趨化因子受體CXCR4在腎癌組織中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制研究

彭迪，劉釗，李錦楠，張曉艷，王浩，王華，肖鳳君，張忠濤，胡澤斌，王立生，吳學(xué)杰，楊月峰

趨化因子受體CXCR4在腎癌組織中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制研究

彭迪，劉釗，李錦楠，張曉艷，王浩，王華，肖鳳君，張忠濤，胡澤斌，王立生，吳學(xué)杰，楊月峰

目的研究趨化因子受體 CXCR4 在腎癌患者腫瘤組織中的表達(dá)水平，探討 CXCR4 表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制。

受體，CXCR4； 腎腫瘤； 轉(zhuǎn)化生長因子 β；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

近年來，我國腎癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，僅次于膀胱癌，位居男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位[1]。腎癌早期癥狀并不明顯，同時(shí)，我國尚未建立完善的腎癌篩查體系，因此，往往發(fā)現(xiàn)較晚，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)。腎癌對(duì)放療和化療均不太敏感，因此，傳統(tǒng)的治療方法以手術(shù)切除為主。近年來，隨著免疫治療、基因治療等技術(shù)的發(fā)展與突破，分子靶向治療有望為腎癌的治療帶來突破。

趨化因子受體 CXCR4（C-X-C motif chemokine receptor 4）是含有 7 個(gè)跨膜區(qū)的 G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員，它表達(dá)于多種組織和器官中。CXCR4 參與體內(nèi)多種生理機(jī)制，包括參與 HIV-1 病毒侵染，造血功能，胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移等。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）是 CXCR4 唯一配體，SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路的激活，在多種惡性腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌等的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[2-5]。同時(shí)，近年來對(duì)于 CXCR4 分子及其機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn) CXCR4 是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后和復(fù)發(fā)預(yù)測的重要分子；是胰腺癌腫瘤放化療后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的理想分子之一；能夠作為預(yù)測腫瘤患者的藥物敏感性的重要指標(biāo)等[6-8]。本課題擬通過檢測腎癌組織 CXCR4 的表達(dá)水平，明確其在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用；同時(shí)，通過體外試驗(yàn)，闡明其上游調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例標(biāo)本 收集 2014 年 5 月 – 2016 年10 月于中國人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院行腎癌手術(shù)切除患者的癌組織和癌旁組織，共 12 例，其中，男性 8 例，女性 4 例，平均年齡 53.5 歲（29 ～78 歲）?；颊咝g(shù)前未接受任何形式的放療、化療。病例標(biāo)本收集后凍存于液氮中，后續(xù)用于 RNA 提取和基因表達(dá)檢測。

1.1.2 細(xì)胞系 人胚腎細(xì)胞 HEK293 培養(yǎng)于10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養(yǎng)基中；正常人腎臟細(xì)胞 HKC、人腎癌細(xì)胞 786O、769P（本實(shí)驗(yàn)室保存），培養(yǎng)于 10% FBS 的 1640 培養(yǎng)基。

1.1.3 重組腺病毒 重組腺病毒 Ad(E1-).sT 為攜帶可溶性轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）受體 II-人 IgGFc 融合蛋白（sTGF-βRIIFc）的復(fù)制缺陷型重組腺病毒；Ad(E1-).Null 為不攜帶外源基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體[9]。重組腺病毒載體均由 Adeasy 系統(tǒng)制備獲得病毒，采用氯化銫密度梯度離心純化病毒，采用紫外分光光度法測定病毒滴度和純度[10-11]。

1.1.4 主要試劑與儀器 人胚腎細(xì)胞 HEK 293購自 ATCC；Trizol 購自美國 Sigma 公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Premix EX TaqTMII 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測試劑盒購自日本 Takara 公司；1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司；FBS 購自浙江天杭生物科技股份有限公司；抗 IgGFc 抗體購自美國 Jackson Immuno Research 公司。無水乙醇、異丙醇等化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。人 CXCR4 基因、人 TGF-β基因和管家基因 β-actin 引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，其序列為：人 CXCR4 引物，上游 5' acgccaccaacagtcaga 3'，下游：5' aagtcg ggaatagtcagc 3'；人 TGF-β 引物，上游，5' gcaacaattc ctggcgatac 3'；下游，5' caaccactgccgcacaact 3'；人β-actin 引物，上游，5' gggacctgactgactacctc 3'，下游，5' cttaatgtcacgcacgatt 3'。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測 CXCR4 在腎癌組織中的表達(dá)水平 在液氮保護(hù)下研磨凍存腎癌標(biāo)本組織和癌旁組織（約 100 mg），加入 1 ml Trizol，常規(guī)方法提取 RNA。采用紫外吸收測定法測定RNA 濃度和純度；并按照 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得 cDNA 樣本。然后，以 cDNA為模板 PCR 擴(kuò)增人 CXCR4 和 β-actin，引物序列如上所述。反應(yīng)條件為 95 ℃ 預(yù)變性 10 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火加延伸 1 min，共40 個(gè)循環(huán)。以 β-actin 為對(duì)照，采用 2-ΔCT，分析腎癌組織及癌旁組織中 CXCR4 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 TGF-β 在腎癌細(xì)胞系的表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)生長期的人腎臟細(xì)胞系 HKC 以及人腎癌細(xì)胞系 769P 和 786O，分別提取 RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測目的基因 TGF-β 的表達(dá)。

1.2.3 Ad(E1-).sT 在人腎癌細(xì)胞 786O 中表達(dá)效率的檢測 人腎癌細(xì)胞 786O，每孔以 2 × 105個(gè)細(xì)胞/2 ml 接種于六孔板中，過夜培養(yǎng)后，重組腺病毒 Ad(E1-).sT 和對(duì)照病毒 Ad(E1-).Null 分別以25 000 VPs/細(xì)胞的強(qiáng)度感染細(xì)胞，感染后 48 h，Western blot 檢測目的基因 sTGF-βRIIFc 的表達(dá)水平。

1.2.4 阻斷 TGF-β 信號(hào)對(duì)人腎癌細(xì)胞 CXCR4表達(dá)的影響 人腎癌細(xì)胞 786O，每孔以 3 × 105個(gè)細(xì)胞/2 ml 接種于六孔板中，過夜培養(yǎng)后，重組腺病毒 Ad(E1-).sT 和對(duì)照病毒 Ad(E1-).Null 分別以10 000 VPs/細(xì)胞的強(qiáng)度感染細(xì)胞。孵育 24 h 后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，并加入 2 ng/ml 的重組人TGF-β 進(jìn)行刺激，以未刺激細(xì)胞作為對(duì)照。刺激后24 h，收集細(xì)胞，提取 RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測 CXCR4 的表達(dá)水平。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 人腎癌細(xì)胞 786O 細(xì)胞以每孔6 × 105個(gè)細(xì)胞/2 ml 接種于六孔板中，24 h 后，采用 5000 VPs 的 Ad(E1-).sT 和 Ad(E1-).Null 感染細(xì)胞，4 h 后更換新鮮的完全培養(yǎng)基；感染后 24 h進(jìn)行劃痕，并更換培養(yǎng)基，加入 2 ng/ml 的 TGF-β，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后即刻、6、12、24 h 觀察劃痕愈合情況并拍照，計(jì)算愈合率，明確細(xì)胞的遷移作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用 prism5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以?±s 進(jìn)行描述，病例標(biāo)本采用配對(duì) t 檢驗(yàn)；其他數(shù)據(jù)采用方差分析，并結(jié)合 t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。四個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍照，測量劃痕愈合情況。以 P ＜ 0.05表示具有差異，P ＜ 0.01 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4 在腎癌組織中表達(dá)上調(diào)

12 例未經(jīng)放、化療的腎癌患者，在手術(shù)治療過程中獲得的癌組織和癌旁組織，經(jīng)實(shí)時(shí)定量 PCR檢測，結(jié)果顯示，腫瘤組織中 CXCR4 的表達(dá)水平顯著提升（與癌旁組織相比，P ＜ 0.05）。其中，有8 例患者表達(dá)上調(diào)，占所有病例數(shù)的 66.7%，如圖 1 所示。上述結(jié)果提示，CXCR4 表達(dá)上調(diào)在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

圖 1 腎癌患者腫瘤組織中 CXCR4 的表達(dá)檢測（**P ＜0.01）Figure 1 CXCR4 expression in tumor tissues of renal cancer patients (**P ＜ 0.01)

2.2 腎癌細(xì)胞 TGF-β 表達(dá)上調(diào)

為探索腎癌組織中 CXCR4 上調(diào)的機(jī)制，在腎癌細(xì)胞系中，對(duì)其可能的上游分子 TGF-β 進(jìn)行檢測。以腎小管細(xì)胞 HKC 為對(duì)照，實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示，TGF-β 在腎癌細(xì)胞 769P 和 786O 中均表達(dá)上調(diào)（與 HKC 組比，P ＜ 0.001），且 786O細(xì)胞中的表達(dá)水平最高（與 769P 細(xì)胞組比，P ＜0.001）（圖 2）。上述結(jié)果提示，在腎癌細(xì)胞中，TGF-β 可能是介導(dǎo) CXCR4 表達(dá)上調(diào)的重要分子，而 786O 是理想的細(xì)胞模型。

2.3 TGF-β 可在體外誘導(dǎo) CXCR4 的表達(dá)

為檢測 TGF-β 在 CXCR4 表達(dá)中的調(diào)控作用，首先將 786O 細(xì)胞感染重組腺病毒 Ad(E1-).sT和對(duì)照病毒 Ad(E1-).Null，通過 Western blot 檢測可見，Ad(E1-).sT 在 786O 細(xì)胞中高效介導(dǎo)目的基因 sTGF-βRIIFc 的表達(dá)（圖 3）。

然后，對(duì)感染 Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 的786O 細(xì)胞，進(jìn)行 2 ng/ml 的重組人 TGF-β 刺激，24 h 后檢測 CXCR4 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，2 ng/ml TGF-β 可高效誘導(dǎo) CXCR4 的表達(dá)，而采用重組腺病毒 Ad(E1-).sT 阻斷 TGF-β 受體后，誘導(dǎo)作用消失（圖 4）。上述結(jié)果提示，TGF-β 受體信號(hào)通路在腎癌細(xì)胞 CXCR4 表達(dá)上調(diào)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

2.4 Ad(E1-).sT 干預(yù)可抑制 786O 細(xì)胞的遷移作用

Ad(E1-).sT 干預(yù)后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測了 786O細(xì)胞的遷移能力。圖 5 顯示，與 Ad(E1-).Null 組相比，Ad(E1-).sT 可以顯著抑制 786O 細(xì)胞的遷移作用。表明，TGF-β 在腎癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，而 TGF-β 有可能通過上調(diào) CXCR4 發(fā)揮其功能。

圖 2 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測 TGF-β 在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平（***P ＜ 0.001 vs HKC；###P ＜ 0.001vs 769P）Figure 2 The expression of TGF-β was detected by real-time quantitative PCR in renal cancer lines (***P ＜ 0.001 vs HKC;###P ＜ 0.001 vs 769P)

圖 3 Ad(E1-).sT 感染 786O 細(xì)胞后 sTGF-βRIIFc 表達(dá)檢測Figure 3 Expression of sTGF-βRIIFc in 786O cells infected by Ad (E1-).sT

圖 4 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測 TGF-β 刺激后，786O 細(xì)胞中CXCR4 的表達(dá)水平（***P ＜ 0.001vs Ad(E1-).Null + mock；###P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null + TGF-β）Figure 4 The expression of CXCR4 were detected by real-time quantitative PCR in TGF-β stimulated 786O cells (***P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null plus mock group;###P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null plus TGF-β group)

圖 5 Ad(E1-).sT 對(duì) 786O 細(xì)胞遷移的影響[*P ＜ 0.05 vs對(duì)照；#P ＜ 0.05 vs Ad(E1-).Null]Figure 5 Effects of Ad (E1-).sT on migration of 786O cells [*P ＜ 0.05 vs control;#P ＜ 0.05 vs Ad(E1-).Null]

3 討論

TGF-β 作為多功能的細(xì)胞因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。在乳腺癌、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的外周血中，均能檢測到高水平的 TGF-β[12]；而在晚期腎癌患者的腫瘤局部，TGF-β 表達(dá)顯著提升。TGF-β 可以通過多種機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移：如 TGF-β 通過 PI3K/Akt/mTOR 通路上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長；通過 Scr/Fak/Akt 通路上調(diào) VEGF 表達(dá)，促進(jìn)血管生成[13-14]；通過誘導(dǎo)溶骨相關(guān)因子的表達(dá)（IL-11、PTHrP、CTGF），促進(jìn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展等[15-16]。同時(shí)，TGF-β 也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可通過多種機(jī)制抑制腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫，包括：增強(qiáng)骨髓來源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的聚集；誘導(dǎo) CD4+T 細(xì)胞分化為 CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）；下調(diào) NK 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞表面 NKG2D 受體，進(jìn)而減弱其細(xì)胞毒效應(yīng)等[17-19]。

CXCR4 是一種 TGF-β 的重要靶基因，可通過 SDF-1/CXCR4 信號(hào)，發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚合、骨架重構(gòu)、偽足形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲力增加[20]等生物學(xué)活性。本課題中，對(duì)腎癌患者的腫瘤標(biāo)本和癌旁組織進(jìn)行了 CXCR4 表達(dá)的檢測，結(jié)果顯示，CXCR4 在腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，提示CXCR4 在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。那么，腎癌組織中 CXCR4 的表達(dá)上調(diào)是由 TGF-β誘導(dǎo)的嗎？我們的結(jié)果證實(shí)，TGF-β 在腎癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；外源 TGF-β 刺激可以誘導(dǎo) CXCR4 的表達(dá)；同時(shí)，阻斷 TGF-β 可以抑制 TGF-β 誘導(dǎo)的 CXCR4 表達(dá)和腎癌細(xì)胞的遷移能力。上述結(jié)果表明，CXCR4 作為 TGF-β 的重要靶基因，在腎癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，有望成為腫瘤治療的重要靶標(biāo)。

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Expression of chemokine receptor CXCR4 in renal cancer patients and its regulatory mechanisms

PENG Di, LIU Zhao, LI Jin-nan, ZHANG Xiao-yan, WANG Hao, WANG Hua, XIAO Feng-jun, ZHANG Zhong-tao, HU Ze-bin, WANG Li-sheng, WU Xue-jie, YANG Yue-feng

ObjectiveTo study the expression of chemokine receptor CXCR4 in the tumor lesions of renal cancer patients and its possible regulatory mechanisms.MethodsThe tumor and adjacent tissues were collected and RNA was then extracted. RT-PCR was conducted to detect the expression of CXCR4 in tumor and adjacent tissues. The mRNA expression of transforming growth factor β (TGF-β) in human renal proximal tubular epithelial cell line HKC, and renal cancer cell lines, 769P and 786O were examined using real-time RT-PCR. Replication deficiency adenovirus Ad(E1-).sT and its control Ad(E1-).Null were transfected into 786O cells. TGF-β were added 24 h later for stimulation, and the expression of CXCR4 were detected using real-time RT-PCR. In addition, 24 h after adenoviruses infection, the ability of cell migration were observed by wound healing examination.ResultsThe expression of CXCR4 is much higher in the tumor lesions than that in the para-cancerous tissues. Among total 12 selected patients, CXCR4 was up-regulated in the tumor lesions of 8 patients. Moreover, compared with human renal proximal tubular epithelial cells, the expression of TGF-β, upstream regulator of CXCR4, was significantly increased. In 786O cells, stimulation with TGF-β could up-regulate the expression of CXCR4. Furthermore, Ad(E1-).sT not only inhibit TGF-β-induced CXCR4 expression, but also decreased cellular migration ability.ConclusionCXCR4 expression is increased in tumor lesions of most renal cancer patients, and is regulated by TGF-β. Our results suggest that CXCR4 is a promising target for the therapy of renal cancer.

Receptor, CXCR4; Kidney neoplasms; Transforming growth factor beta; Cell movement

s:WU Xue-jie, Email: drwxj@sinna.com; YANG Yue-feng, Email: yuefengyang1981@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.004

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):19-23

國家“863”青年科學(xué)家專題項(xiàng)目（SS2014AA020515）；國家自然科學(xué)基金（81402558、81472396）

100039 北京，中國人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院泌尿外科（彭迪、李錦楠、吳學(xué)杰）；100850 北京，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究室（彭迪、劉釗、李錦楠、張曉艷、王浩、王華、肖鳳君、王立生、楊月峰）；100050 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普通外科（劉釗、張忠濤）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所（胡澤斌）

吳學(xué)杰，Email：drwxj@sinna.com；楊月峰，Email：yuefengyang1981@163.com

2016-12-12

方法收集腎癌患者（未接受放化療）的腫瘤組織和癌旁組織，將組織研磨后提取 RNA，采用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測腫瘤組織和癌旁組織中 CXCR4 的表達(dá)水平；采用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測腎小管細(xì)胞 HKC 以及腎癌細(xì)胞系769P 和 786O 中 TGF-β 的表達(dá)水平。復(fù)制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT 和對(duì)照病毒感染 786O 細(xì)胞后 24 h，采用2 ng/ml 的重組人 TGF-β 刺激 24 h，收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測目的基因 CXCR4 的表達(dá)水平。同時(shí)，病毒感染后 24 h，采用劃痕法檢測 786O 細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果在腎癌患者中，腫瘤組織的 CXCR4 表達(dá)顯著高于癌旁組織：12 例患者中，有 8 例表達(dá)上調(diào)。與正常腎小管細(xì)胞相比，腎癌細(xì)胞系 769P 和 786O 中，CXCR4 的上游分子 TGF-β 表達(dá)上調(diào)。在 786O 細(xì)胞中，TGF-β 刺激可以顯著提升 CXCR4 的表達(dá)水平；而 Ad(E1-).sT 可以在786O 細(xì)胞中高效介導(dǎo) sTGF-βRIIFc 的高效表達(dá)，并抑制CXCR4 的表達(dá)和細(xì)胞的遷移能力。

結(jié)論CXCR4 在腎癌組織中普遍表達(dá)上調(diào)，并受到 TGF-β的調(diào)控，有望成為腎癌治療的重要靶標(biāo)。

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(1):19-23

Author Affiliations:Department of Urology, General Hospital of People's Armed Police Forces China, Beijing 100039, China (PENG Di, LI Jin-nan, WU Xue-jie); Department of Experimental Hematology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China (PENG Di, LIU Zhao, LI Jin-nan, ZHANG Xiao-yan, WANG Hao, WANG Hua, XIAO Feng-jun, WANG Li-sheng, YANG Yue-feng); Department of General Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China (LIU Zhao, ZHANG Zhong-tao); Institute for in Vitro Diagnostic Reagents Control, the National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (HU Ze-bin)

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