ToxoDB#17型弓形蟲卵囊對昆明小鼠致病性的研究

王 凱，馮永杰，付曉瑩，陸瑤瑤，梁宏德，楊玉榮

ToxoDB#17型弓形蟲卵囊對昆明小鼠致病性的研究

王 凱，馮永杰，付曉瑩，陸瑤瑤，梁宏德，楊玉榮1

目的 為探究ToxoDB#17型弓形蟲對昆明小鼠的致病特點。方法 分別選擇<1個，1個，101個，102個，103個，104個，105個，106個ToxoDB#17型弓形蟲卵囊灌胃小鼠，觀察小鼠的臨床癥狀，采用改良凝集試驗、HE和IHC方法研究弓形蟲的感染率，小鼠生存率及其大腦內(nèi)的包囊數(shù)量。結果 ≥104個卵囊組小鼠在攻蟲后出現(xiàn)一過性的精神沉郁，弓背，被毛逆立現(xiàn)象，其余組精神狀態(tài)正常；≥102個卵囊可引起小鼠100%感染，感染小鼠的成囊率為2.38%(1/42)，感染小鼠生存率為85.71%(36/42)，存活時間≥360 DPI。結論 ToxoDB#17型弓形蟲對昆明小鼠的致病力弱，包囊形成率低。

ToxoDB#17型弓形蟲；昆明小鼠；包囊；致病性

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種呈世界性分布的細胞內(nèi)寄生原蟲，可感染幾乎所有恒溫動物，引起弓形蟲病。不同基因型弓形蟲對昆明小鼠的致病性不同[1]。我國目前為止共分離到154株弓形蟲，11個基因型，其對昆明小鼠的致病性研究僅有少量報道。本試驗首次將分離于河南貓體內(nèi)ToxoDB#17型弓形蟲蟲株，采用改良凝集試驗(modified agglutination test，MAT)，常規(guī)病理學方法，HE和IHC染色技術，研究這一蟲株對昆明小鼠的致病性特點，豐富中國蟲株對小鼠致病特性的認識，為弓形蟲卵囊入侵機制及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲卵囊及主要試劑 ToxoDB#17型弓形蟲蟲株分離于河南省鄭州市寵物市場貓的組織，貓糞便中卵囊的分離及純化具體操作方法參照Dubey JP (1987)[2]，ToxoDB#17型弓形蟲卵囊見圖1A。兔抗弓形蟲多克隆抗體、弓形蟲抗原受贈于美國農(nóng)業(yè)部Dubey實驗室，小鼠Specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC kit 購自abcam公司(貨號：ab64264)。

1.2 試驗動物及處理 6～8周齡健康清潔級昆明小鼠，購于鄭州大學實驗動物中心。小鼠隨機分為9組(8個感染組，1個對照組)，每組5～8只，分籠飼養(yǎng)，正常采食飲水。對照組小鼠灌胃無菌生理鹽水1ml/只，感染組小鼠每只分別灌胃<1個、1個、101個、102個、103個、104個、105個、106個的ToxoDB#17型卵囊溶液。104個、105個、106個每組8只小鼠，其他每組5只小鼠(表1)。感染后60 d(60 DPI)，采集小鼠血清，試驗組小鼠乙醚麻醉每組處死5只。其他小鼠每日觀察臨床表現(xiàn)，分別在120 DPI，180 DPI，240 DPI，300 DPI，360 DPI采集小鼠血清。每日觀察記錄發(fā)病和死亡情況。對自然死亡和處死的小鼠檢查并記錄肺臟、淋巴結中是否感染有弓形蟲；取大腦，計數(shù)大腦包囊數(shù)量，自然死亡小鼠的全部組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，常規(guī)方法制做石蠟切片，進行HE及弓形蟲抗原IHC染色，檢查其死亡原因。

1.3 試驗方法 血清弓形蟲IgG抗體檢測采用MAT方法[2]。小鼠大腦包囊計數(shù)，采用壓片顯微鏡檢查方法[3]。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007收集整理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5.0制圖。

2 結 果

2.1 小鼠的臨床表現(xiàn) 將8個不同數(shù)量級濃度的ToxoDB#17弓形蟲卵囊溶液灌胃給各組小鼠后，高濃度組(104個、105個、106個)小鼠一周內(nèi)表現(xiàn)為活動減少、精神沉郁、弓背，被毛逆立的現(xiàn)象，其他各組小鼠未見明顯異常。一周過后，各濃度組小鼠逐漸恢復正常飲食和活動，除自然死亡的小鼠外，其它小鼠被毛光滑，食欲旺盛，體重和活動量增加。

2.2 ToxoDB#17型弓形蟲的感染與致病情況 60 DPI小鼠血清弓形蟲IgG抗體結果顯示，1個和101個卵囊組小鼠的弓形蟲感染率為80%，≥102個卵囊組小鼠的感染率均為100%(表1)。104個，105個，106個卵囊組的小鼠血清在120 DPI，180 DPI，240 DPI，300 DPI，360 DPI，弓形蟲抗體均為陽性(血清陽性率100%)。102個，104個，105個，106個卵囊組分別有小鼠在44 DPI，37 DPI、60 DPI、300 DPI，180 DPI，44 DPI自然死亡，共6只。44 DPI，37 DPI自然死亡的小鼠，肺臟、腸系膜淋巴結切片IHC未見弓形蟲，肺臟可見血管內(nèi)有栓塞(1B)。60 DPI～300 DPI，自然死亡小鼠體內(nèi)長有惡性腫瘤(1C)。其余小鼠存活超過360 DPI，試驗小鼠生存曲線見圖2。

2.3 ToxoDB#17型弓形蟲感染小鼠后大腦包囊負載量 弓形蟲卵囊共接種44只小鼠， 42只小鼠感染弓形蟲，人為處死31只小鼠(60 DPI)，自然死亡6只小鼠(44 DPI, 180 DPI，37 DPI，60 DPI，330 DPI，44 DPI)，在這37只死亡小鼠中僅1只小鼠大腦有包囊(330 DPI，39個包囊)(圖1D)，目前還有5只小鼠存活，存活時間超過360DPI，感染小鼠的成囊率為2.38%(1/42)，感染小鼠生存率為85.71%(36/42)。

表1 ToxoDB#17型弓形蟲卵囊灌胃對昆明小鼠的致病特點
Tab.1 Patogenicity of the ToxoDB#17 strain ofT.gondiioocyst onKunmingmice by injection gavage

No.ofoocystsfedNo.ofinfection/No.ofinoculation(%)DaysofsurvivalBraincysts(No.)1065/5(100%)≥60/5no3/3(100%)44/1,≥360/2no1055/5(100%)≥60/5no3/3(100%)180/1,≥360/2no1045/5(100%)37/1,≥60/4no3/3(100%)60/1,330/1,≥360/1no,Yes(39),no1035/5(100%)≥60/5no1025/5(100%)44/1,≥60/4no1014/5(80%)≥60/5no14/5(80%)≥60/5no<10(0%)≥60/5no陰性對照組0(0%)≥60/5no

Note:amouse survival days / number of surviving mice

A: T. gondii oocysts, the hemocytometer grid smallest unit, smear, unstained, Bar=50 μm; B: Lung blood vessels containing thrombi, Paraffin sections, HE staining, Bar=100 μm; C: Tumor cells in the lung, Paraffin sections, HE staining, Bar=30 μm; D: T. gondii cysts in mouse brain, squash of the brain, unstained, 330 DPI. Bar=50 μm.圖1 ToxoDB#17型弓形蟲卵囊及小鼠病理變化Fig.1 ToxoDB#17 strain T. gondii oocysts and pathological change of mice

A: Survival curve of mice after fed of different dose of ToxoDB#17 strain T. gondii oocysts (0 DPI-60 DPI); B: Survival curve of chronically infected mice after fed ToxoDB#17 strain of T. gondii oocysts (0 DPI-360 DPI)圖2 昆明小鼠感染ToxoDB#17型弓形蟲卵囊的生存曲線Fig.2 The survival curve of mice after fed of ToxoDB#17 strain T. gondii oocysts

3 討 論

近年來，對世界各地人和動物體內(nèi)分離的弓形蟲蟲株多采用多位點PCR-RFLP基因分型，分型結果顯示，各地剛地弓形蟲具有豐富的遺傳多態(tài)性[4-5]。弓形蟲數(shù)據(jù)庫中已記錄的基因型有232個(http://toxodb.org/toxo)。但關于我國流行的弓形蟲基因型蟲株致病性的研究尚不充分。

研究顯示，I型弓形蟲蟲株致病力強，低劑量可引起小鼠急性感染而死亡；II型、III型弓形蟲蟲株致病力弱，較高劑量才可引起小鼠死亡，腦組織包囊數(shù)量高。CT1與GT1弓形蟲都是I型強毒株，它們對Swiss小鼠和Balb/c小鼠灌胃卵囊的最低致死量均為1個卵囊/只小鼠，RH株(ToxoDB#10)感染后的死亡率為25%，TgCtxz1(ToxoDB#10)感染后的死亡率為83.3%[6]。ME49為II型弓形蟲蟲株，它對Swiss小鼠和Balb/c小鼠灌胃卵囊的最低致死量為100-1 000個卵囊/只小鼠，Balb/c小鼠口服100個速殖子才可感染，感染后54 d可在大腦形成約566個組織包囊，Balb/c小鼠皮下注射一個速殖子可感染，54 d后在大腦形成約660個組織包囊。VEG為III型弓形蟲蟲株，它對Swiss小鼠和Balb/c小鼠灌胃卵囊的最低致死量為100-1000個卵囊/只小鼠，Swiss小鼠口服10個速殖子即可感染，103個可導致小鼠死亡，而皮下注射1個即可感染，104個可導致小鼠死亡[3,7]。VEG對Swiss小鼠的最低致死量為102個卵囊/只，平均死亡時間為11.6d，最早8d在小鼠大腦中可見小的組織包囊[8]。

與Chinese 1(ToxoDB#9)型比較，ToxoDB#17型弓形蟲對小鼠的致病力弱，腦包囊形成率低。Chinese 1弓形蟲蟲株分離數(shù)量占中國分離到的活蟲蟲株的66.67%，為優(yōu)勢基因型[9-10]，但Chinese 1型不同蟲株存在著明顯的毒力差異。在對昆明小鼠的試驗中發(fā)現(xiàn)[6]：TgCtgy1蟲株1個速殖子即可導致小鼠感染，感染后的死亡率為50%；TgCtwh3蟲株1個速殖子也可感染小鼠，感染后的死亡率為10%；TgCtwh6蟲株1個速殖子即可感染小鼠，但不能導致小鼠死亡，10個速殖子可導致感染后小鼠6.2%的死亡率。對Balb/c小鼠皮下注射速殖子的研究發(fā)現(xiàn)[11]：TgCtwh3蟲株50個速殖子可導致小鼠在感染后9 d死亡率達100%；TgCtwh6蟲株500個速殖子在感染后30d內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡；TgCtwh6蟲株5×105個速殖子可導致小鼠在感染后第7 d開始死亡，到第30 d死亡率為80%。Swiss小鼠注射TgCtsd2、 TgCtsd3、TgCtwh6蟲株的速殖子后到感染第45 d，可在小鼠大腦內(nèi)觀察到組織包囊[12]。ToxoDB#17已從法國、巴西、阿根廷、秘魯(http://toxodb.org/toxo)、中國[13]分離出來，關于它的致病性尚未有文獻報道，因此本試驗研究它對昆明小鼠的致病性。結果顯示，灌胃ToxoDB#17弓形蟲卵囊后1周內(nèi)小鼠表現(xiàn)為活動減少、精神狀態(tài)不佳，1周過后各濃度組小鼠逐漸恢復正常飲食和活動，說明ToxoDB#17弓形蟲的致病性很弱。在感染ToxoDB#17弓形蟲的42只小鼠，人為處死31只小鼠(60 DPI)，自然死亡6只小鼠，尚有5只小鼠存活，自然死亡小鼠病理組織學研究發(fā)現(xiàn)其組織未見弓形蟲，死亡直接原因是肺栓塞或腫瘤(圖1 B，C)，這個結果排除了弓形蟲引起小鼠自然死亡的可能。王林[14]采用TgCtwh6(Chinese 1型)50個弓形蟲包囊灌胃感染昆明小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠同樣出現(xiàn)一過性的炎癥反應，感染第35 d至試驗結束，小鼠精神狀態(tài)恢復正常，且在感染后第21 d首次在存活小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量包囊，成囊率為80%，隨著感染時間的推移，包囊逐漸增多，至第35 d，小鼠的成囊率為100%。本試驗中各濃度梯度的ToxoDB#17型卵囊灌胃小鼠60 d后，在感染的35只小鼠大腦研磨液中均未發(fā)現(xiàn)包囊。在小鼠進入慢性感染期后到360 DPI，只在104個濃度組一只小鼠大腦檢出包囊。本研究所用昆明小鼠為清潔級，排除了小鼠在接種前存在潛伏感染的可能性。同時根據(jù)MAT試驗結果，證明1個ToxoDB#17型弓形蟲卵囊即可導致昆明小鼠感染，但高濃度的卵囊并沒有導致小鼠死亡，說明昆明小鼠對ToxoDB#17 型卵囊易感，但大腦包囊成囊率低。

綜上，與我國弓形蟲優(yōu)勢基因型Chinese 1比較，ToxoDB#17型弓形蟲分離株對小鼠的毒力較低，其致病性和包囊形成明顯弱于Chinese 1型弓形蟲蟲株。關于其毒力差異的原因還需進一步深入研究。

[1] Lehmann T, Marcet PL, Graham DH, et al. Globalization and the population structure ofToxoplasmagondii[J]. Proc Natl Acad Sci, 2006, 103(30): 11423-11428.

[2] Dubey JP, Desmonts G. Serological responses of equids fedToxoplasmagondiioocysts[J]. Equine Vet J, 1987, 19(4): 337-339.

[3] Dubey JP, Ferreira LR, Martins J, et al. Oral oocyst induced mouse model of toxoplasmosis: effect of infection withToxoplasmagondiistrains of different genotypes, dose, and mouse strains (transgenic, out-bred, in-bred) on pathogenesis and mortality[J]. Parasitology, 2012, 139(1): 1-13.

[4] Louis MW, Kami K.Toxoplasmagondii[M]. New Jersey: Esevier ltd. 2014: 62-89.

[5] Hernan L, Asis K, Michael SB, et al. Local admixture of amplified and diversified secreted pathogenesis determinants shapes mosaicToxoplasmagondiigenomes[J]. Nat Commun, 2016, 7(7): 1-13.

[6] Li M, Mo XW, Wang L, et al. Phylogeny and virulence divergency analyses ofToxoplasmagondiiisolates from China[J]. Parasit Vectors, 2014, 7(7): 67-70.

[7] Dubey JP. Bradyzoite induced murine toxoplasmosis: stage conversion, pathogenesis, and tissue-cyst formation in mice fed bradvzoites of different strains ofToxoplasmagondii[J]. J Euk Microbiol, 1997, 44(6): 592-602.

[8] Dubey JP, Speer CA, Shen SK, et al. Oocyst-induced murine toxoplasmosis: life cycle, pathogenicity, and stage conversion in mice fedToxoplasmagondiioocysts[J]. J Parasitol, 1997, 83(5): 870-882.

[9] Fu XY, Feng YJ, Liang HD, et al. Genotypes and pathogenesis ofToxoplasmagondiiisolates in China[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(7): 669-673. (in Chinese)

付曉瑩，馮永杰，梁宏德，等. 中國弓形蟲分離株基因型及致病性的研究進展[J]. 中國人獸共患病學報, 2015, 31(7): 669-673.

[10] Meng DD, Wang L, Lou Y, et al. Genotype and virulence ofToxoplasmagondiiisolates from cats in Guiyang, Southwest China[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(2): 150-154. (in Chinese)

孟德娣，王林，樓研，等. 貴陽貓源弓形蟲株基因分型及毒力研究[J]. 中國人獸共患病學報, 2014, 30(2): 150-154.

[11] Zhang AM, Shen Q, Li M, et al. Comparative studies of macrophage-biased responses in mice to infection withToxoplasmagondii, ToxoDB #9 strains of different virulence isolated from China[J]. Parasit Vectors, 2013, 6(1): 386-395.

[12] Wang L, Chen H, Liu DH, et al. Genotypes and mouse virulence ofToxoplasmagondiiisolates from animals and humans in China[J]. PLoS One, 2013, 8(1): 1-11.

[13] Yang Y, Ying Y, Verma SK, et al. Isolation and genetic characterization of viableToxoplasmagondiifrom tissues and feces of cats from the central region of China[J]. Vet Parasitol, 2015, 211(3/4): 283-288.

[14] Wang L. The prevalence ofToxoplasmagondiiisolates genotyping and virulence[D]. Hefei: Anhui Medical University, 2012. (in Chinese)

王林. 流行我國的弓形蟲分離株基因分型及其毒力研究[D]. 合肥:安徽醫(yī)科大學, 2012.

Virulence and pathogenicity ofToxoplasmagondiiToxoDB#17 strain oocysts inKunmingmice

WANG Kai, FENG Yong-jie, FU Xiao-ying, LU Yao-yao, LIANG Hong-de, YANG Yu-rong

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

To investigate the pathogenic characteristic of ToxoDB#17ToxoplasmagondiiinKunmingmice, the mice were fed with <1, 1, 101, 102, 103, 104, 105, 106oocysts, and the clinical symptoms of mice were observed. MAT, HE and IHC were used to research the infection rate ofT.gondii, survival rate of mice and the number of cysts in brain. The results showed that the mice fed with ≥104oocysts appeared transient depression, mice were arched, messy hair after infection. The mice fed with ≥102oocysts were all infected,T.gondiicysts formation rate was 2.38% (1/42), the survival rate of infected mice was 85.71% (36/42), the survival time was greater than 360 days. In conclusion, the pathogenicity of ToxoDB#17T.gondiiis weak, and cysts formation rate is also low.

ToxoDB#17;Toxoplasmagondii;Kunmingmice; tissue cysts; pathogenicity

Yang Yu-rong, Email: yangyu7712@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.009

國家自然科學基金(No. 30800812)，河南省自然科學基金資助(No.162300410138)

楊玉榮， yangyu7712@sina.com

河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院, 鄭州 450002

R382.5

A

1002-2694(2017)01-0049-04

2016-07-04 編輯：劉岱偉

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30800812) and the Natural Science Foundation of Henan Province (No.162300410138)