yàn) 取12例病例血清與分離得到的17、18號(hào)淺白隱球菌菌株進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，12例病例血清與二者均發(fā)生凝集反應(yīng)。作為對(duì)照，用院內(nèi)12例非病例血清及鹽水分別與17、18號(hào)淺白隱球菌菌株進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，均未發(fā)生凝集，14號(hào)菌株也無凝集現(xiàn)象發(fā)生。間接證實(shí)病例血清中含有隱球菌特異性抗體。

3 討 論

本案例感染病例臨床表現(xiàn)比較特殊，給病原學(xué)分離鑒定帶來一定困難。綜合分析病例的流行病學(xué)及臨床資料， 14例患者肺部影像學(xué)改變可能由感染因素引起，致病病原體致病力不強(qiáng)，無癥狀感染者接近半數(shù)；傳染力不強(qiáng)，患者親屬及密切接觸人群中無人發(fā)病，提示環(huán)境因素可能起一定致病作用。通過一般常見呼吸道病原體篩查，排除一般常見肺炎及非典型肺炎的診斷。

隱球菌是較常見的肺部真菌感染病原菌，有報(bào)道認(rèn)為隱球菌肺部感染呈現(xiàn)自限性傾向[5]，病例臨床表現(xiàn)多輕微，甚至無任何不適癥狀，多在查體做X線檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)肺部病變。通過文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)本案例病例臨床特征符合上述隱球菌感染特征，經(jīng)休息、抗感染等一般對(duì)癥處理后均康復(fù)。隱球菌在實(shí)驗(yàn)診斷上多依靠檢查深部病灶或外周血、腦脊液的隱球菌莢膜多糖抗原。但對(duì)于較輕的病例，病灶一般局限于肺組織深部，在外周血中很難檢測(cè)到抗原成份，本案例中所有病例外周血標(biāo)本均未獲得陽性結(jié)果。由于病例癥狀較輕，不配合采集肺泡深部病灶，無法獲得病灶標(biāo)本的陽性結(jié)果，給臨床診斷及病原追溯帶來一定困難。本案例從患者所處的外環(huán)境中分離到2株隱球菌，通過與病例血清發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，可做為隱球菌感染的間接證據(jù)。唐書謙等采用隱球菌抗血清凝集試驗(yàn)的方法，在鑒定隱球菌感染上取得較好的效果[6]，進(jìn)一步證實(shí)本案例的血清凝集方法，是一種可以借鑒的診斷手段。隱球菌屬中有致病性的多為新型隱球菌和格特隱球菌，關(guān)于淺白隱球菌的感染報(bào)道并不多見，但仍有淺白隱球菌感染人或動(dòng)物的文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]。本案例中感染者多為放射科醫(yī)生，不排除受射線影響引起機(jī)體免疫力降低，進(jìn)而導(dǎo)致淺白隱球菌感染。但由于缺乏病例標(biāo)本的直接證據(jù)，故實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果僅供參考診斷。

在對(duì)隱球菌的鑒定中，傳統(tǒng)的表型及生化鑒定方法耗時(shí)較長(zhǎng)，結(jié)果也具有不確定性。本實(shí)驗(yàn)室采取利用新型隱球菌膠體金試劑條檢測(cè)可疑菌落莢膜多糖抗原，同時(shí)采用商品化的熒光定量試劑盒，均出現(xiàn)陽性結(jié)果，似乎支持新型隱球菌的鑒定結(jié)論。而利用VITEK-2酵母菌鑒定卡結(jié)果有一株顯示為淺白隱球菌，另一株則鑒定為清酒酵母。VITEK-2利用生化反應(yīng)來進(jìn)行細(xì)菌的鑒定，對(duì)一般常見菌準(zhǔn)確度較高，較少見的真菌鑒定存在一定的差異。MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，應(yīng)用于細(xì)菌鑒定及蛋白分析，不同的病原菌經(jīng)TOF激光電離，形成特異性的圖譜，與已有的質(zhì)譜圖庫比較，即可確定病原菌種屬，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，在鑒定酵母樣真菌上具有較高的準(zhǔn)確率[10]。我們利用MALDI-TOF-MS 儀器VITEK MS的臨床菌株數(shù)據(jù)庫，對(duì)3株菌按照真菌的鑒定程序進(jìn)行了鑒定，確定2株菌為淺白隱球菌，1株為粘紅酵母。此前采用新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)試劑鑒定也出現(xiàn)陽性結(jié)果，可見隱球菌屬有共同的抗原成份，而商品化的熒光定量PCR的試劑盒僅有一對(duì)引物，難以將淺白隱球菌與新型隱球菌分辨出來。提示我們?cè)诓≡b定實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)采用更多先進(jìn)的鑒定方法結(jié)合判定，甚至可采取基因測(cè)序技術(shù)做精確的鑒定。

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Pathogen isolation and identification of an outbreak of infection in lung with unknown causes

SHI Yi1，ZHANG Yi1，ZHANG Zheng1，SHI Wei1，MA Guo-zhu1，LIU Chang-hong1，LEI Jin-e2，MA Lin1，CAO Lei1，ZHANG Zhi-cheng1，LIU Feng1，LIU Dong-li1

(1.ShaanxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention，Xi'an710054，China； 2.TheFirstAffiliatedHospitalofXi'anJiaoTongUniversity，Xi'an710061，China)

We investigated the pathogen of an outbreak of lung infection with unknown causes. By epidemiological analysis, we used real-time PCR, ELISA, gold dipstick, VITEK2 and MALDI-TOF-MS to identify suspicious bacteria. We made use of serum plate agglutination test to confirm the suspicious bacteria and the patient serum. We isolated 2 strains ofCryptococcusalbidusfrom environmental samples. There has been specific agglutination between suspicious bacteria and patient serum. This pneumonia may be related to the infection ofCcryptococcusalbidus.

pneumonia;Ccryptococcusalbidus; PCR; MALDI-TOF-MS; serological test

Liu Dong-li, Email：ldl029@foxmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.011

劉東立，Email：ldl029@foxmail.com

1. 陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安 710054; 2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061

R379.5

A

1002-2694(2017)01-0057-04

2016-07-12 編輯：王曉歡

陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(D11)資助

Supported by the Scientific Research Project of Shaanxi Health and Family Planning Commission(No.D11)