基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性臨床應(yīng)用評價

許榕青，李 丹，林銀霞，黃明翔，陳新朝

基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性臨床應(yīng)用評價

許榕青，李 丹，林銀霞，黃明翔，陳新朝

目的 評價基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性的臨床應(yīng)用效果。方法 利用基因芯片技術(shù)對涂陽肺結(jié)核患者的痰標本和臨床分離株進行利福平和異煙肼耐藥基因位點檢測，比較痰標本與菌株檢測結(jié)果的差異；并以BACTEC MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為對照評價基因芯片的檢測性能。另外，通過對999株鑒定為結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株進行rpoB、katG和inhA基因耐藥相關(guān)區(qū)域擴增產(chǎn)物測序，以驗證基因芯片對核酸序列檢測的準確性。結(jié)果 在涂陽的1 108例標本中有100例經(jīng)基因芯片菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌。其余的1 008例痰標本基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性的菌株基因芯片結(jié)果比較僅有9例結(jié)果不一致，符合率為99.1%。以BACTEC MGIT960培養(yǎng)法藥敏結(jié)果為對照，999株菌株基因芯片法檢測利福平耐藥性的符合率為98.1%，異煙肼的耐藥性的符合率為94.5%。與DNA測序法相比，基因芯片法檢測利福平和異煙肼耐藥性的準確率分別為99.6%和99.8%。結(jié)論 基因芯片技術(shù)能夠快速、準確地進行結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼的耐藥性檢測，并能直接用于痰標本檢測。

結(jié)核分枝桿菌；利福平；異煙肼；耐藥性；基因芯片

Supported by the Young Research Program of Department of Public Health of Fujian Province (No. 2013-2-77) Corresponding author: Huang Ming-xiang, Email: hmg119@163.com

結(jié)核病是全世界范圍內(nèi)嚴重威脅公共健康的傳染病。近年來，由于不規(guī)范治療導(dǎo)致的耐多藥結(jié)核病(至少對利福平和異煙肼同時耐藥)是結(jié)核病疫情上升的最主要原因之一，因此，結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的快速鑒定成為結(jié)核病防治的關(guān)鍵。目前，我國結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性試驗以改良L-J法和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法為主，但傳統(tǒng)的藥敏試驗方法費時、煩瑣，在得到分離株后3～4周后才能獲得結(jié)果[1]；即使應(yīng)用BACTEC MGIT 960液體快培法在培養(yǎng)陽性后得到藥敏結(jié)果也需要9～13 d[2]，不能滿足臨床快速診斷的需求。臨床亟需一種快速鑒定利福平和異煙肼耐藥的實驗室診斷方法，以利于耐多藥結(jié)核病 (multidrug resistant TB, MDR-TB) 的早期診斷和治療。

基因芯片技術(shù)具有高通量、高特異性的特點，可快速檢測標本中的分枝桿菌耐利福平基因rpoB，及耐異煙肼katG、inhA基因常見突變位點[3]。本研究擬通過臨床大樣本檢測以評估該技術(shù)直接應(yīng)用于痰標本檢測的效果。同時以BACTEC MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為對照評價基因芯片技術(shù)對于結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥檢測的敏感性、特異性、Kappa值及符合率，并探討該方法在臨床診斷耐多藥結(jié)核病中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2014年9月至2015年6月福州肺科醫(yī)院的涂陽肺結(jié)核患者的痰標本，最終納入的樣本為分枝桿菌培養(yǎng)陽性者。

1.2 主要儀器與試劑 晶芯○R Extractor TM 36核酸快速提取儀、BioMixer TM II芯片雜交儀、SlideWasher芯片洗干儀、LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，均購自博奧生物有限公司。BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)儀購自美國BD公司。

1.3 BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)、菌種鑒定和藥敏試驗 BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)試驗方法參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[4]。培養(yǎng)陽性菌株用對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行菌種鑒定，PNB培養(yǎng)基不生長鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。BACTEC MGIT960藥敏試驗具體操作按照BACTEC MGIT960儀器操作說明進行。

1.4 基因芯片檢測利福平和異煙肼耐藥基因位點

基因芯片技術(shù)檢測一線藥物利福平及異煙肼的3個耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動子的野生型及不同突變型[3]。

1.4.1 樣本制備及核酸提取 痰標本加入等量10%NaOH，液化15～20 min，12 000 r/min，離心后棄上清。再加入1 mL的生理鹽水，充分震蕩后12 000 r/min離心5 min，棄上清。向核酸提取管中加入80 μL核酸提取液，加入上述樣本后，使用Extractor36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃水浴5 min，10 000 r/min離心1 min。

1.4.2 PCR擴增 采用不對稱擴增法對相關(guān)基因位點進行擴增[5]。每個樣品進行3管 PCR擴增反應(yīng)，擴增的分別是PCR擴增試劑1、2、3。分別向3管中加入模板DNA 2 μL和18 μL PCR擴增試劑。每管PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，置于PCR擴增儀中進行擴增。PCR反應(yīng)條件為：37 ℃激活10 min；94 ℃變性600 s； 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環(huán)； 94 ℃30 s，72 ℃ 60 s，10個循環(huán)；72 ℃ 420 s。

1.4.3 芯片雜交與結(jié)果判讀 擴增反應(yīng)完成后，在利福平芯片雜交管加入3 μL擴增產(chǎn)物1、2和9 μL雜交緩沖液，在異煙肼芯片雜交管加入3 μL擴增產(chǎn)物1 μL、3 μL和9 μL雜交緩沖液。15 μL雜交反應(yīng)混合物95 ℃變性5 min，立即冰水浴3 min。吸出13.5 μL雜交反應(yīng)混合物加入芯片陣列，再放在50 ℃雜交儀中雜交120 min。雜交后經(jīng)洗滌甩干后使用LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯軟件進行信號的讀取及結(jié)果的判讀。

1.5 測序驗證 對999株經(jīng)BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)陽性的菌株rpoB、katG和inhA基因耐藥相關(guān)區(qū)域的擴增產(chǎn)物全部進行測序，由博奧生物有限公司完成。一代測序，Sanger終止法，儀器為ABI 3730XL。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 兩種方法檢測結(jié)果的一致性用Kappa檢驗判別。Kappa≥0.75，兩者一致性較好。采用PASW Statistics 18軟件統(tǒng)計Kappa值。用配對計數(shù)資料的χ2檢驗分析兩種檢測方法的檢測結(jié)果差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 在所有涂陽的1 108例標本中，有100例經(jīng)基因芯片初篩鑒定為分枝桿菌屬，再進一步進行基因芯片菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，與MGIT960培養(yǎng)的菌株鑒定結(jié)果一致。其余的1 008例痰標本基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)的菌株基因芯片結(jié)果比較僅有9例結(jié)果不一致，符合率達99.1%。這9例痰標本經(jīng)BACTEC MGIT960培養(yǎng)的菌株不納入最后結(jié)果分析。

2.2 基因芯片檢測相關(guān)突變位點的結(jié)果 基因芯片檢測999株BACTEC MGIT960培養(yǎng)陽性的菌株利福平和異煙肼耐藥相關(guān)突變位點?；蛐酒瑱z測107株rpoB突變型的菌株中，106株存在單一位點突變，1株存在雙位點突變。rpoB突變頻率最高的位點是531，突變頻率是56%,其次是526位點，突變頻率是22.4%?；蛐酒瑱z測出159株katG/inhA突變株，111株是katG315位點的單一突變，突變率是70.7%?；蛐酒瑱z出異煙肼katG位點缺失2株。katG的 315位點和inhA的啟動子區(qū)域存在雙突變的菌株有3株，占全部突變株的1.9%，見表1。

表1 基因芯片法檢測rpoB、katG和inhA耐藥相關(guān)突變位點的分布
Tab.1 Distribution of mutations loci in therpoB,katGandinhAgenes detected by gene chip

基因Genes突變位點Loci突變類型Specificmutation菌株數(shù)No.ofstrains突變率(%)MutationraterpoB511T→C87.5513A→C43.7516G→T或A→T或A→G76.5526C→T或C→G或A→T或A→G2422.4531C→T或C→G6056533T→C32.8511,516T511C,G516T或T511C,A516T或T511C,A516G10.9katG315G→A或G→C11170.7inhA-15C→T4327.3katG,inhA315,-15G315A,C(-15)T或G315C,C(-15)T31.9

注：數(shù)字為突變位點編號，數(shù)字前字母為野生型堿基，數(shù)字后字母為突變后堿基。

Note: the numbers indicate mutation loci, the letters before the numbers indicate wild-type bases and those after the numbers indicate mutation-type bases.

2.3 基因芯片技術(shù)與BACTEC MGIT960培養(yǎng)法檢測菌株利福平、異煙肼耐藥結(jié)果比較分析 利福平基因芯片與BATECT MGIT 960分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果符合率為98.1%，敏感度和特異度分別是94%和98.5%，χ2值為1.89，P>0.05，Kappa值為0.898，兩種方法一致性較好；異煙肼基因芯片與BACTEC MGIT 960分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果符合率為94.5%，敏感度和特異度分別是74.5%和99.9%，Kappa值為0.819?；蛐酒夹g(shù)與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法檢測菌株異煙肼耐藥結(jié)果的χ2值為51.07，P<0.05,提示兩種方法檢測異煙肼耐藥的結(jié)果存在差異，見表2、表3。

表2 基因芯片技術(shù)與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法檢測菌株利福平、異煙肼耐藥結(jié)果比較分析
Tab. 2 Results of gene chip and BACTEC MGIT 960 culture method for detection of drug resistance to rifampin and isoniazid in MTB isolates

基因芯片法GenechipmethodBACTECMGIT960培養(yǎng)法BACTECMGIT960culturemethod耐藥Resistance敏感Sensitivityχ2P利福平Rifampin突變型Mutationtype94131.89>0.05野生型Wildtype6886異煙肼Isoniazid突變型Mutationtype158151.07<0.05野生型Wildtype54786

表3 基因芯片技術(shù)檢測菌株利福平、異煙肼耐藥效果分析
Tab.3 Effect of gene chip for detection of rifampin and isoniazid resistance in clinic strains

敏感性Sensitivity(%)特異性Specificity(%)符合率Concordancerate(%)陽性預(yù)測值PPV(%)陰性預(yù)測值NPV(%)Kappa值Kappavalue利福平Rifampin9498.598.187.999.30.898異煙肼Isoniazid74.599.994.599.493.60.819耐多藥MDR82.599.497.894.198.10.867

Note：MDR=Multidrug resistant； PPV=Positive predictive value； NPV=Negative predictive value

2.4 基因芯片技術(shù)與BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)法檢測菌株耐多藥結(jié)果比較分析 基因芯片技術(shù)檢測耐多藥(MDR)結(jié)核結(jié)果與BACTEC MGIT 960分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果符合率為97.8%，敏感度和特異度分別是82.5%和99.4%，Kappa值為0.867，兩種方法一致性較好，見表3、表4。

表4 基因芯片技術(shù)與BACTEC MGIT 960法檢測菌株耐多藥結(jié)果比較分析
Tab. 4 Comparison of the results of gene chip and BACTEC MGIT 960 culture method for detection of MDR

基因芯片法GenechipmethodBACTECMGIT960培養(yǎng)法BACTECMGIT960culturemethod耐多藥MDR非耐多藥Non-MDR符合率Concordancerate(%)耐多藥MDR80597.8非耐多藥Non-MDR17897

Note: MDR=Multidrug resistant

2.5 基因芯片技術(shù)與基因測序結(jié)果比較分析 對999株經(jīng)BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)陽性的菌株rpoB、katG和inhA基因耐藥相關(guān)區(qū)域的擴增產(chǎn)物全部進行測序以驗證基因芯片的準確性?；蛐酒z測利福平耐藥結(jié)果有4株與DNA測序結(jié)果不同，檢測的準確率為99.6%，基因芯片法檢測異煙肼耐藥結(jié)果有2株與DNA測序結(jié)果不同，檢測的準確率為99.8%，見表5。

表5 基因芯片技術(shù)與基因測序結(jié)果比較分析
Tab.5 Comparison on the results of gene chip assay and DNA sequencing

IsolatesGenechipDNAsequencingMGIT960drugsusceptibilitytesting8-564rpoB531(C→T)rpoB野生型利福平耐藥1-393rpoB野生型rpoB526(C→A)和rpoB533(T→C)利福平耐藥3-973rpoB野生型rpoB533(T→C)利福平敏感8-464rpoB野生型rpoB511(T→C)和rpoB512(A→G)利福平耐藥5-75katG、inhA野生型inhA-8(T→C)異煙肼耐藥10-728katG、inhA野生型katG315(C→A)異煙肼耐藥

注：括號內(nèi)為檢測位點的堿基信息，箭頭前為野生型的堿基，箭頭后為突變后堿基。

Note: the brackets contain information on bases of detection loci., with wild-type bases before the arrows and mutation-types behind .

3 討 論

耐多藥結(jié)核菌(MDR-TB)感染問題已嚴重威脅社會公共衛(wèi)生安全。對耐藥結(jié)核患者早期診斷，及時給予充分有效治療，對于切斷耐藥結(jié)核傳播、減少藥物不良反應(yīng)十分必要。以細菌學(xué)為基礎(chǔ)的藥敏檢測方法，無論是傳統(tǒng)方法還是液體快速培養(yǎng)法都需要較長時間，無法滿足臨床快速診斷的需求。

基因芯片技術(shù)是20世紀90年代發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合了分子生物學(xué)高靈敏度和生物芯片的高通量性，具有快速、靈敏、準確等特點，該技術(shù)在在結(jié)核菌耐藥性檢測方面應(yīng)用越來越廣泛。本研究將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于痰標本直接檢測，在1 008例痰標本基因芯片檢測結(jié)果中僅有9例與BACTEC MGIT 960陽性菌株的基因芯片結(jié)果不一致，符合率高達99.1%。研究結(jié)果表明，從病人痰標本開始直接進行基因芯片檢測，結(jié)果與菌株的結(jié)果符合率高，節(jié)省了等待培養(yǎng)陽性菌株時間，大大縮短了檢測時間，僅需6 h就能得到藥敏結(jié)果，滿足了臨床快速檢測需求。

本研究中對于異煙肼耐藥結(jié)果基因芯片法與BACTEC MGIT 960藥敏試驗結(jié)果符合率為94.5%，敏感度和特異度分別為74.5%和99.9%，與趙雁林報道的77.4%的敏感度及96.9%的特異度相近[6]。結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥株主要有katG基因和inhA基因堿基突變[7-8]， 有文獻報道兩者總突變率達90.7%[9]?；蛐酒▽τ诋悷熾履退幮詸z測敏感度較低，推測可能與這些菌株突變位置發(fā)生在基因芯片檢測的位點范圍之外；另外可能與INH其他耐藥機制有關(guān)，諸如ahpC、oxyR、kasA、藥物外排泵基因突變等。其中，inhA是活化的異煙肼作用靶位，inhA與KasA參與分枝菌酸的生物合成，ahpC參與氧化一應(yīng)激應(yīng)答oxyR是調(diào)節(jié)分枝桿菌氧化一應(yīng)激的基因，參與調(diào)節(jié)katG和ahpC基因的表達[10-13]。有研究表明10%～15%的異煙肼耐藥菌株中可見ahpC-oxyR區(qū)突變[14]。該區(qū)可作為INH耐藥篩查的重要指標[15]。我們認為擴大基因芯片檢測的位點范圍，可能有助于提高方法的敏感度。

本研究利福平耐藥結(jié)果基因芯片法與BACTEC MGIT 960分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果符合率為98.1%，敏感度和特異度分別是94%和98.5%，Kappa值為0.898，兩種方法一致性較好。文獻報道利福平耐藥的病例中有95%～98%的利福平耐藥臨床分離株在結(jié)核分枝桿菌的80 bp的rpoB基因的利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)有突變[16-17]。

基因芯片對耐多藥結(jié)核病的診斷符合率為97.8%，其靈敏度和特異度分別為82.5%和99.4%，提示基因芯片技術(shù)對耐多藥結(jié)核病有一定的篩查與較高的排除診斷價值。

基因芯片法檢測利福平耐藥結(jié)果有4株與DNA測序結(jié)果不同，檢測的準確率為99.6%。本研究在利福平耐藥菌株中，通過測序發(fā)現(xiàn)了基因芯片法未包含的突變類型rpoB526(C→A)及新的突變位點rpoB512(A→G)，而其與利福平耐藥的相關(guān)性仍有待進一步的研究證明?；蛐酒z測異煙肼耐藥結(jié)果有2株與DNA測序結(jié)果不同，檢測的準確率為99.8%。本研究中異煙肼的基因芯片法結(jié)果與測序法結(jié)果不符的菌株通過測序發(fā)現(xiàn)了基因芯片未包含的突變類型katG315(C→A)及突變位點inhA-8 (T→C)。其中有文獻報道inhA的啟動子區(qū)域inhA-8 (T→C)與異煙肼的耐藥相關(guān)[18]。

基因芯片檢測為rpoB突變型的107株菌株中，106株存在單一位點突變，1株存在雙位點突變。突變頻率最高的位點是531，突變頻率是56%,其次是526位點，突變頻率是22.4%?；蛐酒瑱z測出159株katG/inhA突變株，111株是katG315位點的單一突變，突變率是70.7%。福州地區(qū)結(jié)核耐藥最主要是rpoB531,526位點突變，katG315位點突變。文獻報道，異煙肼耐藥主要與katG基因突變密切相關(guān)[19]。在異煙肼基因芯片檢測為突變的標本中突變頻率最高的位點是315，突變頻率是70.7%，與浙江地區(qū)(69.3%)315突變位點突變率相當(dāng)[20]，但與武漢地區(qū)(60.9%)[21]、深圳地區(qū)(84.6%)[22]等的報道區(qū)別較大。這說明katG315突變存在一定的地理差異。

綜上所述，基因芯片技術(shù)能夠直接利用痰標本進行檢測。對于利福平的耐藥性檢測結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏試驗結(jié)果具有很高的符合率而檢測異煙肼的敏感性則有待提高?；蛐酒夹g(shù)是一種快速檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的分子生物學(xué)方法，彌補了以細菌學(xué)為基礎(chǔ)的藥敏方法檢測時間長的缺點，為臨床提供快速診斷。

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Evaluation for clinical application effect of gene chip for detection of rifampin and isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosis

XU Rong-qing, LI Dan, LIN Yin-xia, HUANG Ming-xiang, CHEN Xin-chao

(FuzhouPulmonaryHospital/ClinicalTeachingHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350008,China)

We evaluated clinical application effect of gene chip for detection of rifampin (RFP) and isoniazid (INH) resistance inMycobacteriumtuberculosis(MTB). Rifampin and isoniazid drug-resistance gene loci were detected by gene chip with sputum specimens from smear-positive tuberculosis patients and clinical strains, comparing the results of detection. BACTEC MGIT 960 drug susceptibility test results were used as control to evaluate the detection performance of gene chip. The sequences of the polymerase chain reaction products of therpoB,katGandinhAgenes from 999 strains identified asMycobacteriumtuberculosiswere determined to confirm the mutations by DNA sequencing. Results showed that 100 cases were identified as nontuberculous mycobacteria by gene chip in the 1 108 cases of smear-positive samples. Among the rest 1 008 samples, there were only 9 cases of microarray results different from BACTEC MGIT960 culture-positive strains, achieving the coincidences of 99.1%. Compared with BACTEC MGIT 960 drug susceptibility test results, the gene chip method displayed a concordance of 98.1% and 94.5% for RFP and INH respectively in the 999 strains. Compared with the DNA sequencing method, the accuracy of gene chip method was 99.6% for rifampin resistance and 99.8% for isoniazid resistance. It's concluded that the gene chip technology can quickly and accurately detect rifampin and isoniazid resistance in MTB and can be used directly for the detection of sputum samples.

Mycobacteriumtuberculosis; rifampin; isoniazid; drug resistance; gene chip

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.008

福建省衛(wèi)生廳青年科研課題項目(No. 2013-2-77)

黃明翔，Email: hmg119@163.com

福建省福州肺科醫(yī)院檢驗科，福建醫(yī)科大學(xué)臨床教學(xué)醫(yī)院，福州 350008

R378.91

A

1002-2694(2017)01-0043-06

2015-12-26 編輯：梁小潔