生物樣本庫中血液RNA提取方法的介紹

章佳英，嵇承棟，萬悅竹，付強(qiáng)強(qiáng)，朱琳懿

生物樣本庫中血液RNA提取方法的介紹

章佳英，嵇承棟，萬悅竹，付強(qiáng)強(qiáng)，朱琳懿

RNA 在人類的多種生理和病理過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[1-2]。隨著第二代測序技術(shù)的發(fā)展[3]，針對人類不同疾病的 RNA 樣本測序研究廣泛開展，并得到了大量有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)。高質(zhì)量的 RNA 可以滿足 RT-PCR、qRT-PCR、Northern blot、基因表達(dá)譜、轉(zhuǎn)錄組測序、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)和陣列分析等生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)的研究需求[4-5]。

在脊椎動(dòng)物中，外周血一直被認(rèn)為是侵害性較小、較有價(jià)值的 RNA 來源[6-7]。在許多生物樣本庫中，由于血液樣本的常規(guī)收集、處理及保存方法簡便、成本低且富含可利用成分（如血清、血漿、白細(xì)胞和紅細(xì)胞等）和生物分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物），因此是進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目分析的理想實(shí)驗(yàn)材料。然而，RNA 極易降解，許多因素如內(nèi)源性和外源性的 RNA 酶、預(yù)處理、保存和提取過程，可能會(huì)不同程度地影響 RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，必須注意樣本收集、處理和儲(chǔ)存過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，從根本上確保獲得高質(zhì)量的RNA[8]。

以前的研究比較了不同采樣技術(shù)或提取方法對 RNA的影響[9-10]，但是尚無關(guān)于血液樣本 RNA 抽提的系統(tǒng)報(bào)道。因此，本文評估各種不同采樣技術(shù)結(jié)合提取方法，比較不同方法對血液 RNA 產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。本研究目的是找到最合適的血液 RNA 提取方案，以便在生物樣本庫中作批量應(yīng)用。

1 RNA 提取方法

常見的 RNA 提取方法有苯酚法、陰離子去污劑法、熱硼酸法或改良熱硼酸法、LiCl-尿素法、改良的 Gomez 法、異硫氰酸胍法、TRIzol 試劑快速提取法、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，很多生物技術(shù)公司著手RNA 提取試劑盒的研究并取得豐碩成果，將科研人員從繁瑣的提取、純化工作中解放出來。目前，RNA 提取中常用的試劑盒主要分為 3 種：TRIzol 試劑一步法、TRIzol LS 試劑一步法和 PAXgene 試劑盒法，前兩者均使用苯酚和異硫氰酸胍的單相溶液，而 PAXgene 法需根據(jù)試劑生產(chǎn)商說明書操作。

近年來，RNA 提取方法有了很大改進(jìn)[11]，本文選取12 種具有代表性的提取方法進(jìn)行系統(tǒng)比較（表 1），其中Liu 等[12]系統(tǒng)地比較了其中 6 種方法（A ～ F），提取過程見圖 1；而 H?ntzsch 等[13]比較了另外 6 種方法（G ～ L）（圖 2），其中，手工法 4 種和半自動(dòng)法 2 種。

表 1 分離方法匯總

全血基因的表達(dá)譜通常用 PAXgene 或 Tempus 血液采集管研究[14-15]，H?ntzsch 等[13]比較了不同提取系統(tǒng)（filter-based vs magnetic beads；手工 vs 自動(dòng)）結(jié)合PAXgene 和 Tempus 血液 RNA 采集管的 RNA 數(shù)量和質(zhì)量，計(jì)算不同提取方法所耗費(fèi)的時(shí)間，以及每個(gè)樣本的處理時(shí)間，評估 mRNA 和 miRNA 的表達(dá)與 RNA 提取方法、RT-PCR 和 qRT-PCR 試劑之間的關(guān)系。

圖 1 RNA 的前處理及分離過程

圖 2 H?ntzsch 等[13]的研究設(shè)計(jì)

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，保存和使用高質(zhì)量的樣本，以及充足的樣本量供下游應(yīng)用至關(guān)重要。如何實(shí)現(xiàn)充分利用樣本的目標(biāo)，對研究人員來說仍然是一個(gè)非常大的挑戰(zhàn)。在醫(yī)學(xué)研究中，人類血液樣本經(jīng)常被用來提取 RNA，包括來自白膜層的總 RNA 和游離的 RNA。Liu 等[12]研究比較冰凍前 RNA 提取的五種不同血液處理方法，并評估從這些方法得到的 RNA 質(zhì)量和數(shù)量。如方案 A，為充分利用血液樣本，首先從全血中分離白膜層提取 RNA，其他組分如血漿和紅細(xì)胞可以直接使用或者留存?zhèn)溆?。方?B（TRIzol）和方案 D（TRIzol LS）用全血分離 RNA，TRIzol 和 TRIzol LS 都是苯酚和異硫氰酸胍的單相溶液，一步法分離 RNA，其也能用于樣本的保存。RNAlater（方案 C）是一種水溶性的、無毒的組織保存劑，非冰凍情況下，穩(wěn)定或保護(hù)細(xì)胞的原位 RNA，它也能用于處理和保存白細(xì)胞，包括短期儲(chǔ)存或室溫運(yùn)輸和 –80 ℃ 長期保存。PAXgene Blood RNA tube（方案 F）是一種血液采集管，自采血伊始就穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的 RNA。一些研究人員選擇在血液樣本中不加任何添加劑（如穩(wěn)定劑）而 –80 ℃ 直接保存，其目的是為了排除在長期保存中添加劑可能產(chǎn)生毒性，以及對未來的實(shí)驗(yàn)可能產(chǎn)生的干擾。

在 H?ntzsch 等[13]進(jìn)行的研究中，研究對象是 Leipzig in the LIFE Heart substudy 的隊(duì)列研究，招募的是心肌梗死（AMI）患者。用 3 個(gè) PAXgene和 3 個(gè) Tempus 血液RNA 采集管，收集 LIFE study 中心的 12 個(gè) AMI 患者和35 個(gè)正常人，用 4 種手工法和 2 種半自動(dòng)法提取 RNA，然后再測定 RNA 的數(shù)量和質(zhì)量。

2 RNA 提取方法的結(jié)果匯總

在 Liu 等[12]的研究中，RNA 純度用 NanoDrop （Thermo Scientific，ND-8000）測定，RNA 濃度和完整性用 Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent Technologies，G2939A）及相關(guān)軟件計(jì)算，評估分離的 RNA 產(chǎn)量、純度和完整性（表 2），用于比較和驗(yàn)證 6 種不同 RNA 處理方法的效能[12]。

表 2 RNA 質(zhì)量控制結(jié)果（±s ）

表 2 RNA 質(zhì)量控制結(jié)果（±s ）

R N A 純度 R N A 完整性方案 預(yù)處理方法 R N A 提取方法 R N A 產(chǎn)量（μ g / m l ） A260/280 A260/230 R I N 值 2 8 S / 1 8 S A B u f f y c o a t -T R I z o l 方法 T R I z o l 試劑一步法 3 . 5 0 ± 0 . 3 2 1 . 9 9 ± 0 . 0 1 1 . 3 5 ± 0 . 1 6 8 . 2 0 ± 0 . 1 6 1 . 4 4 ± 0 . 0 7 B 全血-T R I z o l 方法 3 . 2 9 ± 0 . 3 0 1 . 9 9 ± 0 . 0 1 1 . 4 0 ± 0 . 1 2 8 . 0 1 ± 0 . 1 6 1 . 5 5 ± 0 . 0 7 C 全血-R N A l a t e r 方法 2 . 3 3 ± 0 . 3 3 1 . 9 5 ± 0 . 0 2 1 . 1 0 ± 0 . 1 6 8 . 0 1 ± 0 . 1 4 1 . 1 4 ± 0 . 0 5 D 全血-T R I z o l L S 方法 T R I z o l L S 試劑一步法 9 . 6 8 ± 0 . 7 9 1 . 9 5 ± 0 . 0 1 1 . 3 0 ± 0 . 0 6 7 . 7 5 ± 0 . 1 1 1 . 3 1 ± 0 . 1 9 E 冷凍法 1 4 . 2 9 ± 1 . 5 4 1 . 9 3 ± 0 . 0 1 1 . 2 6 ± 0 . 0 8 5 . 2 9 ± 0 . 4 4 0 . 7 5 ± 0 . 1 4 F P A X g e n e 全血 R N A t u b e P A X g e n e 全血 R N A 試劑盒 5 . 1 0 ± 0 . 7 0 2 . 0 5 ± 0 . 0 1 1 . 3 0 ± 0 . 1 6 7 . 7 6 ± 0 . 1 0 1 . 4 1 ± 0 . 1 0

在 Liu 等[12]進(jìn)行的研究中，用 6 種不同的處理方法分別提取 11 個(gè)樣品的 RNA，然后測定平均產(chǎn)量，結(jié)果見表 2。TRIzol LS 法、PAXgene 和冷凍法（–80 ℃）直接保存，這 3 種方法得到的 RNA 產(chǎn)量最高。A260/A280比值和A260/A230比值反映 RNA 的純度。一般來說，A260/A280比值1.8 ～ 2.0 和 A260/A230比值 ≥ 2 被認(rèn)為是高純度的樣本。6 種方法的 A260/A280比值之間無顯著差別，均能得到最適A260/A280比值。然而，所有方法的 A260/A230比值均低于1.5，這可能是由 TRIzol/TRIzol LS 試劑中高濃度的鹽/苯酚引起的。最后，用核糖體 28S/18S 比值和 RIN 值評估RNA 的完整性。最適 28S/18S 比值 1.0 ～ 2.0，如果比值大于 2.0 或小于 1.0，表明存在基因組 DNA 或 RNA 降解。在本文中，除了直接 –80 ℃ 保存的樣本 28S/18S 比值 ＜ 1.0，其余的 5 種方法均在范圍內(nèi)。除了 –80 ℃ 冷凍直接保存的樣本，其余方法得到的 RIN 值均大于 7.0。

在 Liu 等[12]的研究中，方案 A 從白膜層中分離 RNA可以獲得最高質(zhì)量的 RNA（高完整性和高純度），還能充分利用血液樣本；TRIzol LS pretreatment specimens（方案D）獲得最高產(chǎn)量 RNA（除了方案 E），質(zhì)量也較滿意，此方法簡化了樣本的前處理過程，但是全血樣本只能用于RNA 提?。挥?TRIzol（方案 B）從全血中分離 RNA，得到的 RNA 質(zhì)量較高，成本也低于 TRIzol LS，但是 RNA數(shù)量較低；PAXgene Blood RNA 試劑盒（方案 F）是在無法及時(shí)處理血液樣本時(shí)的良好選擇，此方法適用于室溫條件下短時(shí)間運(yùn)輸，但是僅用作 RNA 提取，成本較高；添加RNAlater 的全血樣本可以得到高質(zhì)量的 RNA，該法的潛在優(yōu)點(diǎn)尚待研究。

有資料顯示，RNA 可用于高要求的基因芯片分析（RIN ＞ 7.0），也能用于定量 PCR 和基因表達(dá)譜研究（RIN 4 ～ 7）。因此，上述研究中分離到的 RNA 符合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求。方案 A 中，首先分離血漿和白膜層，其得到的 RNA 的RIN 值最高（7.30 ～ 9.00），血漿還能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。方案 B、C、D、F 均得到高度完整的 RNA，只是方案 C 在處理過程中加了 RNAlater 用于穩(wěn)定 RNA，需要額外的步驟除去溶液中的 RNAlater，這些步驟可能會(huì)導(dǎo)致 RNA 流失，使得 RNA 的產(chǎn)量偏低（1.43 ～ 4.38）。在方案 D（TRIzol LS）和 E（–80 ℃ 直接保存）中，從全血中直接分離 RNA，可能包括游離的 RNA，因此其產(chǎn)量較高，后者得到的 RNA完整性較差（RIN 5.29）。

在 H?ntzsch 等[13]進(jìn)行的研究中，Norgen Kit I with Tempus Tubes 得到的 RNA 收益率最高，Norgen Kit II with PAXgene 最低。疾病狀態(tài)是 RNA 收益率的次要決定因素（LIFE-AMI 11.2 vs. LIFE 6.7 mg，P ＜ 0.001），首要決定因素是血液采集管。血液采集管和 RNA 分離試劑盒并不影響mRNA 表達(dá)，而是 RT/qPCR 試劑導(dǎo)致 mRNA 損耗，但是Norgen Kit II 除外。對于 miRNAs，某些基因的表達(dá)差異與采集管有關(guān)（miR30b），RNA 分離（Norgen Kit II）和 RT/qRT試劑（miR133a）有關(guān)。在 RNA 收益率方面，各種提取試劑盒顯著不同，它們影響 miRNA 的表達(dá)譜，但是不影響mRNA 的質(zhì)量。

3 討論與結(jié)語

RNA 提取以溶劑法為基礎(chǔ)，從各種樣本中快速、有效地提取 RNA。簡單而言，用亞硫氫胍及巰基乙醇制備組織勻漿，使內(nèi)源的 RNA 酶失活，N-月桂肌氨酸將核蛋白復(fù)合物變性，再用酸平衡的苯酚：氯仿：異戊醇抽提，使 RNA脫離 DNA 及蛋白質(zhì)，從混合液中層析到水相，最后用異丙醇沉淀濃縮 RNA。收益率受多個(gè)因素的影響，包括組織來源及細(xì)胞數(shù)量，可通過光吸收測定（A260）來定量 RNA 的濃度。

TRIzol 既是 RNA 的釋放劑，又是 RNA 的保護(hù)劑。在 TRIzol 中，RNA 是隔離在 RNA 酶污染之外的，對樣本的后續(xù)操作要求用無 RNA 酶的玻璃器皿。提取 RNA時(shí)須注意污染情況，以及盡量少用移液槍抽吸，以免破壞RNA 結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)過程要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免 RNA酶的污染，操作速度要快，因?yàn)樘崛∵^程中 RNA 會(huì)降解。實(shí)驗(yàn)全程佩戴一次性手套和口罩，手套需勤換。

RNA 可以從各種組織中提取出來[16]，不過各種組織的RNA 預(yù)期產(chǎn)量有差別。材料用量的上限不得超過 1 g，從少量樣本中提取 RNA 時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn) RNA 沉淀，糖原濃度不得過高（＜ 4 mg/ml），否則影響第一鏈的合成和 PCR 反應(yīng)。TRIzol 勻漿后加氯仿之前樣本可以在 –60 ～ –70 ℃ 保存至少 1 個(gè)月，RNA 沉淀在 75% 酒精中 2 ～ 8 ℃ 保存一星期以上或 –20 ℃ 一年以上[17]。提取的 RNA 立即用于逆轉(zhuǎn)錄，或保存于 –70 ℃ 超低溫冰箱中備用。

RNA 提取系統(tǒng)中各種試劑的作用：①變性劑如 N-月桂肌氨酸、巰基乙醇和亞硫氫胍，可變性細(xì)胞內(nèi)及核蛋白復(fù)合物，釋放 RNA，這些試劑還能有效抑制核酸酶。②苯酚/氯仿/異戊醇：酸平衡的苯酚/氯仿/異戊醇可抽提去除雜物，使 DNA 及蛋白質(zhì)沉淀到有機(jī)相，而 RNA 留在水相，用酸性的有機(jī)溶劑抽提可免去用氯化鋰選擇沉淀 RNA 的過程。③乙酸鈉：具有維持變性的細(xì)胞裂解液 pH 值以及沉淀 RNA 的作用。④異丙醇：沉淀濃縮水相中的 RNA。異硫氰酸胍被認(rèn)為是最有效的 RNA 酶抑制劑，它在裂解組織細(xì)胞的同時(shí)也使 RNA 酶失活，它既可破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對 RNA 酶有強(qiáng)烈的變性作用。就變性劑的選擇來說，CTAB（CTAB 法）比異硫氰酸胍（TRIzol 試劑法）和 SDS（改良熱硼酸法）更有效；就CTAB 法來說，由于以 CTAB 為變性劑，同時(shí)加入 PVP 和β-巰基乙醇共同作用變性蛋白、抑制 RNase 的活性，使用無水乙醇或異丙醇沉淀雜蛋白和總核酸等，然后再選擇性地分離 RNA。所以 CTAB 法不失為一種很好的 RNA 提取方法。

本文系統(tǒng)地闡述了各種 RNA 的提取方法，供批量RNA 提取時(shí)參考。同時(shí)，RNA 的質(zhì)量評估通常只關(guān)注產(chǎn)量、RIN 值、18S/28S、A260/280比值、A260/230比值等常規(guī)項(xiàng)目，由于生物樣本庫的樣本大多數(shù)是用于新項(xiàng)目研究，上述指標(biāo)合格也不能保證適用于所有的新項(xiàng)目分析，因此有些研究人員反對用生物標(biāo)志物來評估樣本的質(zhì)量[18-20]。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.017

200090 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院（上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院）科研管理部（章佳英、嵇承棟、萬悅竹、付強(qiáng)強(qiáng)）；200090 上海市五角場鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心（朱琳懿）

嵇承棟，Email：15800397667@163.com

2016-08-16