禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H受體的初步鑒定

吾魯木汗·那孜爾別克，韋 東，恩特馬克·布拉提白，肖 迪

禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H受體的初步鑒定

吾魯木汗·那孜爾別克1,2，韋 東2，恩特馬克·布拉提白1,2，肖 迪3

目的 鑒定雞胚成纖維(CEF)細胞膜禽多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H(OmpH)受體。方法 用膜蛋白提取試劑盒制備CEF細胞的膜蛋白，通過SDS-PAGE和配體印跡檢測CEF細胞膜蛋白中的OmpH受體，采用MALDI-TOF質譜技術鑒定蛋白種類，并用配體印跡、ELISA和免疫熒光技術檢測OmpH受體在不同宿主食管黏膜細胞表面的分布情況。結果 在轉印CEF細胞膜蛋白的NC膜上有一條明顯的疑似受體條帶，分子量約為49 kDa。MALDI-TOF質譜鑒定結果表明該受體蛋白是ATP合成酶β亞基。在轉印雞和兔食管黏膜細胞膜蛋白的NC膜上檢測到能夠與OmpH結合的蛋白條帶，但在牛和豬食管黏膜細胞膜蛋白中未見任何印跡條帶，而OmpH與雞和兔食管黏膜細胞膜蛋白的結合力高于豬和牛食管黏膜細胞膜蛋白。結論 禽多殺性巴氏桿菌OmpH受體可能是CEF細胞膜表面的ATP合成酶β亞基。

禽多殺性巴氏桿菌；OmpH；受體；ATP合成酶β亞基

禽霍亂是由血清型A∶1、A∶3或A∶4的多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，以下簡稱巴氏桿菌)引起的一種急性敗血性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。目前，國內(nèi)外用滅活疫苗和活疫苗來控制巴氏桿菌病，但這些疫苗存在保護周期短、交叉保護性較差和易出現(xiàn)毒力返強等缺點，所以至今本病仍未得到有效控制[2-3]。病原菌感染機體的第一步，為黏附素和宿主細胞表面相應特異性受體的結合，而介導細菌的定居、宿主細胞信號傳遞和適當途徑的毒素傳遞，從而引發(fā)機體一系列病理過程，直至細胞、組織器官死亡[4-5]。

研究表明，A型禽巴氏桿菌的外膜蛋白H(outer membrane protein H，OmpH)具有黏附作用和交叉保護作用，即抗OmpH抗體阻止了細菌對雞胚成纖維(chicken embryo fibroblast, CEF)細胞的黏附，且OmpH免疫組雞或OmpH免疫組小鼠對血清型A∶1和A∶3菌株致死性攻毒的保護率分別為100%和80%[6-9]。國內(nèi)外學者為了探討OmpH的致病作用，采用基因敲除技術和RNA干擾技術分別構建血清型A∶1和A∶3禽巴氏桿菌ompH基因的突變株，結果顯示突變株的莢膜合成能力基本喪失，而突變株對SPF豬或對小鼠的致病性明顯降低[10-11]。后來韋東等[12]檢測雞血清補體或小鼠腹腔巨噬細胞對ompH基因缺失突變株的殺傷作用，結果顯示與野生株相比突變株的血清抵抗性和抗吞噬作用顯著降低。上述研究結果表明，OmpH在A型禽巴氏桿菌對宿主的感染與致病過程中可能發(fā)揮重要的作用，但在自然宿主細胞膜OmpH受體及其致病機制尚不清楚。因此，本文用配體印跡技術檢測CEF細胞膜蛋白中的OmpH受體，通過MALDI-TOF質譜技術鑒定受體蛋白種類，并用免疫學方法檢測OmpH受體在不同宿主細胞膜中的分布。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株、試驗動物和動物組織 血清型A∶1禽巴氏桿菌C48-3株購自國家獸醫(yī)菌種保藏中心；禽巴氏桿菌C48-3株重組蛋白OmpH的原核表達和純化及其抗體制備等工作在本實驗室完成[12]；8周齡SPF雞和種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；清潔級新西蘭白兔購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；2歲健康湘西黃牛食管組織和1歲湘西黑豬食管組織由湖南省吉首市畜牧水產(chǎn)局提供。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 Protein Molecular Weight Marker (Broad)購自TaKaRa公司；Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit購自上海前塵生物科技有限公司；X-Gal和IPTG購自北京鼎國公司；HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG、FITG標記的羊抗兔IgG、鄰苯二胺(DAB)購自上海生工生物工程公司；抗6聚組氨酸單克隆抗體購自南京Bioword Technology公司；6聚組氨酸由上海強輝生物科技有限公司合成；BSA購自北京欣經(jīng)科生物技術有限公司。Dextrose Starch Agar(DSA)和Tryptose Broth(TB)培養(yǎng)基均為Difco公司產(chǎn)品；MEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CEF細胞膜蛋白樣本的制備 按Borrathybay等的方法[6]，用10日齡SPF雞胚制備CEF細胞，用含100 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL卡那霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B和10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液制備濃度約為106個/mL的CEF細胞，將20 mL細胞液加入500 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，通過0.25%胰蛋白酶消化收集CEF細胞，-80 ℃保存。采用Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit提取CEF細胞的膜蛋白樣本。Bradford法測定蛋白質含量，以BSA為標準品繪制標準曲線。

1.2.2 CEF細胞膜蛋白的SDS-PAGE和配體印跡分析 按Mullen等介紹的方法[13]進行。取制備好的CEF細胞膜蛋白100 ℃處理5 min，用SDS-PAGE分離CEF細胞膜蛋白條帶，用半干式電轉儀將凝膠中的蛋白條帶轉移至硝酸纖維素(NC)膜上，用封閉液(含5%脫脂奶粉和0.1%Tween 20的PBS溶液)4 ℃封閉過夜，加入純化的重組OmpH(20 μg/mL)或6聚組氨酸(10 μg/mL)室溫作用1 h，加抗重組OmpH抗體(1∶500)或抗6聚組氨酸單克隆抗體(1∶1 000)室溫反應2 h，然后與HRP標記的羊抗兔IgG(1∶1 000)或HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，充分沖洗后，用DAB顯色液避光顯色。

1.2.3 OmpH受體的MALDI-TOF質譜鑒定 通過配體印跡分析得知，CEF細胞膜蛋白中的分子量約為49 kDa蛋白可被OmpH配體所識別。將此位置的蛋白條帶切膠回收，加入胰蛋白酶37 ℃充分消化后，采用5700型飛行時間質譜儀(MALDI-TOF/ TOF-MS，Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)鑒定蛋白種類。Nd：YAG激光器頻率200 Hz，波長為355 nm，正離子模式采用，默認校準(誤差小于50 ppm)。酶解之后的樣品中加入蛋白溶解液(0.5%TFA-50%ACN)，采用干滴法使樣品蛋白與基質(10 mg/mL)以1∶1的比例在192靶上混合，干燥后行質譜采樣。采用4 000 Series ExplorerTMsoftware version 3.0軟件采集樣品。從800 Da到4 000 Da采集一級譜圖，采用interpreation從高到底采集6個母離子。使用GPS工作站(GPS ExplorerTMv3.6，Mascot v2.1) 搜索NCBI的非冗余蛋白質數(shù)據(jù)庫。設置可變修飾Carboxymethyl(C)、Oxidation(M)，搜索母離子偏差設為0.1 Da，MS/MS片段偏差設為0.1 Da。蛋白與離子的置信區(qū)均高于95%，且至少有兩個肽段得分大于50或一個肽段得分大于60，確認蛋白。

1.2.4 不同宿主食管黏膜細胞膜蛋白的配體印跡分析 將SPF雞、清潔級新西蘭白兔、健康湘西黃牛和湘西黑豬的食管組織放入-80 ℃凍存72 h。取冷凍保存的雞、兔、豬和牛食管，PBS清洗后用無菌刀片切開食管，去除外層和肌肉層，取內(nèi)層黏膜組織用于制備膜蛋白樣本。用Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit分別制備雞、兔、牛和豬食管黏膜細胞膜蛋白樣本。用重組OmpH和其抗體經(jīng)配體印跡法檢測在不同宿主食管黏膜細胞膜蛋白中的OmpH受體。

1.2.5 不同宿主食管黏膜細胞膜OmpH受體的ELISA檢測 按Moser等的方法[14]檢測不同宿主食管黏膜細胞膜表面的OmpH受體。即用100 mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)制備蛋白含量為20 μg/mL的膜蛋白溶液，將50 μL膜蛋白溶液加入ELISA板孔內(nèi)，37 ℃包被2 h，用含1% BSA的PBS溶液室溫封閉30 min，將50 μg/mL的重組OmpH溶液50 μL加入ELISA板孔內(nèi)，37 ℃孵育1 h，用含0.1%Tween 20的PBS(PBST)洗板3次，加50 μL的抗重組OmpH抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，PBST洗板3次，加50 μL的HRP標記的羊抗兔IgG(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次。將OPD底物溶液150 μL加入酶標板孔內(nèi)，室溫避光顯色15 min，最后用25% H2SO4溶液終止反應。用酶標儀測定OD492的吸光值。

1.2.6 不同宿主食管黏膜細胞膜OmpH受體的免疫熒光檢測 將100 μg/mL的膜蛋白溶液300 μL加入置有無菌蓋玻片的24孔組織培養(yǎng)板4 ℃孵育過夜，加入300 μL封閉液(含3% BSA和0.1% Tween20的PBS溶液)37 ℃封閉2 h，PBST洗滌1次，將100 μg/mL的重組OmpH溶液300 μL加入24孔組織培養(yǎng)板孔內(nèi)，37 ℃作用2 h，加入抗重組OmpH抗體(1∶500)室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加FITG標記的羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育30 min，用去離子水清洗后，用熒光顯微鏡觀察OmpH與膜蛋白的結合情況。

2 結 果

2.1 CEF細胞膜蛋白的SDS-PAGE檢測結果 制備的CEF細胞膜蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE分離出多種蛋白組分(圖1泳道1和2)，與劉偉等[15]提取的CEF細胞膜蛋白SDS-PAGE結構基本相似。通過鎳離子親和層析法純化得到了N端帶有6個組氨酸標簽的重組OmpH(圖1泳道3)。

M：蛋白質分子量標準；1、2：CEF細胞膜蛋白；3：純化的重組OmpHM：Protein marker；1，2：CEF cell membrane proteins；3：Purified recombinant protein OmpH圖1 CEF細胞膜蛋白的SDS-PAGE檢測結果Fig.1 SDS-PAGE analysis of CEF cell membrane proteins

M：蛋白質分子量標準；1、2、4、5：CEF細胞膜蛋白；3、6：純化的重組OmpH M：Protein marker；1，2，4，5：CEF cell membrane proteins；3，6：Purified recombinant OmpH圖2 禽巴氏桿菌OmpH受體的配體印跡檢測Fig.2 Ligand blot assay to detect receptor for OmpH of avian P.multocida

2.2 OmpH受體的配體印跡檢測 配體印跡結果顯示，在轉印CEF細胞膜蛋白的NC膜上出現(xiàn)一條49 kDa蛋白條帶(圖2泳道1和2)，即能與重組OmpH結合的CEF細胞膜蛋白條帶，而重組OmpH與其抗體特異性結合(圖2泳道3)。另外，重組OmpH能夠與抗6聚組氨酸單克隆抗體結合(圖2泳道6)，但在轉運CEF細胞膜蛋白的NC膜上未見任何印跡條帶(圖2泳道4和5)。本研究結果表明，在CEF細胞膜蛋白中的49 kDa蛋白條帶可能是OmpH受體。

2.3 OmpH受體的MALDI-TOF質譜鑒定 將CEF細胞膜蛋白中的49 kDa蛋白條帶切取后，膠內(nèi)酶解并用于MALDI-TOF質譜鑒定。質譜鑒定結果表明，CEF細胞膜蛋白中的OmpH結合蛋白是ATP合成酶β亞基，與NCBInr數(shù)據(jù)庫已公布的原雞(Gallusgallus)、爪蛙(Xenopuslaevis)、鮭魚(Salmosalar)、斑馬魚(Daniorerio)ATP合成酶β亞基的C.I%值均高于97(表1)，表明CEF細胞膜蛋白中的OmpH受體可能是ATP合成酶β亞基。

表1 禽巴氏桿菌OmpH受體的MALDI-TOF/TOF質譜鑒定
Tab.1 Identification of OmpH receptor for avianP.multocidaby MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry

ProteinnameAccessionNo.ProteinMW(kDa)ProteinscoreProteinscoreCI%TotalioneCI%ATPsynthasesubunitbeta,mito-chondrialprecursor[Gallusgallus]gi|7189723751.519110097.855MitochondrialATPsynthasebetasubunit[Xenopuslaevis]gi|14822335965.216410097.855ATPsynthaseH+transportingmi-tochondrialF1complexbeta[Salmosalar]gi|19828547754.515310097.855MitochondrialATPsynthasebetasubunit-like[Daniorerio]gi|6677308054.915110097.855ATPsynthasesubunitbeta,mito-chondrialprecursor[Homosapiens]gi|3218939448.114710031.08MitochondrialATPsynthase,H+transportingF1complexbetasub-unit[Lepuseuropaeus]gi|8957402345.114710031.08

2.4 不同宿主食管黏膜細胞膜OmpH受體的配體印跡檢測 SDS-PAGE結果顯示，CEF細胞膜蛋白結構與雞食管黏膜細胞膜蛋白結構基本相似(圖3泳道1和2)，與兔、豬和牛食管黏膜細胞膜蛋白結構有差異(圖3泳道3、4和5)。配體印跡結果顯示，OmpH分別能與CEF細胞和雞食管黏膜細胞的49 kDa膜蛋白結合(圖3泳道6和7)，OmpH也能與兔食管黏膜細胞的52 kDa膜蛋白結合(圖3泳道8)，但在轉印豬或牛食管黏膜細胞膜蛋白的NC膜上未見任何印跡條帶(圖3泳道9和10)，表明OmpH受體可能具有宿主特異性。

2.5 不同宿主食管黏膜細胞膜OmpH受體的ELISA檢測 如圖4所示，OmpH對CEF細胞、雞食管黏膜細胞、兔食管黏膜細胞膜蛋白結合的OD值高于豬和牛食管黏膜細胞膜蛋白以及BSA對照組(P<0.01)，表明雞和兔食管黏膜細胞膜蛋白中可能存在OmpH受體。

2.6 不同宿主食管黏膜細胞膜OmpH受體的免疫熒光檢測：如圖5所示，OmpH對CEF細胞、雞食管黏膜細胞和兔食管黏膜細胞膜蛋白的結合能力高于豬食管黏膜細胞和牛食管黏膜細胞膜蛋白，表明在雞和兔食管黏膜膜蛋白中可能存在OmpH受體。

3 討 論

配體印跡是一種鑒定細胞膜受體的常用方法[13-15]。它是通過SDS-PAGE分離細胞膜蛋白后，轉印至硝酸纖維素膜或PVDF膜上，再與相應的配體作用，確定能與配體結合的蛋白條帶。本研究采用配體印跡技術從CEF細胞膜蛋白中檢測到能夠與OmpH結合的49 kDa蛋白條帶，通過MALDI-TOF質譜技術將其鑒定為ATP合成酶β亞基。用SDS-PAGE比較了雞、兔、牛、豬食管粘膜細胞膜蛋白的結構，結果顯示SPF雞食管粘膜細胞膜蛋白的結構與CEF細胞膜蛋白的結構基本相似，與兔、牛和豬食管黏膜細胞膜蛋白的結構有一定的差異，表明不同宿主黏膜細胞膜蛋白組分有明顯的差異。為了探討OmpH受體的宿主特異性，用配體印跡檢測OmpH受體在雞、兔、牛和豬食管黏膜細胞膜蛋白

M：蛋白質marker；1、6：CEF細胞；2、7：雞食管黏膜細胞；3、8：兔食管黏膜細胞；4、9：豬食管黏膜細胞；5、10：牛食管黏膜細胞M：Protein marker；1，6：CEF cells；2，7：Chicken esophageal mucosal cells；3，8：Rabbit esophageal mucosal cells；4，9：Swine esophageal mucosal cells；5，10：Bovine esophageal mucosal cells圖3 不同動物食管黏膜細胞膜蛋白的SDS-PAGE和配體印跡檢測Fig.3 SDS-PAGE and Ligand blot analysis of membrane proteins from the different animal esophageal mucosal cells

**：Significantly different at P<0.01 when compared to the membrane proteins of cattle esophageal mucosal cells and swine esophageal mucosal cells, as well as BSA (a negative control)圖4 不同動物食管黏膜細胞膜OmpH受體的ELISA檢測Fig.4 Determination of the binding ability of the OmpH to the membrane proteins of different animal esophageal mucosal cells by ELISA

A：CEF細胞；B：雞食管黏膜細胞；C：兔食管黏膜細胞；D：牛食管黏膜細胞；E：豬食管黏膜細胞；F：牛血清白蛋白A：CEF cells；B：Chicken esophageal mucosal cells；C：Rabbit esophageal mucosal cells；D：Cattle esophageal mucosal cells；E: Swine esophageal mucosal cells；F：Bovine serum albumin 圖5 不同動物食管黏膜細胞膜OmpH受體的熒光顯微鏡觀察Fig.5 Observation of by fluorescence microscope of the binding of OmpH to the membrane proteins of different animal esophageal mucosal cells

中的分布情況，結果顯示CEF細胞和兔粘膜細胞膜蛋白中檢測到能被OmpH所識別和結合的蛋白條帶，分子量分別49 kDa和52 kDa，而牛和豬食管黏膜細胞膜蛋白未見任何印跡條帶。而間接ELISA和免疫熒光染色結果顯示，OmpH對牛和豬食管黏膜細胞膜蛋白的結合能力低于雞和兔食管黏膜細胞膜蛋白。上述研究結果表明，CEF細胞和雞黏膜細胞膜蛋白中的ATP合成酶β亞基可能是A型禽巴氏桿菌黏附蛋白OmpH的受體，且該受體具有宿主特異性。

F1F0-ATP合成酶(F1F0-ATP synthase)是定位于真核細胞線粒體上的多亞單位復合酶分子，主要由脂溶性的F0和水溶性的F1兩個亞單位組成。F1的亞基構成及比例為α3β3γδε，其中α/β亞基成對存在，催化由ADP到ATP的合成。ATP合成酶的催化活性部位在F1的β亞基上，3個β亞基輪流執(zhí)行催化。Das等[16]從人腫瘤細胞A549的細胞膜中首次發(fā)現(xiàn)ATP合成酶β亞基(hATP5B)，純化的hATP5B能夠與NK細胞和具有白介素2活性的LAK細胞的細胞膜結合，且抑制了這些淋巴細胞對人腫瘤細胞K562和A549的細胞毒性作用。后來國內(nèi)外學者從多種腫瘤細胞膜和腫瘤血管內(nèi)皮細胞膜中發(fā)現(xiàn)ATP5B，它是血管抑素(Angiostatin)的受體，而血管抑素是通過與腫瘤細胞膜或血管內(nèi)皮細胞膜上的ATP5B結合來抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性[17-19]。

從上述血管抑素對腫瘤血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞膜ATP合成酶酶活力的抑制作用，以及A型禽巴氏桿菌感染雞后出現(xiàn)出血性敗血癥的臨床癥狀，可以推測OmpH通過與雞血管內(nèi)皮細胞膜表面的ATP合成酶β亞基結合來抑制ATP合成酶的酶活性，從而導致機體的一系列病理過程，直至血管內(nèi)皮細胞的死亡以及血管的破裂出血。所以，進一步研究禽巴氏桿菌黏附蛋白OmpH和CEF細胞膜ATP合成酶β亞基(受體)的相互作用及其致病機理，將可為禽巴氏桿菌病的預防和治療提供重要的線索。

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Preliminary identification of the outer membrane protein H receptors of avianPasteurellamultocida

NAZIERBIEKE Wulumuhan1,2, WEI Dong2, BORRATHYBAY Entomack1,2, XIAO Di3

(1.CollegeofBiologicalandGeographySciences,YiliNormalUniversity,Yining835000,China;2.CollegeofBiologyandEnvironmentalSciences,JishouUniversity,Jishou416000,China;3.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControland
Prevention,Beijing102206,China)

To identify the receptors for the outer membrane protein H (OmpH) of avianP.multocida, the membrane proteins of chicken embryo fibroblast (CEF) cells were separated by SDS-PAGE and analyzed by Ligand blot. The OmpH-binding protein was identified by MALDI-TOF mass spectrometry, and its distribution in the membrane proteins of different host esophageal mucosal cells was detected by Ligand blot, ELISA and immunofluorescence microscopy, respectively. Ligand blot analysis showed that a 49-kDa membrane protein of CEF cells bound to recombinant OmpH, and MALDI-TOF spectral results demonstrated that the OmpH-binding protein was ATP synthase β subunit. In addition, the OmpH receptor was present in the chicken and rabbit mucosal cell membranes, but was not detected in the bovine and swine mucosal cell membranes. The above results indicate that the OmpH receptor may be CEF cell-derived ATP synthase beta subunit.

avianPasteurellamultocida; OmpH; receptor; ATP synthase beta subunit

Borrathybay Entomack, Email: 1632984092@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.002

國家自然科學基金項目(No. 31360613)資助

恩特馬克·布拉提白，Email: 1632984092@qq.com

1.伊犁師范學院生物與地理科學學院，伊寧 835000； 2.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，吉首 416000； 3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206

R378

A

1002-2694(2017)01-0009-06

2016-05-30 編輯：李友松

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31360613)