長鏈非編碼RNA CCAT1對人宮頸癌XB1702細胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響

高金蘋，張紹菊，羅志紅，李津

長鏈非編碼RNA CCAT1對人宮頸癌XB1702細胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響

高金蘋，張紹菊，羅志紅，李津

目的探討長鏈非編碼 RNA（lncRNA）結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1（CCAT1）對宮頸癌 XB1702 細胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響。

方法通過電穿孔法分別將 CCAT1 siRNA 和重組表達載體 pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染人宮頸癌 XB1702 細胞后，G418 篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，實驗分為 3 組：CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組和空白對照組。轉(zhuǎn)染 48 h 后，RT-PCR 檢測細胞中 CCAT1 lncRNA 表達水平；CCK8 檢測細胞增殖，TUNEL 法檢測細胞凋亡影響；裸鼠移植瘤實驗檢測上調(diào)和下調(diào) RNA CCAT1 表達聯(lián)合 X射線照射對宮頸癌的生長抑制作用。

結(jié)果干擾 XB1702 細胞中 CCAT1 lncRNA 表達后，XB1702 細胞增殖被抑制，細胞凋亡率增加；裸鼠移植瘤平均體積明顯小于對照組（正常 XB1702 細胞種植組）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；上調(diào) XB1702 細胞中 CCAT1 lncRNA 表達后，XB1702 細胞增殖能力明顯增強，細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而上調(diào)組裸鼠皮下種植瘤平均體積較照射前無明顯變化。

結(jié)論下調(diào) CCAT1 mRNA 表達能抑制人宮頸癌 XB1702細胞裸鼠移植瘤的生長，增強瘤體的放射敏感性。

宮頸腫瘤； 腫瘤移植； 小鼠，裸； XB1702細胞； 長鏈非編碼 RNA

宮頸癌是一種嚴重威脅女性生殖健康的疾病，全世界每年有近 13 萬女性被確診為宮頸癌患者[1-3]。臨床上宮頸癌患者由于術(shù)后存在高危因素或局部腫瘤過大常需要進行放療，增強宮頸癌細胞的放射敏感性尤為重要[4-6]。長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是近年來研究的一大熱點。研究表明，結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1（CCAT1）在結(jié)腸癌組織中表達異常[7-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡健康 BALB/c 裸鼠36只，體重 100 ～ 120 g，均為雄性，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。室溫 25 ℃，濕度 50% ～80%，SPF 環(huán)境下自由飲水和采食。

1.1.2 儀器和試劑 DMEM 完全培養(yǎng)基中包含2 mmol/L L-谷氨酞胺、10% FBS、1 mmol/L 丙酮酸鈉、100 mg/ml 青霉素鏈霉素二抗；BCA 蛋白濃度測試試劑盒（增強型）、5 × SDS 蛋白上樣緩沖液、20 × TBS 緩沖液等購自南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶購自美國 Sigma 公司；PBS 磷酸緩沖液購自美國 Hyclone 公司；細胞培養(yǎng)箱購自德國HeraesSepatech 公司；Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓胺纸M 將凍存的宮頸癌XB1702 細胞置于 60 ℃ 恒溫水浴箱，30 s 內(nèi)進行細胞的快速復(fù)蘇。細胞液融化后迅疾轉(zhuǎn)入 EP 管并加入 DMEM 培養(yǎng)基，重復(fù)小心吹打細胞使其均勻分布，隨后離心棄上清液。將復(fù)蘇后的細胞用LG-DMEM 完全培養(yǎng)基調(diào)整為 1 × 106個/ml 的密度進行培養(yǎng)。

將培養(yǎng) 24 h 的細胞取出，分為 3 組，分別為CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組和空白對照組。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 CCAT1 siRNA 和重組真核表達載體 pcDNA3.1-CCAT1 分別由上海生工生物工程有限公司合成。用 HeBS 液[140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、0.75 mmol/L Na2HPO4、6 mmol/L 葡萄糖、25 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸]重懸計數(shù)；調(diào)整細胞密度約為 5 ×106個/ml，每次取 200 μl細胞懸液加入電擊杯，分別向三個處理組加入 4 μg CCAT1 siRNA、生理鹽水、pcDNA3.1-CCAT1，電擊后室溫靜置 2 min，然后分別加入培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。G418 篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系后，將其擴大培養(yǎng)。

隨機選取首都醫(yī)科大學(xué)2013級臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等專業(yè)60名學(xué)生作為研究對象，將60名學(xué)生分為10個小組，每組5～7人。

1.2.3 RT-PCR 檢測 CCAT1 lncRNA 表達 轉(zhuǎn)染48 h后，取出細胞，離心棄上清收集細胞?；蛳鄬Ρ磉_水平采用 RT-PCR 進行測定。通過 Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，CCAT1 引物序列上游：5' CCAATTGAACCGAGCCTTGT 3'；下游：5' TCGT GAGCGTTTTCGCAATG 3'，目的片段長度 298 bp。參照物 GAPDH 引物序列上游：5' TCCTCTGACT TCAACAGCGACAC 3'；下游5' TCTCTCTTCCTCT TGTGCTCTTGC 3'，片段長度為 176 bp。反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳并成像儀攝片，用 Image proplus6.0圖像分析軟件測算電泳條帶的 OD 值，進而計算其相對表達量。

1.2.4 CCK8 檢測細胞的增殖能力 人宮頸癌XB1702 細胞經(jīng)過 CCAT1 siRNA 和重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，CCK8 法測定培養(yǎng) 48 h 后細胞的增殖活化能力。具體方法為轉(zhuǎn)染 48 h 之后，將3 組細胞分別收集接種到 96 孔細胞培養(yǎng)板上，每組 3 個重復(fù)；細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，向各孔中分別加入 20 μl CCK8 稀釋液，振蕩細胞板后繼續(xù)培養(yǎng) 1 h，用酶標儀在 490 nm波長下測定吸光度（OD）。

1.2.5 TUNEL 法檢測細胞凋亡影響 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 后，輕輕吹打細胞，使之均勻分布。PBS 磷酸緩沖液洗滌，洗滌后滴加原位末端標記反應(yīng)混合液 50 μl，在濕盒中 37 ℃ 孵育 1 h，滴加 POD2轉(zhuǎn)化液 50 μl，濕盒 37 ℃ 孵育 30 min，pH 7.4 的磷酸緩沖液沖洗 3 次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，HE 復(fù)染，顯微鏡下分析圖像。棕黃色細胞核的細胞為凋亡細胞，計數(shù)凋亡細胞和總細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。

1.2.6 檢測 RNA CCAT1 表達聯(lián)合 X 射線照射對宮頸癌的生長抑制作用 選取 36 只裸鼠隨機平均分三組，CCAT1 基因沉默組、CCAT1 重組表達載體轉(zhuǎn)染組和空白對照組。分別取轉(zhuǎn)染培養(yǎng) 48 h后的各組細胞胰酶消化重懸，將之分別接種于相應(yīng)組裸鼠右腋皮下 0.5 cm 處。裸鼠在無菌、通風(fēng)、潔凈的 SPF 級動物房中飼養(yǎng)，接種后 1 周左右，在裸鼠的接種區(qū)出現(xiàn)米粒大小的移植瘤。各組分別挑取 4 只裸鼠處死并分離腫瘤組織后，計算放射前腫瘤瘤塊體積。其余各組裸鼠麻醉處理，將之固定于解剖板上，進行放療處理。放療處理后第 40 天進行放療后腫瘤瘤塊體積的計算和統(tǒng)計。該實驗重復(fù)進行 3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗使用生物統(tǒng)計學(xué)軟件 SPSS16.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，細胞實驗至少重復(fù) 3 次，所有數(shù)據(jù)以?±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，移植瘤體積數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用重復(fù)測量方差分析，并作多重比較，以 P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCAT1 lncRNA 的表達

圖 1 為 CCAT1 基因修飾轉(zhuǎn)染后宮頸癌XB1702 細胞中 CCAT1 基因相對表達水平。與空白對照組相比，CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組顯著降低了宮頸癌 XB1702 細胞中該基因 mRNA 相對表達水平（P < 0.05），而 CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染明顯提高了宮頸癌細胞中 CCAT1 基因的相對表達水平（P < 0.05）（圖 1B），提示基因轉(zhuǎn)染成功。

2.2 細胞的增殖能力

如圖 2 所示，pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組的XB1702 細胞增殖活性顯著高于空白對照組和基因沉默組（P < 0.05），與對照組和 pcDNA3.1-CCAT1轉(zhuǎn)染組相比，CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力明顯降低（P < 0.05）。與對照組相比較，基因沉默組和基因重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞的增殖活性分別降低和提高了 36% 和 19%。

2.3 細胞凋亡

對照組、基因沉默組和基因重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，宮頸癌 XB1702 細胞凋亡率分別為 8.6%、15.4% 和 5.3%。其中基因沉默組最高，顯著高于其他兩組；與空白對照組相比，pcDNA3.1-CCAT1轉(zhuǎn)染組的宮頸癌 XB1702 細胞凋亡率顯著降低（P < 0.05）（圖 3）。

圖 1 CCAT1 基因修飾轉(zhuǎn)染后宮頸癌 XB1702 細胞中 CCAT1 基因相對表達水平（A：各組 CCAT1 lncRNA 的電泳圖；B：各組 CCAT1 lncRNA 的表達水平）Figure 1 Relative expression of CCAT1 gene in cervical cancer XB1702 cells transfected with CCAT1 gene (A: Electrophoregram of each group of CCAT1 lncRNA; B: Expression level of CCATl lncRNA in each group)

圖 2 CCAT1 基因?qū)m頸癌 XB1702 細胞增殖活性的影響Figure 2 Effect of CCAT1 gene on the proliferation of cervical cancer XB1702 cells

圖 3 CCAT1 基因?qū)m頸癌 XB1702 細胞凋亡的影響Figure 3 Effect of CCAT1 gene on the apoptosis of cervical cancer XB1702 cells

2.4 對宮頸癌的生長抑制作用的影響

CCAT1 siRNA轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤平均體積明顯小于對照組（P < 0.05），上調(diào) XB1702 細胞中CCAT1 lncRNA 表達后，XB1702 細胞增殖能力明顯增強，細胞凋亡率降低（P ＜ 0.05），而pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下種植瘤平均體積較照射前無明顯變化（表 1）。把治療前和治療后看做兩次重復(fù)測量，F(xiàn) = 19.55，P < 0.01，兩兩比較均 P < 0.01。

表 1 放療前后各組宮頸癌的生長抑制作用的影響（cm3）Table 1 Inhibitory effect of radiotherapy on cervical cancer growth (cm3)

3 討論

盡管長鏈非編碼 RNA 不具有其他編碼 RNA翻譯蛋白質(zhì)的功能，但因其具有獨特的空間結(jié)構(gòu)，并可定位于胞核或者胞質(zhì)；其具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，如參與染色質(zhì)重構(gòu)、RNA 剪接等[12]。其作用機制主要包括：①募集染色質(zhì)修飾酶復(fù)合物及目標基因區(qū)域，參與靶基因染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)修飾；②根據(jù)堿基互補配對原則，參與 mRNA 前體修飾和剪接等；③可作為分子支架，不同結(jié)構(gòu)域可結(jié)合不同的蛋白質(zhì)復(fù)合體，從而引導(dǎo)相關(guān)的大分子復(fù)合體在目標區(qū)域組裝以協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用；④作為誘餌分子與蛋白質(zhì)或 miRNA 結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達[13-16]。正常細胞中，只有肝臟細胞和小腸細胞可以檢測到微量的 CCAT1，而其他細胞則檢測不到該基因表達。本試驗在進行 CCAT1 siRNA 和PcDNA3.1-CCAT1 基因轉(zhuǎn)染后，CCAT1 的基因表達發(fā)生顯著變化?；虺聊M CCAT1 基因表達水平顯著下降；而基因重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 CCAT1 的 mRNA 相對表達水平顯著提高，提示本試驗基因成功轉(zhuǎn)染。

通過轉(zhuǎn)染 CCAT1 siRNA 質(zhì)粒，下調(diào)了該基因在宮頸癌細胞中的基因表達，進而提高了癌細胞的放射敏感性。在進行放射治療時，移植瘤的生長和發(fā)展水平明顯得到了抑制。然而，目前就 CCAT1基因與宮頸癌細胞的放射敏感性之間關(guān)系的研究還是空白。有研究表明，c-MYC 基因表達水平與腫瘤細胞的放射敏感性呈高度正相關(guān)。因此，CCAT1 參與調(diào)控的 c-MYC 基因轉(zhuǎn)錄也可能是改變細胞敏感性的原因之一，但其機制上需進一步證明。本試驗在上調(diào) CCAT1 的基因表達水平后發(fā)現(xiàn)，與放射治療之前相比，裸鼠的移植瘤無明顯改變，這一結(jié)果與對照組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。

研究結(jié)果提示，CCAT1 可能是決定宮頸癌XB1702 細胞的關(guān)鍵基因。其上調(diào)的表達水平會使癌細胞喪失放射敏感性。由于長鏈非編碼基因CCAT1 在宮頸癌細胞中的研究較少，因此本研究首次探究了 CCAT1 基因與宮頸癌細胞增殖凋亡和移植瘤生長發(fā)展的關(guān)系。研究顯示，下調(diào)宮頸癌細胞中的 CCAT1 基因可以明顯抑制癌細胞的增殖，抑制腫瘤的生長。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，長鏈非編碼基因干預(yù)可能會為治療宮頸癌提供新策略。

[1] Fan HF. Investigation and analysis of cervix cancer in rural women. Nei Mongol J Traditional Chin Med, 2014, 33(23):98-99. (in Chinese)樊洪芳. 農(nóng)村婦女宮頸癌普查調(diào)查分析. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2014, 33(23):98-99.

[2] Duan Y, Liu Y, Huang J, et al. Analysis of the symptom cluster of cervical cancer patients. Nur J Chin PLA, 2015, 32(17):19-22. (in Chinese)

段怡, 劉怡, 黃絹, 等. 宮頸癌患者癥狀群的調(diào)查分析. 解放軍護理雜志, 2015, 32(17):19-22.

[3] Meng QP. Chinese incidence of cervical cancer in the world second. Jilin Med Inf, 2014, 30(3):12. (in Chinese)孟慶普. 我國宮頸癌發(fā)病率世界第二. 吉林醫(yī)學(xué)信息, 2014, 30(3):12.

[4] Han LL. An overview of screening strategies for cervical cancer and breast cancer. Beijing Med J, 2014, 36(11):893-894. (in Chinese)韓歷麗. 子宮頸癌、乳腺癌篩查策略概述. 北京醫(yī)學(xué), 2014, 36(11):893-894.

[5] Kim YT, Kim SW, Hyung WJ, et al. Robotic radical hysterectomy with pelvic lymphadenectomy for cervical carcinoma:a pilot study. Gynecol Oncol, 2008, 108(2):312-316.

[6] Manci N, Marchetti C, Di Tucci C, et al. A prospective phase II study of topotecan (Hycamtin?) and cisplatin as neoadjuvant chemotherapy in locally advanced cervical cancer. Gynecol Oncol, 2011, 122(2): 285-290.

[7] Li XC, Xu XZ, Zhou YJ. Clinical analysis of concurrent chemoradiotherapy and chemotherapy for advanced cervical. J Chin Physician, 2008, 10(6):851-852. (in Chinese)李新春, 徐宣枝, 周彥杰, 等. 晚期子宮頸癌同步放化療的臨床分析. 中國醫(yī)師雜志, 2008, 10(6):851-852.

[8] Wei LH. Surgical treatment of cervical cancer. Chin J Clin Obstet Gynecol, 2014, 15(1):1-2. (in Chinese)魏麗慧. 子宮頸癌的手術(shù)治療. 中國婦產(chǎn)科臨床雜志, 2014, 15(1): 1-2.

[9] Pan YF, Feng L, Zhang XQ, et al. Role of long non-coding RNAs in gene regulation and oncogenesis. Chin Med J (Engl), 2011, 124(15): 2378-2383.

[10] Alaiyan B, Ilyayev N, Stojadinovic A, et al. Differential expression of colon cancer associated transcript1 (CCAT1) along the colonic adenoma-carcinoma sequence. BMC Cancer, 2013, 13:196.

[11] Cui G, Zhang T, Cui J. Value of colon cancer associated transcription factor 1 expression in early screening and prognosis assessment for patients with colorectal carcinoma. J Nanjing Med Univ (Nat Scie), 2015, 35(7):1008-1012. (in Chinese)崔戈, 張婷, 崔杰. 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1表達在結(jié)直腸癌早期篩查及預(yù)后評估中的作用. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 35(7):1008-1012.

[12] Hauptman N, Glava? D. Long non-coding RNA in cancer. Int J Mol Sci, 2013, 14(3):4655-4669.

[13] Tsai MC, Manor O, Wan Y, et al. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science, 2010, 329(5992): 689-693.

[14] Tripathi V, Ellis JD, Shen Z, et al. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell, 2010, 39(6):925-938.

[15] Kotake Y, Nakagawa T, Kitagawa K, et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15 INK4B tumor suppressor gene. Oncogene, 2011, 30(16):1956-1962.

[16] Gao Y, Meng H, Liu S, et al. LncRNA-HOST2 regulates cell biological behaviors in epithelial ovarian cancer through a mechanism involving microRNA let-7b. Hum Mol Genet, 2015, 24(3):841-852.

Impact of long non-coding RNA CCAT1 on the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702

GAO Jin-ping, ZHANG Shao-ju, LUO Zhi-hong, LI Jin

ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding RNA (lnRNA) CCAT1 on the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702.MethodsThe human cervical cancer XB1702 cells were divided into 3 groups: control group, CCAT1 siRNA group and pcDNA3.1-CCAT1 group. The CCAT1 siRNA and pcDNA3.1-CCAT1 were transfected into the human cervical cancer cells XB1702 by the electroporation method and stable transfected cell line was selected and identified by the G418 method. After 48 h of transplantation, the expression levels of CCAT1 lnRNA were measured by RT-PCR. Cellular proliferation was tested by CCK8 method, and apoptosis were determined by the TUNEL technology. The development of human cervical tumors in the nude mice xenograft model was studied by up-regulating and down-regulating the CCAT1 expression in the cells combined with the X-ray irradiation.ResultsInterference of CCAT1 lnRNA expression in XB1702 cells significantly inhibited the cellular proliferation, increased apoptosis rate, and reduced the average xenografted tumor volume of the nude mice compared with control group. Up-regulation of CCAT1 lnRNA expression significantly increased the cellular proliferation and decreased apoptosis. The average xenograft tumor volume in this group had no obvious difference with the ones before the irradiation.ConclusionDown-regulating CCAT1 mRNA expression levels could inhibit the development of tumor and improve the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702, while up-regulating CCAT1 lnRNA expression levels could enhance the radiation resistance of tumor.

Uterine cervical neoplasms; Neoplasm transplantation; Mice, nude; XB1702 cells; Long non-coding RNA

GAO Jin-ping, Email: gaojinpinglf@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.008

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):40-44

065000 河北省廊坊市安次區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科（高金蘋）；065000河北省廊坊市人民醫(yī)院化驗室（張紹菊）；065000 河北省廊坊市廣安醫(yī)院婦產(chǎn)科（羅志紅）；065000 河北省廊坊市中醫(yī)院放射科（李津）

高金蘋，Email：gaojinpinglf@163.com

2016-10-14

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(1):40-44

Author Affiliations:Obstetrics and Gynecology, Anci District Hospital Gynecology (GAO Jin-ping), People's Hospital Laboratory (ZHANG Shao-ju), Gynecology of Guang'an City Hospital (LUO Zhi-hong), Radiology of Chinese Medicine Hospital (LI Jin), 065000 Langfang, China

www.cmbp.net.cn