一株野生毛頭鬼傘的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

曹晉良，康 曼，韓建榮

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

一株野生毛頭鬼傘的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

曹晉良，康 曼，韓建榮

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

對采自蘆芽山的一株大型野生食用菌ZMM-3進(jìn)行了分離鑒定，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。利用組織分離的方法獲得該野生菌株，并且提取其基因組DNA，以其為模板擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed space，ITS）片段并測序。根據(jù)ITS序列分析結(jié)果結(jié)合形態(tài)特征，將ZMM-3菌株鑒定為毛頭鬼傘（Coprinus comatus）。通過對ZMM-3菌株生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，其最適生長溫度為25℃，最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母粉，最適碳氮比為（10∶1）～（20∶1），最適pH值為7～8。采用棉籽殼、木屑、稻草、玉米芯、玉米秸稈等栽培料對該野生菌株進(jìn)行了出菇栽培試驗。結(jié)果表明，該菌株在稻草培養(yǎng)料上生長最快，在稻草和玉米秸稈上發(fā)滿菌覆土即可出菇，其生物轉(zhuǎn)化率分別為11.18%和22.28%，所以，玉米秸稈栽培料是ZMM-3菌株的最適栽培料。

毛頭鬼傘；生物學(xué)特性；鑒定

毛頭鬼傘（Coprinus comatus）又名雞腿菇、雞腿蘑等，是真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目鬼傘科鬼傘屬的真菌[1]。眾所周知，蘑菇中含有大量的生物活性物質(zhì)，比如維生素及維生素前體、多糖、多酚類化合物，這些化合物對動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等疾病的預(yù)防有明顯效果[2]。其中，雞腿菇是近年來我國發(fā)展較快的一種珍稀食用菌。2003年，我國雞腿菇年產(chǎn)量已達(dá)到17.7萬t，已成為我國的第6大食用菌品種[3]。雞腿菇不僅營養(yǎng)豐富、味道鮮美，而且還有降血糖、降血脂、增進(jìn)食欲、提高免疫力的功效[4]。因此，雞腿菇是廣大食客們以及亞健康人群作為保健食品的良好選擇之一。雖然雞腿菇已經(jīng)商業(yè)化栽培，但是分離野生菌種并且研究其生理特性，充分保護(hù)和利用野生食用菌資源依然是今后農(nóng)業(yè)發(fā)展的一大熱門產(chǎn)業(yè)[5]。

本試驗對蘆芽山野生毛頭鬼傘進(jìn)行了菌種分離以及生物學(xué)特性的研究，旨在為其栽培馴化提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集自山西省蘆芽山自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)組織分離獲得編號為ZMM-3的菌株，保存于山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

1.1.2 主要試劑 β-巰基乙醇、蛋白酶-K（10 mg/ mL）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

真菌提取試劑盒、rDNA ITS分析所用的ITS4和ITS5通用引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 加富PDA培養(yǎng)基按照呂作舟[6]的方法配制，基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照李蝶等[7]的方法配制，麥粒種培養(yǎng)基按照康曼等[8]的方法配制。

栽培料配方：（1）木屑85%+麥麩12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（2）棉籽殼85%＋麥麩12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（3）玉米稈85%＋麥麩12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（4）玉米芯85%＋麥麩12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（5）稻草85%＋麥麩12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%。

1.2.2 ZMM-3菌株同步菌絲的制備 將ZMM-3菌絲體接于已經(jīng)配制好的PDA平板培養(yǎng)基上，待菌絲體長滿整個平板之后，用直徑為7 mm的打孔器制作大小相同的菌餅，用接種鏟將菌餅接到供試培養(yǎng)基上，觀察記錄菌落的形態(tài)以及菌絲的生長狀況[8]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 將菌餅接于PDA培養(yǎng)基上，待菌絲長滿平板之后，觀察和記錄菌絲體形態(tài)、菌落形態(tài)，用MOTICB顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 擴(kuò)增ITS序列[9-11]將ZMM-3菌株接于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱暗室培養(yǎng)，待菌絲長滿平板之后，收集菌絲體烘干，用真菌提取試劑盒提取DNA。PCR擴(kuò)增引物：ITS4：5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′，擴(kuò)增片段大小為600～750 bp。引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。采用張倢等[9]的PCR反應(yīng)體系。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸105 s；72℃延伸10 min，共35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物的純化和DNA測序由上海生物工程股份有限公司完成。將測序結(jié)果提交至GenBank，進(jìn)行BLAST比對，同時獲得菌株的登錄號為：KX015766。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物點入1.0%的瓊脂糖凝膠中，在120 V電壓下電泳35 min，以2 000 bp DNALadder作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用1 μg/mL Gelview染色后置于UVP-GDS800自動成像儀中觀察拍照，剩余的產(chǎn)物在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 ZMM-3菌株最適母種培養(yǎng)基的篩選 為了獲得ZMM-3菌株的最適母種培養(yǎng)基，本研究通過觀察菌絲體在9種不同培養(yǎng)基上的生長情況，從而對母種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。9種培養(yǎng)基的配方分別如下。

1.2.6.1 合成培養(yǎng)基 葡萄糖2.5 g，KH2PO40.125 g，氯化鈉0.05 g，酵母汁25 mL，MgSO40.05 g，CaCO30.5 g，瓊脂5 g，H2O250 mL。

1.2.6.2 玉米粉蔗糖培養(yǎng)基 玉米粉10 g，瓊脂5 g，蔗糖2.5 g，蒸餾水250 mL。

1.2.6.3 葡萄糖麥芽膏酵母膏培養(yǎng)基 葡萄糖2.5g，麥芽浸粉2.5 g，酵母膏1.0 g，瓊脂5 g，蒸餾水250 mL。

1.2.6.4 馬糞培養(yǎng)基 馬糞37.5 g，蔗糖12.5 g，瓊脂5 g，蒸餾水250 mL。

1.2.6.5 麩皮培養(yǎng)基 麩皮25 g，瓊脂5 g，葡萄糖5 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.375 g，MgSO40.375 g。

1.2.6.6 PDA馬鈴薯50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，H2O250 mL。

1.2.6.7 馬鈴薯合成培養(yǎng)基 馬鈴薯50g，葡萄糖5g，KH2PO40.75 g，MgSO40.375 g，維生素B12.5 mg，瓊脂5 g，H2O250 mL，pH值5.8～6.2。

1.2.6.8 麥粒煮汁培養(yǎng)基I麥粒50g，MgSO40.375g，KH2PO40.25 g，蛋白胨0.5 g。

1.2.6.9 麥粒煮汁培養(yǎng)基Ⅱ 麥粒25g，MgSO40.375g，KH2PO40.25 g，蛋白胨0.5 g，H2O250 mL。

1.2.7 碳源、氮源對ZMM-3菌株生長的影響 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中20 g葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，分別以等量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，并以不添加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照；以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中2 g蛋白胨的含量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以等量的硝酸鉀、尿素、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，并以不添加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照，將菌餅接入平板中央，每處理重復(fù)3次，觀察記錄菌落形態(tài)特征，并對菌絲的日生長速度進(jìn)行測定。

1.2.8 不同碳氮比對ZMM-3菌株生長的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的蛋白胨（蛋白胨含碳量忽略不計）配制成培養(yǎng)基碳氮比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，觀察不同碳氮比對毛頭鬼傘菌絲生長的影響；每個處理重復(fù)3次，觀察記錄菌落形態(tài)特征，并對菌絲的日生長速率進(jìn)行測定。

1.2.9 不同溫度和pH對ZMM-3菌株生長的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，（1）大范圍的溫度篩選：采用PDA培養(yǎng)基，用直徑為7 mm的無菌打孔器制作大小相同的菌餅，并把活化好的菌餅分別接于5，10，15，20，25，30，35℃的培養(yǎng)基中，恒溫避光培養(yǎng)，每個溫度梯度均設(shè)置3個重復(fù)。（2）小梯度的溫度試驗：采用PDA培養(yǎng)基，用直徑為7 mm的無菌打孔器制作大小相同的菌餅，并把活化好的菌餅分別接于22，24，26，28℃培養(yǎng)箱中，恒溫避光培養(yǎng)，每個溫度梯度均設(shè)置3個重復(fù)。另外用2 mol/L的氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其分別為4，5，6，7，8，9，10，接種方法同上，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)。觀察記錄菌落形態(tài)特征，并對菌絲的日生長速率進(jìn)行測定。

1.2.10 菌絲生長速率的測定 菌絲培養(yǎng)5 d后，測定菌落的直徑，并按照下列公式對菌絲生長速率進(jìn)行計算，最終取3組數(shù)值的平均值。

菌絲生長速率（mm/d）＝（菌落直徑－7 mm）/2/培養(yǎng)天數(shù)。

1.2.11 人工馴化栽培 用長好的麥粒種作為原種對5種供試栽培料進(jìn)行接種，然后置于溫度25℃左右，空氣相對濕度為65%～90%的環(huán)境下避光培養(yǎng)，觀察菌絲在5種不同培養(yǎng)料上的長勢、生長速度、菌絲密度、染菌情況以及出菇情況，最后選擇最佳栽培料。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，通過P值是否小于0.05來確定其差異顯著性，從而判斷其是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列PCR產(chǎn)物的分析

ZMM-3菌株ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在500～750 bp之間目的條帶清晰明亮無拖尾現(xiàn)象（圖1），其測序結(jié)果如下。

GGACGGGCATCTACTGATTTGAGGCAAAGTT CAATATTGTTGTCCTTTAATAGGACAGTTAGAAGC AGAACACTACAGAGAGCGTTCACAGTCTATGGCG TAGATAATTATCACACCGGTGACGGATCGCAAAC GGTTCCACTAATACATTTCAGGAGAGCTGATCTCG AATGAGACCAGCAAACACTCCCATATCCAAGCCA CAACCAGCAACAAAAGCTGGAGGGGTTGAGAATT TAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATA CCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATG ATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGC ATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAG AGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATTTTGTTTATAGG CACTGAGGCCCAAATACTTCATTCTACGACATACT AAGTGGTTTATGATAACATAGACCCCAGAGGACG ACATGGCAACAAAAAATTGTCACTAATCAATCCC CCAAGACTACAATGTGTGCACAGGTGGATAGATA AAGACGGCAGGTGTGCACATACTCCTAGGAGTCA GCTACAACCCAACCATGTTTATTCAATAATGATCC TTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAG。

該序列全長619 bp，通過GenBank BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該蘑菇與鬼傘屬的毛頭鬼傘最大同源性高達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)特征將其鑒定為毛頭鬼傘（Coprinus comatus），即雞腿菇。

2.2 菌株的形態(tài)特征[12]

由圖2可知，ZMM-3菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d后，菌落邊緣整齊，菌絲為淡黃色，氣生菌絲旺盛，呈棉絮狀，質(zhì)地松散，長時間放置菌落背面會呈黑褐色。

從圖3可以看出，菌絲生長健壯，有隔，且隔不等間距，有鎖狀聯(lián)合。

2.3 最佳母種培養(yǎng)基的篩選

菌絲在9種不同母種培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d后的菌落形態(tài)如圖4所示，菌絲在不同母種培養(yǎng)基上的生長情況如表1所示。從圖4可以看出，葡萄糖麥芽糖酵母膏混合培養(yǎng)基（F）上的菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊且無老化現(xiàn)象，因此，初步將葡萄糖麥芽膏酵母膏混合的培養(yǎng)基作為最適培養(yǎng)基。

表1 9種不同培養(yǎng)基對ZMM-3菌株生長的影響

2.4 碳源對ZMM-3菌株生長的影響

從表2可以看出，ZMM-3菌株在以乳糖作為碳源的培養(yǎng)基上幾乎不生長，在其他幾種碳源以及無糖培養(yǎng)基上均可生長且生長速率存在顯著差異。其中，ZMM-3菌株在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速率快，且菌落邊緣整齊，菌絲潔白濃密。因此，將蔗糖確定為ZMM-3菌株生長所需的最適碳源。

表2 不同碳源對菌絲生長的影響

2.5 氮源對ZMM-3菌株生長的影響

由表3可知，ZMM-3菌株除在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上不能生長外，在其他幾種氮源和無氮培養(yǎng)基上均能生長，但生長速率存在差異，其中，在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快且菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，因此，酵母粉被確定為該菌株生長的最佳氮源。

表3 不同氮源對菌絲生長的影響

2.6 碳氮比對ZMM-3菌株生長的影響

從表4可以看出，ZMM-3菌株在不同碳氮比的培養(yǎng)基上均能生長，但是菌絲生長速率有差異，且菌絲在碳氮比為10∶1的培養(yǎng)基上生長速率最快，菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，當(dāng)碳氮比大于20∶1時，菌絲有老化現(xiàn)象，因此，最適碳氮比為（10∶1）～（20∶1）。

表4 不同碳氮比對ZMM-3菌株生長的影響

2.7 不同pH值對ZMM-3菌株生長的影響

從表5可以看出，ZMM-3菌株在pH值為4，5，6，7，8，9，10的培養(yǎng)基上均能生長，但是pH值為4時，培養(yǎng)基呈果凍狀，凝固性差，因此，表5中沒有對pH值為4的情況下進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，在其他pH值的培養(yǎng)基上菌絲生長速率存在差異，當(dāng)pH值為7～8時，菌絲生長健壯且速率最快。

表5 不同pH值對ZMM-3菌株生長的影響

2.8 不同溫度對ZMM-3菌株生長的影響

由表6可知，當(dāng)菌株在5，35℃時菌種不萌發(fā)，在10℃時菌種萌發(fā)，但菌絲不生長，在15，20，25，30℃時，菌絲均能生長但是生長速率存在明顯差異，在25℃時菌絲生長速率最快，且菌絲潔白濃密。30℃時菌絲出現(xiàn)嚴(yán)重老化現(xiàn)象。在小范圍溫度篩選過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為22℃時菌絲生長緩慢，當(dāng)溫度高達(dá)28℃時菌絲出現(xiàn)老化現(xiàn)象。當(dāng)菌絲生長溫度設(shè)定在24，26℃時，菌絲潔白且健壯，生長較快。

表6 不同溫度對ZMM-3菌株生長的影響

2.9 不同栽培料對菌絲生長發(fā)育的影響[13]

由表7可知，菌絲在5種栽培料上均能生長，但是生長速率存在明顯差異，其中，菌絲在稻草培養(yǎng)基上生長速率最快，可以達(dá)到約5.7 mm/d。待菌絲長滿菌袋進(jìn)行覆土，12 d后菌袋中出現(xiàn)原基，但只在稻草和玉米稈這2種培養(yǎng)料上出菇并形成了子實體，且生物轉(zhuǎn)化率分別為11.17%和22.28%，因此，將玉米稈確定為最佳栽培料。子實體在分化過程中先分化菌柄，后分化菌蓋，在分化菌蓋過程中菌柄逐漸變細(xì)，菌蓋周身有鱗片。毛頭鬼傘在生長發(fā)育時有幼蕾期、棒狀期、梭型期、卵型期、成熟自溶期幾個關(guān)鍵階段[14]。覆土出菇后發(fā)現(xiàn)，該菌株子實體多為單生或者叢生，呈棒槌形[15]。菌株高度可達(dá)到20 cm左右，菌蓋的直徑達(dá)到5 cm，單菇鮮質(zhì)量達(dá)80 g。

表7 ZMM-3菌株在不同栽培料上的生長情況

3 討論

本研究結(jié)合分子生物學(xué)手段和傳統(tǒng)的形態(tài)觀察對ZMM-3菌株進(jìn)行了分類鑒定，與傳統(tǒng)的分類學(xué)相比，利用ITS序列鑒定物種相對快捷且準(zhǔn)確。桂明英等[16]利用ITS序列成功地鑒定了綿毛蘑菇；王波等[17]通過ITS-RFLP分析對一種野生雙孢蘑菇菌株進(jìn)行了鑒定。本試驗還通過對ZMM-3的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，菌絲在以乳糖作為碳源的培養(yǎng)基上菌絲不生長，以葡萄糖、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲長勢相對健壯，KAKDE等[18]研究表明，以上述2種糖作為碳源會提高菌絲中脂肪酶的活性，從而促進(jìn)菌絲的生長。由于不同的真菌參與代謝的酶種類以及酶的活性存在差異，所以，對碳源的吸收利用也存在不同。此外，氮源對于野生食用菌的生長和發(fā)育是必不可少的，其既是重要的營養(yǎng)來源，又是合成各種細(xì)胞組分的重要元素，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、幾丁質(zhì)以及嘌呤和嘧啶等[19]。研究表明，合適的碳氮源能夠增加真菌中的部分生長因子，從而促進(jìn)菌絲的健壯生長[20]。菌絲在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上不生長，在以酵母粉和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長健壯，另外合適的碳氮比也會影響菌絲的生長狀況，當(dāng)碳氮比在（10∶1）～（20∶1）的時候，菌絲潔白濃密，但當(dāng)碳氮比繼續(xù)增大時，菌絲會發(fā)黃出現(xiàn)嚴(yán)重老化。此外，ZMM-3菌株的最適生長溫度為25℃，最適pH值為7～8，在空氣相對濕度為65%～90%時，散光照射，覆土后即可出菇形成子實體。本試驗為野生食用菌的馴化栽培提供了一定的理論依據(jù)。

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Study on Isolation，Identification and Biological Characteristics of a Wild Strain ofCoprinus comatus

CAOJinliang，KANGMan，HANJianrong
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

ZMM-3,a large wild strain,was isolated,identified and its biological characteristics were studied.The method of tissue isolation was employed to obtain the ZMM-3 strain.Its Internal transcribed space（ITS）was amplified after the genomic DNA extracted and then sequenced.According to results of ITS sequence and morphological characteristics,ZMM-3 strain was identified as Coprinus comatus.The results showed that the optimum conditions for ZMM-3 strain were the following:temperature of 25℃,sucrose and yeast powder as carbon and nitrogen sources,ratioofcarbon tonitrogen of（10∶1）-（20∶1）,pH 7-8.Finally,the agricultural residues（i.e. cottonseed hull,sawdust,straw,corn cob and corn stalk）were used to cultivate ZMM-3.The results showed that Zmm-3 formed fruiting bodies on straw and corn stalk substrates and the biological conversion rates were 11.18%and 22.30%,respectively.So corn stalk was the optimal material tocultivate ZMM-3.

Coprinus comatus;biological characteristics;identification

S646.1＋5

：A

：1002-2481（2017）01-0024-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.07

2016-07-29

山西省煤基重點科技攻關(guān)項目（FT2014-03-15）

曹晉良（1991-），男，山西保德人，在讀碩士，研究方向：資源微生物。韓建榮為通信作者。