survivin和bcl-2雙基因敲減對(duì)人舌癌裸鼠移植瘤的抑制作用*

饒國(guó)洲,婁 鳴,景 娟,牛 潔

1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心(西安710004),2.西安醫(yī)學(xué)院口腔系(西安710021)

survivin和bcl-2雙基因敲減對(duì)人舌癌裸鼠移植瘤的抑制作用*

饒國(guó)洲1,婁 鳴2,景 娟1,牛 潔1

1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心(西安710004),2.西安醫(yī)學(xué)院口腔系(西安710021)

目的：探討survivin和bcl-2單基因與雙基因敲減后對(duì)舌癌裸鼠移植瘤成瘤性的影響。方法：將篩選含有轉(zhuǎn)染survivin siRNA-Tca8113；bcl-2 siRNA-Tca8113；survivin/bcl-2 siRNA-Tca8113；Negative-siRNA-Tca8113細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞分組進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)調(diào)成1×107細(xì)胞/ml接種于裸鼠左后肢股部,以無菌生理鹽水做陰性對(duì)照,隔日觀察裸鼠腫瘤發(fā)生情況,并測(cè)量腫瘤大小、體積。接種5周后處死并測(cè)量腫瘤體積大小、比較抑制結(jié)果及腫瘤組織切片HE染色病理分析。結(jié)果：腫瘤形成率顯示空白對(duì)照、Lipofectamine和Negative-siRNA三組的裸鼠成瘤率100%，生長(zhǎng)速度快、瘤體大；單基因敲減組(bcl-2 siRNA、survivin siRNA)和雙基因敲減組(survivin/bcl-2siRNA)瘤體較空白對(duì)照組小,生長(zhǎng)速度慢；雙基因敲減組成瘤率低(66.6%),注射生理鹽水的陰性對(duì)照組接種后未出現(xiàn)腫瘤。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示空白對(duì)照、Lipofectamine、Negative-siRNA 三組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于單基因敲減和雙基因敲減組,而雙基因敲減組不僅成瘤延長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)速度明顯慢于單基因敲減組。腫瘤抑制率顯示雙基因敲減(84.5%)明顯高于單基因敲減(67.6%和69.8%,P<0.05)；腫瘤組織HE染色鏡下可見：空白對(duì)照、Lipofectamine、Negative-siRNA組腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),有大片壞死區(qū),survivin和bcl-2基因敲減后的腫瘤組織與周圍組織分界較清,未見明顯浸潤(rùn)現(xiàn)象,腫瘤組織壞死區(qū)較少。結(jié)論：survivin和bcl-2基因敲減能有效抑制裸鼠移植瘤成瘤性,雙基因敲減對(duì)裸鼠移植瘤抑制作用強(qiáng)于單基因敲減。

在本項(xiàng)目前期的實(shí)驗(yàn)研究中[1-4],針對(duì)survivin和bcl-2基因各設(shè)計(jì)4對(duì)RNA干擾序列,經(jīng)篩選得到2條有效干擾序列分別轉(zhuǎn)染到高表達(dá)survivin和bcl-2蛋白的Tca8113細(xì)胞中,篩選到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中觀察到干擾后的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制且細(xì)胞發(fā)生凋亡，這種作用表現(xiàn)于雙基因干擾效果優(yōu)于單基因干擾的效果。這是在體外培養(yǎng)細(xì)胞中顯示的結(jié)果,在體內(nèi)的效果不得而知。為進(jìn)一步研究RNA干擾下調(diào)survivin和bcl-2基因表達(dá)治療口腔鱗癌的可行性，本實(shí)驗(yàn)以裸鼠為研究對(duì)象通過皮下注射經(jīng)單基因和雙基因敲減后的Tca8113細(xì)胞,探討舌癌細(xì)胞移植瘤的成瘤能力及對(duì)腫瘤的抑制作用,以期為舌癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 人舌癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞株(本室保存)；survivin siRNA-Tca8113,bcl-2 siRNA-Tca-8113,survivin/bcl-2 siRNA-Tca8113,Negave-siRNA-Tca8113(均為本文作者構(gòu)建)；18只4周齡BALB/C裸鼠(西安交大醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供),體重18～20 g,雌雄各半,分為六組每組3只,裸鼠在無特殊病原體條件(SPF)下飼養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；臺(tái)式離心機(jī)(Sigma)；恒溫?fù)u床(Fuma)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Sigma)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclon)；胎牛血清(Gibco)；顯微鏡(Nikon)；HE染色液(自配)。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組；脂質(zhì)體組(Lipofectamine)；RNA陰性敲減組(Negative siRNA)；單基因敲減組(survivin siRNA、bcl-2 siRNA)；雙基因敲減組(survivin/bcl 2 siRNA)。復(fù)蘇各組細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、100 μg/ml雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)80%消化傳代培養(yǎng)。②裸鼠荷瘤試驗(yàn)：取以上各組1×107細(xì)胞/ml懸浮于0.2 ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)液中,將裸鼠隨機(jī)分成六組,每組3只,無菌條件下接種于裸鼠左后肢股部,以無菌生理鹽水做陰性對(duì)照,隔日觀察裸鼠腫瘤發(fā)生情況,并測(cè)量腫瘤大小、體積。接種5周后處死并測(cè)量腫瘤體積大小、比較抑制結(jié)果。腫瘤體積計(jì)算方法：腫瘤體積=腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2×0.5。③腫瘤組織HE染色分析：組織固定包埋、切片脫蠟至水,蘇木素染液染色5 min,自來水洗10 s,鹽酸乙醇分化5 s,自來水洗20 s,返藍(lán)20 s,自來水洗60 s,伊紅染色液染色3 min,自來水洗5 s,顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1 腫瘤形成率 空白對(duì)照、Lipofectamine和Negative-siRNA 三組的裸鼠接種9 d后可見局部腫瘤形成，成瘤率100%，生長(zhǎng)速度快、瘤體大。單基因敲減組(bcl-2 siRNA 、survivin siRNA )分別于接種后16 d和17 d局部腫瘤形成，成瘤率100%，瘤體較空白對(duì)照組小，生長(zhǎng)速度慢。雙基因敲減組(survivin/bcl-2-siRNA)于接種后22 d,3只裸鼠中有2只局部腫瘤形成,成瘤率66.6%,且瘤體較單基因敲減組小,生長(zhǎng)速度慢。注射生理鹽水的陰性對(duì)照組接種后未出現(xiàn)腫瘤形成。從裸鼠外表觀察,隨著瘤體的增大其體質(zhì)越來越消瘦且精神狀態(tài)差,相反瘤體小體質(zhì)和狀態(tài)相對(duì)較好,陰性對(duì)照組體質(zhì)健壯。

2 腫瘤生長(zhǎng)曲線 見圖1。以生長(zhǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo),腫瘤體積為縱坐標(biāo)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,空白對(duì)照、Lipofectamine、Negative-siRNA 三組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于單基因敲減組及雙基因敲減組(P<0.05),雙基因敲減組不僅成瘤時(shí)間延長(zhǎng),而且生長(zhǎng)速度明顯慢于單基因敲減組(P<0.05)。

圖1 不同處理組裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)曲線

3 腫瘤抑制率 見表1。

表1 不同處理組裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)重量及抑制率比較 (n=3)

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05；與 bcl-2 siRNA、survivin siRNA比較,△P<0.05

腫瘤抑制率(%)=(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100% 。結(jié)果顯示基因敲減后的腫瘤重量明顯低于空白組、Negative-siRNA和Lipofectamine組(P<0.05),雙基因敲減組低于單基因敲減組的瘤體重量(P<0.05),單基因敲減組之間瘤體重量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腫瘤抑制率顯示雙基因敲減組明顯高于單基因敲減組(P<0.05)。

4 腫瘤組織病理 見圖2?？瞻讓?duì)照組、Lipofectamine組、Negative-siRNA組腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，有大片壞死區(qū)。survivin和bcl-2基因敲減后的腫瘤組織與周圍組織分界較清，未見明顯浸潤(rùn)現(xiàn)象，腫瘤組織壞死區(qū)較少。

A: 對(duì)照組；B：Lipofectamine；C: Negative-siRNA；D：bcl-2 siRNA；E：survivin siRNA；F: survivin/bcl-2 siRNA

圖2 不同處理組裸鼠皮下腫瘤組織(HE×200)

討 論

基因敲減或稱基因敲低(Gene knock-down),是利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA,從而阻斷體內(nèi)靶基因的表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。通過降解具有同源序列靶基因的mRNA以此達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。研究表明[5-6]：survivin和bcl-2是兩種重要的腫瘤凋亡抑制基因,幾乎在所有常見的腫瘤組織中過量表達(dá)。survivin抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制是直接作用于Caspase,主要抑制終末效應(yīng)器Caspase-3和 Caspase-7的活性或干擾Caspase-9的活性，阻斷各種刺激誘導(dǎo)的下游細(xì)胞凋亡的共同通路[7-9]。bcl-2與survivin抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制有所不同，bcl-2是通過干擾細(xì)胞色素C自線粒體的釋放，從而阻斷Caspase蛋白酶連鎖反應(yīng)的激活，survivin是在bcl-2的下游直接抑制Caspase蛋白酶。近年來有研究報(bào)道[10-12]：survivin與bcl-2在舌鱗癌細(xì)胞系Tca-8113細(xì)胞中高表達(dá)，表明survivin的表達(dá)與bcl-2有明顯的相關(guān)性，且survivin單獨(dú)或協(xié)同bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[13]。survivin與bcl-2基因都是由無TATA的富含GC啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的，轉(zhuǎn)錄激活均增強(qiáng)細(xì)胞的增殖。應(yīng)用RNA干擾進(jìn)行基因敲減技術(shù)抑制抗凋亡基因表達(dá)，這種靶向作用的特點(diǎn)是抑制腫瘤細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡，但對(duì)正常組織和細(xì)胞不受影響。因此,本研究針對(duì)survivin和bcl-2基因設(shè)計(jì)其靶向干擾序列以期達(dá)到基因治療腫瘤的目的。

目前,還未見在舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞中敲減survivin和bcl-2兩種基因的研究報(bào)道，本研究在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)觀察到survivin和bcl-2基因經(jīng)敲減后Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受到抑制及誘導(dǎo)發(fā)生凋亡[4]。本研究結(jié)果的腫瘤形成率顯示，空白對(duì)照、Lipofectamine和Negative-siRNA三組的裸鼠接種9 d后可見局部腫瘤形成，成瘤率100%，生長(zhǎng)速度快、瘤體大；bcl-2 siRNA 和survivin-siRNA 兩組分別于接種后16 d和17 d局部腫瘤形成，成瘤率100%，瘤體較空白對(duì)照組小，生長(zhǎng)速度慢；survivin/bcl-2siRNA雙基因敲減組于接種后22 d,3只裸鼠中有2只局部腫瘤形成，成瘤率66.6%，且瘤體較單基因敲減組小，生長(zhǎng)速度慢；注射生理鹽水的陰性對(duì)照組接種后未出現(xiàn)腫瘤形成。另外，從裸鼠外表觀察，隨著瘤體的增大其體質(zhì)越來越消瘦且精神狀態(tài)差，相反瘤體小體質(zhì)和狀態(tài)相對(duì)較好，陰性對(duì)照組體質(zhì)健壯。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，空白對(duì)照組、Lipofectamine組、Negative-siRNA組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于bcl-2siRNA和survivin siRNA組及survivin/bcl-2 siRNA雙基因敲減組。雙基因敲減組不僅成瘤延長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)速度明顯慢于單基因敲減組。腫瘤抑制率顯示，雙基因敲減(84.5%)明顯高于單基因敲減(67.6和69.8%)后的腫瘤抑制率。腫瘤組織經(jīng)HE染色病理分析顯示，空白對(duì)照組、Lipofectamine組、Negative-siRNA組腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)并有大片壞死區(qū)。survivin和bcl-2基因敲減后的腫瘤組織與周圍組織分界較清，未見明顯浸潤(rùn)現(xiàn)象且腫瘤組織壞死區(qū)較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，survivin和bcl-2基因在舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)與該基因參與舌癌的發(fā)生過程及與舌癌細(xì)胞的增殖侵襲密切相關(guān)。經(jīng)基因敲減后其成瘤率及惡性程度降低，表明survivin和bcl-2基因可作為舌癌基因治療靶點(diǎn)的可行性。由此推測(cè)survivin與bcl-2基因有共同的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制,兩者協(xié)同發(fā)揮抗凋亡作用[14],表明舌癌的發(fā)生發(fā)展與survivin和bcl-2基因過表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的參與及調(diào)控過程,雙基因敲減要比單基因敲減的抑制作用好。

[1] 饒國(guó)洲.Bcl-2shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2011,40(10)：1281-1284.

[2] 饒國(guó)洲.BIRC5shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(7)：767-769.

[3] 饒國(guó)洲.BIRC5、Bcl-2siRNA慢病毒表達(dá)載體最佳干擾序列的篩選[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(6)：33-36.

[4] 饒國(guó)洲. Survivin和bcl-2基因靶向siRNA對(duì)舌癌Tca-8113細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的影響[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志,2015,44(2)：140-143.

[5] Sanz L,Garcia M,Arco JA,etal. Bcl-2 family gene modulation during spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,315(3)：562-567.

[6] Bokarewa M, Lindblad S, Bokarew D,etal.Balance between survivin,a key member of the apoptosis inhibitor family,and its specific antibodies determ ines erosivity in heum atoid arthritis[J].Arthritis Res Ther,2005,7(2)：349-358.

[7] Du C,Fang M,Li Y,etal.Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J].Cell,2000,102(1)：33-42.

[8] Ikeguchi M,Yamaguchi K,Kaibara N. Survivin gene expression positively correlates with proliferative activity of cancer cells in esophageal cancer[J].Tumour Biol,2003,24(1)：40-45.

[9] 趙 安，韓福生.凋亡抑制因子Survivin與腫瘤的研究進(jìn)展[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2011，9(12)：1939-1941.

[10] 徐亞娟,金志威,張艷秋,等.Survivin在舌鱗癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(11)：2094-2095.

[11] 王智明,管新明,孫 明,等. Survivin在舌鱗癌中的表達(dá)及其與bcl-2的相關(guān)性[J]].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,37(1)：65-67.

[12] 籍麗莉. Survivin在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與bcl-2，P53，bax表達(dá)之間的關(guān)系[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007,21(4)：410-413.

[13] Kawasaki H,Altieri DC, Lu CD,etal.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shotter survival rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58(22)：5071-5074.

[14] Rohayem J,Diestelroetter P,Weigle B,etal.Antibody response to the tumor-associated inhibitor of apoptosis protein surviving in cancer patients[J].Cancer Res,2000,60(7)：1815-1817.

(收稿：2016-05-08)

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009K12-01)

舌腫瘤 基因, 腫瘤抑制 小鼠, 基因敲除 腫瘤 移植,同種

R739.86

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.003