2014年長沙市活禽市場污水中H5N1亞型禽流感病毒HA、NA及NS基因進化分析

張如勝，孫邊成，姚 棟，葉 文，陳靜芳，黃 政，劉曉蕾，歐新華，陳發(fā)明

2014年長沙市活禽市場污水中H5N1亞型禽流感病毒HA、NA及NS基因進化分析

張如勝，孫邊成，姚 棟，葉 文，陳靜芳，黃 政，劉曉蕾，歐新華，陳發(fā)明

目的 分析2014年長沙市活禽市場污水中H5N1亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)血凝素(Hemagglutinin, HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)及非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural,NS)基因進化特征。方法 從2014年長沙市活禽市場采集501份環(huán)境標本，利用Real-time PCR方法進行A型、H5、H7和H9亞型流感病毒核酸檢測，并對單一H5陽性標本進行核苷酸測序，病毒HA、NA和NS基因測序結(jié)果進行在線BLAST分析，利用Mega5和Bioedit軟件構(gòu)建核苷酸進化樹和氨基酸(Amino acids，aa)比對。結(jié)果 從501份環(huán)境標本中檢出A型H5亞型病毒陽性標本177份(檢出率35.33%)，其中8份標本經(jīng)核苷酸測序鑒定為H5N1亞型病毒，進化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支內(nèi)，聚集形成一個新亞分支，NA及NS基因位于2.3.2.1b亞分支。HA蛋白受體結(jié)合位點aa為QSG, 表現(xiàn)為禽流感病毒受體特征；NA蛋白未出現(xiàn)H275Y及N295S aa替換，對神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感；HA、NA及NS蛋白關(guān)鍵分子位點表現(xiàn)為高致病性的分子特征。結(jié)論 2014年長沙市活禽市場污水中H5N1亞型禽流感病毒 HA、NA和NS基因表現(xiàn)為高致病性的分子特征，但不具有對人易感的受體特征，需要進一步監(jiān)測。

活禽市場；環(huán)境；禽流感病毒；H5N1亞型；基因；進化

根據(jù)流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分為18個HA亞型(H1-H18)和11個NA亞型(N1-N11)[1]。根據(jù)禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)對禽致病性的不同，可以分為低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)和高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)病毒[2]。在這些亞型中，僅僅只有引起禽類高死亡率的H5和H7亞型被認為是HPAI病毒[2]。

研究[3]顯示長沙市活禽市場環(huán)境中H5N1病毒核酸陽性率較高，存在傳播AIV的風險。為此，本研究對2014年長沙市活禽市場環(huán)境中的H5N1病毒 HA、NA及NS基因進行測序，分析其致病性、受體及耐藥等分子特征。

1 材料與方法

1.1 活禽市場環(huán)境標本H5亞型AIV核酸檢測 按照《職業(yè)暴露人群血清學和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案(2011年版)》，采集2014年長沙市轄區(qū)活禽市場環(huán)境標本501份(禽類污水221份、禽類飲水263份、其他標本17份)，利用Real-time RT-PCR方法進行A型及H5、H7、H9亞型流感病毒核酸檢測，檢測用Real-time RT-PCR引物和探針序列來源于中國國家流感中心，引物及探針由上海invitrogen公司合成。

1.2 HPAI H5N1病毒HA、NA及NS基因擴增及核苷酸序列測定 將在2014年長沙市活禽市場環(huán)境中監(jiān)測到的50份H5亞型AIV陽性污水標本(排除H7和H9亞型AIV核酸陽性)利用Rneasy○RMini Kit (德國QIAGEN 公司)進行RNA核酸提取，然后利用SuperScript○RIII One-Step RT-PCR System with Platinum○RTaq RT-PCR(Life Technologies 公司)、HA和NA基因通用擴增引物[4]對HA和NA基因片段分別進行RT-PCR擴增，擴增反應(yīng)條件參考文獻[5]。RT-PCR擴增后的預期目的片段TA克隆測序由上海Life Technologies 公司完成。

1.3 污水中HPAI H5N1病毒 HA、NA及NS基因進化分析 長沙市活禽市場污水中HPAI H5N1病毒HA、NA及NS基因測序結(jié)果利用BioEdit軟件拼接后提交至Genbank，利用在線基本局部相似性搜索工具(Basic local alignment search tool, BLAST)進行相似性分析(http：//BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi)。從流感病毒資源庫(Influenza Virus Resource，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi)下載長沙市活禽市場污水中HPAI H5N1病毒、國內(nèi)部分HPAI H5N1病毒及A/barn swallow/Hong Kong/1161/2010(HK/1161-like)、A/Hubei/1/2010(Hubei/1-like)、A/Hong Kong/6841/2010(HK/6841-like)和A/chicken/Cambodia/TLC1/2009(TLC1/2009-like)等譜系代表株HA、NA及NS基因片段核苷酸序列，利用BioEdit、MEGA 5軟件的Neighbor-joining方法和Tamura-Nei 模式構(gòu)建進化樹。

1.4 污水中HPAI H5N1病毒 HA、NA及NS基因關(guān)鍵位點分析 選擇并從流感病毒資源庫中下載人感染HPAI H5N1病毒參考株A/Hunan/1/2009、A/Hubei/1/2010、HK/1161-like、A/duck/Hunan/S4150/2011和A/Goose/Guangdong/1/96病毒HA、NA及NS基因片段編碼aa序列，利用BioEdit軟件將上述病毒和本研究中的污水HPAI H5N1病毒aa序列進行多重比對、分析各基因關(guān)鍵位點分子特征。

2 結(jié) 果

2.1 活禽市場污水標本AIV核酸監(jiān)測結(jié)果 對2014年長沙市活禽市場污水中采集到的501份標本進行AIV核酸檢測，共檢出A型AIV核酸陽性標本350份，其中H5亞型核酸陽性標本177份，占35.33%，H9亞型核酸陽性標本191份，H7亞型核酸陽性標本11份，H5和H9混合陽性標本68份，H5和H7混合陽性標本6份，H7和H9混合陽性標本3份，H5、H7和H9混合陽性標本1份，未分亞型陽性標本28份。

2.2 活禽市場污水標本HPAI H5N1病毒核苷酸序列測定結(jié)果 50份H5亞型核酸陽性標本經(jīng)TA克隆核苷酸序列測定，成功獲得23條基因序列，其中HA和NA基因序列均為8條,NS序列為7條，各基因序列已上傳至GenBank(登錄號為：KX247915-KX247937)。BLAST比對分析表明：8條HA基因序列分別與來源于越南和中國云南的禽HPAI H5N1病毒分離株HA基因高度相似(97.05%～99.36%)；8條NA基因序列分別與來源于中國山東、甘肅和越南禽HPAI H5N1病毒分離株NA基因高度相似(95.36%～99.78%)；7條NS 基因序列分別與中國江西和越南禽來源HPAI H5N1病毒分離株NS基因高度相似(99.07%～99.77%)；HA和NA基因BLAST結(jié)果表明上述8份污水標本中存在的病毒為HPAI H5N1病毒。

2.3 HPAI H5N1病毒進化樹構(gòu)建 將本研究中的8株HPAI H5N1病毒和近年來分離自中國及越南的部分HPAI H5N1病毒分離株 HA、NA和NS基因構(gòu)建進化樹，HA基因進化樹形成2.3.2及2.3.4兩個進化分支，其中2.3.2又進化形成2.3.2.1a、2.3.2.1b和2.3.2.1c亞分支，2.3.4又形成2.3.4.1、2.3.4.2和2.3.4.4亞分支，本研究中的CS/156病毒屬于2.3.4.4亞分支，而本研究中的另外7株HPAI H5N1病毒(CS/14, CS/15, CS/42, CS/115, CS/116, CS/155, CS/213)位于2.3.2分支內(nèi)，但不屬于2.3.2.1a、2.3.2.1b和2.3.2.1c任何1個亞分支，和分離自越南和中國江蘇的禽源HPAI H5N1病毒親緣關(guān)系近，共同聚集形成一個亞分支。

NA基因進化樹形成HK/1161-like、Hubei/1-like、HK/6841-like和TLC1/2009-like譜系分支，其中本研究中的7株H5N1亞型病毒(CS/14, CS/15, CS/115, CS/116, CS/155, CS/156, CS/213)與分離自越南和中國內(nèi)地的禽源HPAI H5N1病毒分離株進化距離近，共同聚集一個分支，來源于HK/1161-like病毒(2.3.2.1b亞分支)，另外1株H5N1亞型病毒 (CS/42)單獨形成1個亞分支，與HK/6841-like病毒(2.3.2.1c亞分支)進化距離近。

NS基因進化樹與NA基因類似，同樣形成了HK/1161-like、Hubei/1-like、HK/6841-like和TLC1/2009-like譜系分支，本研究中的6株H5N1亞型AIV(CS/14, CS/15, CS/42, CS/116, CS/156, CS/213)與HK/1161-like病毒來源相似(2.3.2.1b分支)，另外1株H5N1亞型病毒 (CS/115) 與A/wild duck/Shandong/1/2011(H5N1)聚集形成1個亞分支，與TLC1/2009-like(1.1.1分支)進化距離近。

2.4 HPAI H5N1病毒HA、NA及NS基因關(guān)鍵位點分析 本研究中的8株H5N1亞型病毒 HA基因HA1和HA2 蛋白連接肽(323-331 位點)出現(xiàn)多個堿性aa(RERRR-KRG或RERRG-KRG，其中R，K為堿性aa)，與其他HPAI H5N1病毒參考株HA基因致病特征相似，對禽表現(xiàn)為高致病性特征，與LPAI H9N2 病毒具有1個堿性aa的低致病性分子特征不同，見表1。本研究中的8株H5N1亞型病毒HA 蛋白RBS第222～224 位(對應(yīng)H3 型流感病毒編碼aa第226-228位)aa為QSG或 QRG，表明其受體為禽源流感病毒特異性受體[6]，與人源或禽源HPAI H5N1病毒參考株 HA基因特征相似，具有不容易感染人的受體特征，見表1。

本研究中的8株HPAI H5N1病毒 NA蛋白均缺失20個aa，不同于HPAI H5N1病毒參考株A/Goose/Guangdong/1/96，但其第116、117、119、150、223、 247、275、295位編碼aa與A/Goose/Guangdong/1/96代表株相似，未發(fā)生H275Y及N295S aa替換，見表1。

相比HPAI H5N1病毒參考株A/Goose/Guangdong/1/96的第42、92和149位aa分別為A、D和A, 本研究中的7株HPAI H5N1病毒分別為 S、E和A，出現(xiàn)D92E aa突變位點，另外與A/Goose/Guangdong/1/96不同的是，7株HPAI H5N1病毒第80-84位aa均出現(xiàn)缺失，表1中包括本研究7株病毒在內(nèi)的全部HPAI H5N1病毒C-末端均為ESEV，見表1。

3 討 論

人感染H7N9、H10N8、H5N6、H5N1等[7-9]亞型AIV疫情流行病學調(diào)查已證實禽類場所為人感染AIV的重要來源。本研究顯示2014年長沙市活禽市場環(huán)境中H5亞型AIV核酸陽性率高達35.33%，與2009年長沙市活禽市場環(huán)境環(huán)境中H5亞型AIV核酸陽性率(31.30%)相似[3]，表明長沙市活禽市場環(huán)境中H5亞型AIV仍然廣泛存在。

HA進化分析顯示本研究中的 HPAI H5N1病毒與分離自越南和中國江蘇的禽源HPAI H5N1病毒共同聚集形成了一個新的亞分支；NA及NS進化分析顯示本研究中的HPAI H5N1病毒NA及NS分別來源于2.3.2.1b、2.3.2.1c和1.1.1分支；表明2014年長沙市活禽市場環(huán)境中HPAI H5N1病毒基因進化和來源的多樣性。

流感病毒致病性與HA蛋白連接肽位點堿性aa數(shù)目的多少密切相關(guān)[6]，本研究中的8株H5N1亞型病毒 HA 蛋白連接肽位點出現(xiàn)多個堿性aa，為HPAI 病毒，其中7株AIV NS1蛋白出現(xiàn)了D92E aa突變位點，具有增強AIV在宿主中的毒力作用[10-11]，且NS1蛋白C-末端為ESEV序列，進一

表1 長沙市HPAI H5N1病毒與參考株病毒HA、NA及NS1蛋白關(guān)鍵位點特征分析
Tab.1 Analysis of the important amino acids of the HA, NA and NS1 proteins of HPAI H5N1 strains from Changsha city with reference strains. Substitutions of particular concern are shown in bold.

VirusHANANS1Cleavagesite323-331RBS222-224Stalkregion1161171191502232472752954292150C-terminalCS/14RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/15RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/42RERRG-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/115RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/116RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/156RERRR-KRGQRG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/213RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/155RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHN無無無無Hunan/1RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVHubei/1RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVHK/1161IERRRRKRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVHunan/S4150RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVGD/1IERRRKKRGQSGNodeletionVIEKISHNADAESEV

* Hunan/1:A/Hunan/1/2009; Hubei/1:A/Hubei/1/2010; HK/1161:A/barn swallow/Hong Kong/1161/2010; Hunan/S4150:A/duck/Hunan/S4150/2011; GD/1:A/Goose/Guangdong/1/96.

步證實這些病毒具有高致病性的分子特征[11]。本研究中的8株HPAI H5N1病毒HA蛋白RBS區(qū)域基因特征表現(xiàn)為與禽細胞表面受體(SA-2,3-Gal)親和[12]，不容易感染人類，但是由于人感染HPAI H5N1 病毒病例大多數(shù)表現(xiàn)為重癥，死亡率高達53%[13]，因此需要進一步加強活禽市場環(huán)境中H5N1病毒監(jiān)測。本研究中的HPAI H5N1病毒NA基因特征顯示神經(jīng)氨酸酶抑制劑治療仍然有效[14-15]。

目前，國內(nèi)外不斷新增人感染HPAI H5N1 病毒病例報告，且在禽類市場活禽銷售模式未改變、活禽市場污水中H5N1亞型病毒污染狀況未減輕的情況下，需要密切監(jiān)測活禽市場環(huán)境中H5N1亞型病毒進化狀況，及時評估、預警HPAI H5N1 病毒的潛在傳播風險。

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Evolution of the HA，NA and NS genes of H5N1 avian influenza viruses from sewage in live bird markets in Changsha, 2014

ZHANG Ru-sheng, SUN Bian-cheng, YAO Dong, YE Wen, CHEN Jing-fang, HUNG Zheng, LIU Xiao-lei,OU Xin-hua, CHEN Fa-ming

(ChangshaCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410004,China)

The aim of this study is to analyze the evolutional and molecular characteristics of Hemagglutinin (HA), Neuraminidase(NA)and non-structural (NS) genes of H5N1 avian influenza virus (AIV) from sewage in live bird markets (LBMs) in Changsha, 2014. Five hundred and one specimens were collected from environment in LBMs in Changsha, 2014,and real-time RT-PCR was used for influenza A typing and subtyping (H5,H7 and H9) detection. Sequencing were used for the positive of single H5. The sequence homology of HA,NA and NS genes of the viruses were analyzed with the online Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). The phylogenetic trees for HA,NA and NS genes and the ClustalW Multiple alignments of amino acids were constructed using MEGA 5 and BioEdit software, respectively. Results showed that of 501 environmental samples, 177 (35.33%) samples were positive for influenza A viruses and H5 subtype. Eight H5N1 subtype AIV were confirmed by sequencing from the samples of the positive of single H5. Phylogenetic analysis indicated that most of HA genes of the H5N1 subtype AIV strains isolated in Changsha city were located in 2.3.2 and clustered into new subclade, and the most of NA and NS genes in this study were clustered into subclade 2.3.2.1b. QSG of the HA protein of the receptor binding site were found in these H5N1 viruses, and the characteristics was shown to be associated with increased affinity of HA to the glycan-receptors of AIV. In strains from this study, we did not found amino acid substitutions of the NA protein at H275Y and N295S, and sensitive to neuraminidases, and the high pathogenicity molecular characteristics of HA, NA and NS genes were showed in these viruses. In conclusion, molecular characteristics of the HA, NA and NS of these H5N1 subtype viruses in this study showed high pathogenicity, but that may not facilitate human infection. So, the prevalence and genetic evolution of this virus should be closely monitored.

live bird market; environment; avian influenza virus; H5N1 subtype; gene; evolution

Chen Fa-ming, Email: 351985738@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.016

陳發(fā)明，Email: 351985738@qq.com

長沙市疾病預防控制中心，長沙 410004

R373.1

B

1002-2694(2017)01-0085-04

2016-05-24 編輯：李友松

湖南省衛(wèi)生計生委2015年度科研計劃項目(B2015-153)