腦梗死患者血清補體測定及其意義

張洪欣，張國軍，康熙雄

·技術(shù)與方法·

腦梗死患者血清補體測定及其意義

張洪欣，張國軍，康熙雄

腦梗死是腦血管病變（動脈粥樣硬化或栓塞）所致缺血性卒中，具體的發(fā)病機制尚不明確[1]。有研究表明，補體系統(tǒng)激活是造成缺血性再灌注損傷的主要原因[2]。補體通過3 條途徑激活，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露糖結(jié)合凝集素途徑。以往的大量動物實驗已經(jīng)表明，在梗死區(qū)域有大量補體成分的沉積，本實驗通過檢測經(jīng)典途徑標(biāo)志物 C1q、經(jīng)典和凝集素共同標(biāo)志物 C4d 以及終末產(chǎn)物 SC5b-9 在腦梗死患者血清中的含量及其變化，探討補體系統(tǒng)激活在腦梗死患者病情進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取 2015年6月–2016 年3月在本院神經(jīng)內(nèi)科治療的腦梗死初發(fā)病例 52 例，記為初發(fā)病例組，患者入選條件：①診斷均符合 1995 年第 4 屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均為初次發(fā)病，且經(jīng)頭顱 CT 或MRI 證實為腦梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病前有腦血管病病史；②發(fā)病前 2 周內(nèi)有感染性疾病；③患有惡性腫瘤、血液病、風(fēng)濕免疫疾病、急性感染、嚴(yán)重肝腎功能不全或嚴(yán)重營養(yǎng)不良。同時選取頸動脈粥樣硬化斑塊患者 32 例（記作斑塊組）做陽性對照，本院體檢中心 32 例作正常對照，排除感染、高血壓、糖尿病、高血脂及心肝腎等疾病。另選取腦血管病中心收住院腦梗死患者 15 例（記作動態(tài)監(jiān)測組）及正常人5 例做正常對照，所有患者及正常人均符合以上入選標(biāo)準(zhǔn)。所有患者入院前未進行抗凝及抗血小板聚集藥物治療。

1.2 主要材料

補體 C1q 購自奧巴林（北京）生物科技有限公司，試劑盒批號為 20121217，稀釋倍數(shù)為 5；補體 C3、C4 購自德國 Siemens 公司，試劑盒批號為 153317A，稀釋倍數(shù)為20；補體 C4d、SC5b-9 購自上海邦奕生物科技有限公司，試劑盒批號為 201605、201604，稀釋倍數(shù)為 5。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料 收集整理腦梗死患者、頸動脈粥樣硬化斑塊組的患者及正常對照者的一般資料（如年齡、性別等）及生化指標(biāo)如葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、同型半胱氨酸（腦梗死患者的多重危險因素）及總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮（肝腎功能）等。

1.3.2 血清標(biāo)本采集 初發(fā)病例組在確診當(dāng)時留取靜脈血7 ml，斑塊組及正常對照組均于早晨空腹采肘靜脈血 7 ml。動態(tài)監(jiān)測組分別在發(fā)病的 6 h、12 h、24 h、36 h、3 d、5 d、7 d 留取靜脈血 7 ml。采血后迅速于 4 ℃，3500 r /min 離心 10 min，取上清凍存于 –80 ℃ 冰箱備用。

1.3.3 血清中補體的檢測 在 37 ℃ 迅速解凍標(biāo)本，凍融標(biāo)本立即冰上轉(zhuǎn)移，以阻止稀釋前補體活化。采用免疫透射比濁法測定補體 C1q、散射比濁法測定補體 C3、C4，雙抗體夾心 ELISA 測定補體 C4d、SC5b-9。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般資料和臨床數(shù)據(jù)分析

3 組研究對象之間年齡分布無明顯差異，而性別分布有所不同，腦梗死患者男性明顯多于女性，考慮與男性患者存在吸煙、飲酒等加速血管病變的危險因素相關(guān)。其余肝腎功能相關(guān)指標(biāo)則無明顯差異（表 1）。

2.2 血清補體因子水平

檢測血清中各補體因子水平，乘以各稀釋倍數(shù)得到最終結(jié)果（表 2）。補體 C1q、C3、C4d、SC5b-9 的水平在 3 組之間比較有明顯差異（P ＜ 0.05）。其中經(jīng)典激活途徑產(chǎn)物C1q、經(jīng)典及凝集素途徑共同產(chǎn)物 C4d、終末產(chǎn)物 SC5b-9在初發(fā)病例組和正常組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），C1q、C3、C4d 在斑塊組和正常組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。而經(jīng)典及凝集素途徑共同產(chǎn)物 C4、終末產(chǎn)物SC5b-9 在初發(fā)病例組和斑塊組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)典途徑及凝集素途徑的共同標(biāo)志物 C4d 三組間兩兩比較均有顯著差異（P ＜ 0.05），初發(fā)病例組和斑塊組水平均高于正常組；經(jīng)典激活途徑產(chǎn)物 C1q 水平在三組之間依次升高，但正常組和斑塊組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）；終末產(chǎn)物 SC5b-9 水平在正常組、斑塊組和初發(fā)病例組之間依次增高，但斑塊組和正常組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）。

表1 3 組實驗對象的一般資料及臨床病理數(shù)據(jù)資料

表2 3 組間補體因子的濃度及統(tǒng)計學(xué)差異

表3 初發(fā)病例組補體因子與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 補體因子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性及補體間相關(guān)性分析

分析初發(fā)病例組血清補體因子水平與危險因素指標(biāo)如葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、同型半胱氨酸等的相關(guān)性，結(jié)果見表 3。補體 C4 與葡萄糖呈明顯正相關(guān)（r = 0.321，P = 0.020），其余補體分子與臨床指標(biāo)無明顯的相關(guān)性。而補體之間的相關(guān)性分析表明，C1q、C4d 水平與 SC5b-9 水平呈明顯正相關(guān)（r = 0.439，P = 0.001；r = 0.316，P = 0.023）（表 4）。

表4 血液補體因子之間的相關(guān)性

2.4 部分補體因子水平的變化趨勢

動態(tài)監(jiān)測組患者發(fā)病 6 h 血清中 C1q、C4d 的水平與正常組相比無明顯差異，12 h 開始增長，24 h 時達到最高，到第 7 天降至正常水平；而終末產(chǎn)物 SC5b-9 的水平有所差異，在發(fā)病 6 ～ 72 h 呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，第 5 天達到最高，第 7 天下降至正常水平（表 5）。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明炎癥在卒中（尤其是缺血性卒中）的發(fā)病機制中起重要作用[3-4]。而補體作為炎癥反應(yīng)的主要組成部分，在腦梗死中的作用日益引起重視。大量的動物實驗表明，卒中后的腦組織中有各種補體級聯(lián)成分的沉積[5-6]。而補體系統(tǒng)的過度活化是造成腦內(nèi)炎癥損傷的重要因素[7-8]。以往的研究認(rèn)為，大動脈粥樣硬化性及隱源性腦卒中患者急性期血漿補體 C3 水平持續(xù)升高[9]，本實驗在此基礎(chǔ)上選取不同激活途徑的補體分子來更好地闡明補體激活在腦梗死中所起的作用。

表 5 動態(tài)監(jiān)測組與正常組血清中補體含量比較（±s ）

表 5 動態(tài)監(jiān)測組與正常組血清中補體含量比較（±s ）

C 1 q C 4 d S C 5 b -9動態(tài)監(jiān)測組6 h 1 7 1 . 1 6 ± 1 2 . 6 5 1 7 . 9 4 ± 2 . 8 1 3 3 6 . 5 0 ± 4 8 . 5 8 1 2 h 2 0 0 . 4 0 ± 2 2 . 4 6 2 3 . 4 0 ± 4 . 1 6 3 4 8 . 3 6 ± 5 3 . 9 0 2 4 h 2 5 6 . 5 3 ± 2 7 . 9 1 2 8 . 9 8 ± 4 . 6 1 3 5 5 . 5 6 ± 5 8 . 2 2 3 6 h 2 2 7 . 7 8 ± 2 3 . 0 1 2 5 . 6 0 ± 4 . 7 1 3 6 7 . 6 5 ± 6 0 . 5 5 7 2 h 2 0 1 . 4 0 ± 1 1 . 4 2 2 3 . 3 8 ± 3 . 9 7 3 8 0 . 1 9 ± 6 5 . 4 6 5 d 1 8 4 . 3 7 ± 1 0 . 7 8 2 1 . 0 2 ± 3 . 2 3 4 2 1 . 6 2 ± 7 3 . 6 9 7 d 1 7 1 . 6 3 ± 9 . 0 0 1 8 . 7 2 ± 2 . 2 2 3 8 5 . 2 8 ± 6 6 . 1 8正常組 1 6 4 . 7 9 ± 2 2 . 3 5 1 5 . 5 9 ± 2 . 0 5 3 3 0 . 8 9 ± 4 7 . 8 2 P ＜ 0 . 0 5 ＜ 0 . 0 0 1 ＜ 0 . 0 0 1

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血清中補體 C1q、C4d、SC5b-9 的含量較斑塊組和正常組升高，且斑塊組高于正常組，說明補體激活發(fā)生在腦梗死的早期，即斑塊形成時。隨著病情進展，活化程度逐漸增強。而 SC5b-9 作為補體活化的終末產(chǎn)物，其含量的升高則預(yù)示著補體級聯(lián)反應(yīng)的完全活化。

經(jīng)典激活途徑由補體 C1 沉積于靶細胞表面而發(fā)起。C1 是由 C1q、C1r 和 C1s 組成的三蛋白復(fù)合物。C1q 作為其中最大的蛋白，除了參與 C3-轉(zhuǎn)化酶的形成，還有其自身的特異性受體和細胞功能，即 C1q 的細胞沉積可通過補體級聯(lián)依賴與獨立機制導(dǎo)致組織損傷[10]。Rossen 等[11]證實細胞完整性的丟失導(dǎo)致大量的亞細胞成分暴露于細胞外環(huán)境，吸引 C1q，導(dǎo)致下游補體效應(yīng)分子的激活。Mack 等[12]證實，C1q 在腦缺血發(fā)生后 3 ～ 6 h 之間開始在小鼠腦中沉積。我們的結(jié)果顯示，血清補體 C1q 在 6 h 開始上升，在24 h 達到峰值，然后逐漸降低到正常水平，因此可以看出腦組織和血液中補體的沉積時間有所差異，這可能是由于各種腦細胞，包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，可以產(chǎn)生補體成分[13]。

補體 C3 和 C4 是急性期蛋白，是免疫系統(tǒng)的補體通路的重要組成成分[14-15]。C3 的活化在局灶性腦缺血性卒中的補體相關(guān)炎性損傷中起關(guān)鍵作用[16]。在缺血性卒中中，補體的激活主要由 C3 途徑發(fā)起，因為替代途徑用于放大由經(jīng)典和（或）凝集素途徑引發(fā)的補體激活，從而導(dǎo)致組織損傷[17]。而我們的結(jié)果顯示，腦梗死患者血清中補體 C3 和C4 的水平與斑塊組和正常組無明顯差異，這可能是因為入組的患者已進入亞急性期或慢性期，很多急性期蛋白已經(jīng)消耗殆盡。

補體 C4d 是補體 C4 的裂解片段，僅存在于補體激活的經(jīng)典途徑和凝集素途徑中，能與周圍的內(nèi)皮細胞共價結(jié)合，是比較穩(wěn)定的組分，可結(jié)合于血小板的表面，影響血小板的聚集及血小板與循環(huán)的白細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用[18]，可以促進黏附分子如 E-選擇素和 P-選擇素的上調(diào)，從而促進內(nèi)皮細胞的激活[19-20]。趙軍等[21]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注 6 h 組開始檢測到 C4d，24 h 組最高，再灌注 48 h 組 C4d 的沉積明顯減少。與我們的血清中補體含量的變化趨勢基本吻合，證實了腦梗死中補體經(jīng)典途徑和凝集素途徑的參與。

作為補體激活途徑的最終產(chǎn)物，SC5b-9 可沉積于細胞膜，使細胞分泌 P-選擇素、血小板活化因子等引起細胞水腫，破壞血腦屏障，同時激活單核細胞，釋放氧自由基等毒性物質(zhì)，加劇炎癥反應(yīng)，或者直接插入細胞中，導(dǎo)致細胞溶解死亡。以往的研究顯示，在發(fā)病 1 d 以內(nèi) SC5b-9 并沒有顯著升高，48 h 以后才出現(xiàn)顯著升高，一直持續(xù)到 10 d以后[22]。而我們的結(jié)果顯示，其在發(fā)病 6 ～ 72 h 呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，第 5 天達到最高，第 7 天下降至正常水平。這表明個體間補體激活程度的差異，考慮與患者入院后藥物的使用及患者自身免疫系統(tǒng)的差異相關(guān)。

補體因子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，補體激活與臨床指標(biāo)無明顯的相關(guān)性，這可能歸因于腦梗死的各種危險因素如高血糖、高血脂等多種因素的共同作用而導(dǎo)致血管病變，而補體的激活進一步加重血管病變，從而促使腦梗死的發(fā)生。

本研究證實了腦梗死患者中補體系統(tǒng)的活化，補體系統(tǒng)在缺血性腦損傷中起關(guān)鍵作用。補體的經(jīng)典途徑和凝集素途徑參與了腦梗死的病情進展，然而替代途徑是否參與腦梗死的發(fā)生，尚需擴大樣本進一步證實。針對補體激活的干預(yù)將為腦梗死的治療提供更加廣闊的前景。

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國家干細胞臨床研究專家委員會第三次會議在京召開

按照 2016 年 12 月 15 日國家干細胞臨床研究專家委員會（以下簡稱專家委員會）第二次會議精神，我會作為專家委員會秘書處根據(jù)專家委員會的審核意見通知各申報機構(gòu)，建議其修改、補充、完善備案材料，并對補充后的備案材料進行了形式復(fù)審。

2017 年1 月9 日專家委員會主任委員曹雪濤院士在北京主持召開了專家委員會第三次會議，19 位專家委員會成員出席了本次會議。本次會議對干細胞臨床研究項目補充后的備案材料進行了復(fù)審。

國家衛(wèi)生計生委科教司張黎明副巡視員出席會議并講話，國家衛(wèi)生計生委科教司王錦倩處長，國家食藥監(jiān)總局藥化注冊司常衛(wèi)紅處長，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會吳朝暉秘書長出席會議。

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會第五屆第三次理事會順利召開

按照協(xié)會章程和民政部的有關(guān)規(guī)定，為了總結(jié)協(xié)會 2016 年工作，做好 2017 年的工作安排，協(xié)會第五屆第三次理事會于 2016 年12 月24 日在杭州召開，會議由李少麗副理事長主持。會議審議通過了協(xié)會2016 年工作報告和財務(wù)報告、中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會 3D 打印技術(shù)分會設(shè)立申請、協(xié)會行業(yè)信用評價工作方案、協(xié)會團體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法（試行）和標(biāo)準(zhǔn)工作專家委員會管理辦法（試行）；審定通過了新申請入會 44 家單位名單，同意增補貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司為常務(wù)理事單位，同意增補北昊干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究院有限公司等 7 家為理事單位。會議還聽取了到會理事對協(xié)會工作的意見和建議。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.015

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2011AA02A103）

100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院/北京市免疫試劑臨床工程技術(shù)研究中心

康熙雄，Email：kangxx@vip.sina.com

2016-10-21