生物素標(biāo)記的甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)分辨不同組織DNA甲基化水平方法初探

王小怡，王博，王雪偉，高哲，郭大瑋

生物素標(biāo)記的甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)分辨不同組織DNA甲基化水平方法初探

王小怡，王博，王雪偉，高哲，郭大瑋

DNA 甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DNA 甲基化參與基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控[1]，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2-3]。DNA 甲基化在胚胎發(fā)育早期、個(gè)體生長發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，是當(dāng)前表觀遺傳研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[4-5]。分析基因組中甲基化水平能夠了解不同組織之間、正常與疾病狀態(tài)以及不同年齡引起的甲基化水平的差異。Frigola 等[6]通過擴(kuò)增甲基化間區(qū)位點(diǎn)（amplification of intermethylated sites，AMIS）分析了結(jié)腸癌組織與癌旁組織基因組中 CCCGGG位點(diǎn)的甲基化水平。該法通過 [α-33P]dATP 進(jìn)行放射自顯影，對機(jī)體有很大的損害。有文獻(xiàn)報(bào)道可以用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[7]，因此本研究嘗試用生物素標(biāo)記引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增代替放射性核素法分析基因組 DNA 甲基化水平（圖 1）。

圖 1 生物素標(biāo)記引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增分析基因組 DNA 甲基化水平原理示意圖（雙線代表基因組 DNA）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級 SD 大鼠 9 只，標(biāo)記為 1 ～9 號，雄性，體重 180 ～ 200 g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證編號：SCXK-(軍)2012-0004），飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶 Rsa I 和 CviQ I、T4 連接酶均購自美國 NEB 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaq 聚合酶購自日本 Takara 公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TC-96/G/H(b)B 型基因梯度擴(kuò)增儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 9 只大鼠隨機(jī)分為兩組，1 ～ 4 號正常飼養(yǎng)；5 ～ 9 號腦部局部雙側(cè)給予 2 nmol/L 的 δ-阿片受體激動(dòng)劑 1 μl。一周后處死大鼠，取心、腦、肝、肺、腎、脾、胰組織，置于–80 ℃ 備用。

圖 2 5 號大鼠心、腦、肝組織以不同引物擴(kuò)增時(shí)甲基化圖譜

1.2.2 大鼠組織基因組 DNA 提取 酚氯仿法提取大鼠組織的基因組 DNA（100 ng/μl），A260/280在 1.8 ～ 1.9。

1.2.3 甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增 10 U 的甲基化敏感性內(nèi)切酶 Rsa I 消化 1 μg 基因組 DNA，37 ℃ 過夜酶切，留下鈍性末端（GT/AC）；酶切產(chǎn)物用 10 U 甲基化非敏感性內(nèi)切酶 CviQ I 消化，25 ℃ 過夜酶切，留下粘性末端（G/TAC）。特異接頭準(zhǔn)備：100 μmol/L MCA-V（5' TATCAG AGCTTTGCGAAT 3'）和 100 μmol/L Blue（5' ATTCGCAAA GCTCTGA 3'）等體積混合置于 95 ℃ 10 min，室溫約 2 h退火；1 nmol的接頭與 1 μg 雙酶切的產(chǎn)物在 T4 連接酶的作用下連接。PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化連接產(chǎn)物。

1.2.4 生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增兩端連接特異接頭的 DNA序列 用 5'-Bio-Blue-TAC 末端加 4 ～ 6 個(gè)隨機(jī)核苷酸的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，引物序列為 5'-Bio-Blue-TAC-CTGT-3，5'-Bio-Blue-TAC-CTGTG-3'，5'-Bio-Blue-TAC-CTGTGC-3'。擴(kuò)增體系：30 ng 連接產(chǎn)物，4 μmol/L 生物素標(biāo)記的引物，1 U rTaq，2 μl dNTP，2.5 μl 10 × PCR buffer，滅菌水補(bǔ)足25 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR 產(chǎn)物稀釋 5 倍，3 μl稀釋后產(chǎn)物與 12 μl 的變性上樣緩沖液 DLB（95% 甲酰胺、20 mol/L EDTA、0.09% 溴酚藍(lán)、0.09% 二甲苯青）混勻后 95 ℃ 變性 10 min，置于 –20 ℃ 備用。變性后樣品上樣 5 μl，8 mol/L 尿素、6% 的聚丙烯酰胺凝膠 200 V 恒壓電泳 2 h。使用半干轉(zhuǎn)印儀，以 0.5 × TBE 為轉(zhuǎn)膜液，將凝膠上的 DNA 轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，電壓保持在 6 ～ 11 V 的條件下恒流轉(zhuǎn)膜 45 min。按化學(xué)發(fā)光 EMSA 試劑盒使用說明書進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 引物的選擇以及同一只大鼠不同組織之間甲基化水平的比較

3' 末端隨機(jī)核苷酸數(shù)目的增加能夠減少擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目，使甲基化圖譜條帶清晰且容易分析。條帶灰度值越高說明甲基化水平越高。5 號大鼠的心、腦、肝組織分別以3' 末端增加 4、5、6 個(gè)核苷酸為引物擴(kuò)增得到的甲基化圖譜，隨著末端核苷酸數(shù)的增加，條帶數(shù)目逐漸減少（圖 2）。選擇 3' 末端增加 4 個(gè)堿基（即 Bio-Blue-TAC-CTGT）為引物來分析大鼠組織的甲基圖譜，表明同一個(gè)引物同一只大鼠的不同組織的甲基化圖譜有明顯差異。

2.2 不同大鼠腦組織甲基化水平圖譜基本一致

1 ～ 4 號大鼠的腦組織甲基化圖譜基本一致。5 號大鼠經(jīng)過局部腦阿片受體激動(dòng)劑處理，其腦組織甲基化水平圖譜與 1 ～ 4 號大鼠腦組織有較大差異（圖 3）。

圖 3 不同大鼠組織甲基化圖譜

圖 4 DNA 片段長度范圍分析

2.3 甲基化位點(diǎn)之間 DNA 片段長度范圍分析

采用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的 H19 基因的引物，共用的上游引物 5' 端進(jìn)行生物素標(biāo)記，選擇 5 個(gè)不同的下游引物擴(kuò)增后產(chǎn)物等比例混合制成標(biāo)準(zhǔn)品，電泳時(shí)和樣品一起上樣。由圖 4 可知電泳條帶在 200 ～ 1200 bp。

3 討論

用 AMIS 方法對基因組范圍內(nèi)的甲基化水平進(jìn)行檢測首先由 Frigola 等于 2002 年提出。實(shí)驗(yàn)中作者采用SmaI/PspA1（CCCGGG）這對內(nèi)切酶及接頭 DNA 巧妙地分離了甲基化與非甲基化狀態(tài)的胞嘧啶。由于在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，因此，與預(yù)設(shè)甲基化位置的基因芯片檢測方法相比，檢測范圍更加寬泛，例如：Illumina 推出的 Infinium Methylation EPIC BeadChip 一次可以檢測超過 850 000 個(gè)甲基化位點(diǎn)[8]，但這些甲基化位點(diǎn)傾向于與已注釋的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，不免有檢測局限性；根據(jù) Fazzari 和 Greally[9]對人類基因組計(jì)劃的資料分析表明，甲基化敏感酶 Hpa II的識別位點(diǎn)分布于人類已注釋的 CpG 島區(qū)域，約占總切點(diǎn)的 12%，其余大部分切點(diǎn)分布于其他未知的區(qū)域；Xu 等[10]在人類長片段重復(fù)序列檢出了可能作為分辨同卵雙生子DNA 甲基化位點(diǎn)，這些說明立足于整個(gè)基因組范圍內(nèi)檢測DNA 甲基化的 AMIS 方法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

另一方面，由于 AMIS 檢測所涉及的片段較多，用普通顯色方法靈敏度不夠，因此，F(xiàn)rigola 等[6]采用了放射性檢測方法 。本文用生物素標(biāo)記的引物檢測出了不同臟器的不同 DNA 甲基化水平。據(jù) Frigola 的報(bào)道，同位素方法的檢測靈敏度為 1/16，我們在實(shí)驗(yàn)過程中將樣品稀釋到 1/10仍能檢測到甲基化條帶。

與放射性同位素標(biāo)記相比，生物素標(biāo)記的引物 AMIS操作安全、簡單，適用于多個(gè)樣本，并能達(dá)到檢測出不同臟器的不同 DNA 甲基化水平的目的。該方法的靈敏度較高，少量的產(chǎn)物即可得到清晰的基因組 DNA 甲基化水平圖譜。因此，我們認(rèn)為雖然非放射性 AMIS 的檢測靈敏度低于放射性標(biāo)記，但 1 μg 的 DNA 模板用生物素標(biāo)記的AMIS 法已然能夠檢出足夠條帶，從而滿足多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求。如此可以避免放射性核素的使用。

本文通過非放射性 AMIS 替代放射性方法，得到了較為清晰的酶切位點(diǎn)基因組 DNA 甲基化水平圖譜。同一只大鼠的不同組織甲基化水平有明顯差異，而不同大鼠同一個(gè)組織的甲基化水平基本一致。唐韶青等[11]用 MSAP 技術(shù)對豬、牛、羊、小鼠、雞和鴨的基因組 DNA 甲基化水平檢測，發(fā)現(xiàn)同一動(dòng)物的不同組織基因組 DNA 甲基化水平有差異。另有文獻(xiàn)報(bào)道，人的不同組織之間甲基化水平也是有差異的[12-13]，這與本研究結(jié)果一致。

本文中采用 Rsa I/CviQ I（GTAC）內(nèi)切酶對進(jìn)行檢測，觀察了基因組中非 CpG 二核苷酸處的甲基化修飾情況。與Frigola 等所用的 6 核苷酸內(nèi)切酶相比，我們采用的識別4 核苷酸的內(nèi)切酶理論上可能檢出更多的甲基化位置，采用3 端增加 4 ～ 6 個(gè)堿基的引物擴(kuò)增，仍然能夠得到較多的條帶，更適用于兩個(gè)樣本間甲基化差異較少的檢材。此外，4 核苷酸內(nèi)切酶分析甲基化水平得到的甲基化間區(qū)的 DNA 范圍 200 ～ 1200 bp，較 Frigola 等所用的 6 核苷酸內(nèi)切酶得到的范圍窄，這是因?yàn)?4 核苷酸比 6 核苷酸出現(xiàn)的頻率高。

該方法的使用也存在一些局限性。圖 3 中 1 ～ 4 腦組織是鼠齡、體重情況一致的大鼠，其甲基化水平基本一致。若在腦局部給阿片受體激動(dòng)劑（5 號大鼠），則其腦組織甲基化圖譜與 1 ～ 4 鼠腦組織有明顯不同，慢性使用阿片導(dǎo)致腦組織的 DNA 甲基化水平發(fā)生改變已有報(bào)道[14]，本實(shí)驗(yàn)也觀察到經(jīng)上述處理的鼠甲基化水平圖譜異于未處理鼠?？梢娝幬锏葧绊憘€(gè)體基因組甲基化格局的改變。此外，基因組水平 DNA 甲基化與年齡、疾病等亦有著密切的關(guān)系[15-17]。上述問題在使用該方法鑒別不同組織時(shí)應(yīng)加以考慮。此外，由于該方法基于內(nèi)切酶酶切，因此對 DNA 質(zhì)量要求較高，對于 DNA 降解的樣本則無法進(jìn)行檢測。脾臟 DNA 提取后瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn) DNA 降解嚴(yán)重，這可能是導(dǎo)致圖 4 四個(gè)脾組織之間的甲基化格局不同的原因。因而，使用該方法應(yīng)注意 DNA 提取質(zhì)量，避免 DNA降解；同時(shí)，比較樣品間的 DNA 甲基化差異應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)條件的齊同。

本次研究初步探索了用生物素標(biāo)記的 AMIS 法替代放射性 AMIS 法進(jìn)行大鼠腦組織甲基化水平檢測的可能性。后續(xù)我們期待用該方法探索其他組織的甲基化圖譜，找出各種組織之間基因組 DNA 的甲基化差異，以期用甲基化水平來區(qū)分不同組織。

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國家發(fā)改委、科技部印發(fā)高級別生物安全實(shí)驗(yàn)室體系建設(shè)規(guī)劃（2016 – 2025年）

按照國務(wù)院《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》等有關(guān)要求，國家發(fā)展和改革委員會會同有關(guān)部委聯(lián)合編制了《高級別生物安全實(shí)驗(yàn)室體系建設(shè)規(guī)劃（2016 – 2025 年）》。

詳情請登錄國家發(fā)展和改革委員會網(wǎng)站 http://www.ndrc.gov.cn/zcfb/zcfbtz/201612/t20161220_830455.html 查閱。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.016

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院

郭大瑋，Email：guo8dawei@aliyun.com

2016-09-20