色素腺體性狀不同棉花近等基因系的遺傳分析

渠云芳，段永紅，康娜娜，杜海燁，成 莎，黃晉玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

色素腺體性狀不同棉花近等基因系的遺傳分析

渠云芳，段永紅，康娜娜，杜海燁，成 莎，黃晉玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

采用SRAP標(biāo)記對(duì)色素腺體性狀不同棉花近等基因系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，39對(duì)SRAP引物組合對(duì)2對(duì)近等基因系材料共擴(kuò)增出304條帶，每對(duì)引物組合可以擴(kuò)增出5.69條多態(tài)性帶，多態(tài)性條帶比率達(dá)到73%；共擴(kuò)增出57條特異條帶，特異條帶比例達(dá)到18.9%。遺傳相似度分析結(jié)果表明，W1與Y1遺傳相似系數(shù)為0.740 3；Y2與W2的遺傳相似系數(shù)為0.763 6。聚類分析結(jié)果表明，在GS為0.85處，將參試材料分為2個(gè)類群，W1與Y1的遺傳相似系數(shù)比較大，歸為一類；W2與Y2的親緣關(guān)系比較近，歸為另一類。研究結(jié)果可為近等基因系親緣關(guān)系的鑒定以及為腺體基因的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

棉花；色素腺體；近等基因系；SRAP

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅是人類所需要的優(yōu)質(zhì)天然纖維的主要來(lái)源，而且其種子還是僅次于大豆、棕櫚樹、油菜、向日葵的蛋白資源和油料資源[1-3]。棉花整個(gè)植株上分布有呈不規(guī)則形狀的黑褐色色素腺體，色素腺體是錦葵科棉屬植物及其近緣物種所特有的器官[4]。由于色素腺體內(nèi)含有對(duì)人和反芻類動(dòng)物有害的物質(zhì)棉酚，因而被認(rèn)為是棉屬植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的防御器官，腺體的有無(wú)、多少與棉花對(duì)脅迫的反應(yīng)密切相關(guān)。目前，棉花色素腺體性狀已經(jīng)開始應(yīng)用于棉花的育種實(shí)踐[5]，一方面通過(guò)培育色素腺體多即棉酚含量高的棉花新品種，以提高棉花對(duì)病蟲害的抵抗性；另一個(gè)方面通過(guò)培育棉酚含量低的棉花新品種，以使得棉籽蛋白得以充分利用[6]。

SRAP標(biāo)記（Sequence-amplified polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性）是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)主要是針對(duì)開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增[7-8]。與其他分子標(biāo)記相比，SRAP具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率等特點(diǎn)，能應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳多樣性分析以及構(gòu)建遺傳圖譜[9]。SRAP現(xiàn)已應(yīng)用于許多植物的研究，孫紅葉等[10]以西府海棠S19雜交組合的F1為材料，采用SRAP標(biāo)記對(duì)BSA群體進(jìn)行了分析，最終選出了4條與耐鹽基因連鎖的分子標(biāo)記。葛海燕等[11]采用SRAP與SSR標(biāo)記相結(jié)合的方法，構(gòu)建了陸陸雜種遺傳連鎖圖，并且檢測(cè)到了1個(gè)與抗黃萎病相關(guān)的QTL。史紅麗等[12]采用SRAP標(biāo)記和SSR標(biāo)記相結(jié)合對(duì)47份桃樹進(jìn)行了遺傳多樣性分析，研究結(jié)果與形態(tài)學(xué)聚類相吻合。林忠旭等[13]用SRAP標(biāo)記對(duì)11份陸地棉材料進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明，在30個(gè)引物組合中有15個(gè)組合具有多態(tài)性，并得到了22個(gè)多態(tài)性條帶，顯示了較高的多態(tài)性比率。高建明等[14]對(duì)47個(gè)甜高粱品種進(jìn)行了SRAP指紋分析，結(jié)果建立了可以鑒定不同基因型的SRAP指紋圖譜，為以后的研究提供了參考依據(jù)。賀潤(rùn)麗等[15]采用SRAP方法對(duì)16個(gè)款冬居群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，其結(jié)果從分子水平揭示了不同種質(zhì)之間的遺傳差異。

目前，有關(guān)色素腺體形態(tài)解剖學(xué)方面的研究較多，而對(duì)色素腺體的遺傳規(guī)律、分布模式以及如何運(yùn)用這些規(guī)律調(diào)控或誘導(dǎo)腺體的發(fā)生還有待于進(jìn)一步探究[6]。棉花色素腺體性狀不同的近等基因系的培育，為腺體基因的深入研究提供了理想材料。SRAP分子標(biāo)記在棉花育種上已有所應(yīng)用，但運(yùn)用SRAP標(biāo)記對(duì)腺體性狀的研究還較少。

本研究以色素腺體性狀不同近等基因系為研究材料，采用SRAP標(biāo)記對(duì)參試材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在揭示近等基因系材料的親緣關(guān)系，為腺體基因的進(jìn)一步定位提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用材料均是從（亞洲棉（Gossypium arboreum）×比克氏棉（G.bickii））×陸地棉（G.hirsutum）3種雜種后代中，經(jīng)多代回交選育獲得的色素腺體性狀不同而穩(wěn)定的近等基因系（表1）。W1與Y1是一對(duì)近等基因系，W2與Y2是一對(duì)近等基因系。

表1 材料編號(hào)及性狀

1.2 方法

1.2.1 SRAP標(biāo)記分析方法

1.2.1.1 DNA的提取、純化和檢測(cè) DNA的提取參照CTAB法[16]，并略有改進(jìn)。

1.2.1.2 SRAP引物及其來(lái)源 SRAP分析所用引物參照LI等[7]發(fā)表的引物，由上海生工對(duì)所選引物進(jìn)行合成。引物序列列于表2。

表2 SRAP正向與反向引物序列

1.2.1.3 PCR擴(kuò)增與電泳 PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler熱循環(huán)儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體積為20μL：包括Buffer（含鎂離子）2μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，引物各0.4 μL，DNA3 μL，0.2 μLTag酶，雙蒸水補(bǔ)足20 μL。

PCR反應(yīng)程序參照LI等[7]介紹的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，觀察統(tǒng)計(jì)帶型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)SRAP電泳條帶，把同一位點(diǎn)上有帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”，缺失的記為“2”；采用NTSYS-pversion 2.11[17]軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花基因組DNA檢測(cè)

本試驗(yàn)采用改良CTAB法提取基因組DNA，待DNA溶解后，經(jīng)0.8%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖1）。從圖1可以看出，參試材料的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，主帶清晰且很集中，DNA信息完整，沒有拖尾現(xiàn)象，適合SRAP分析。

2.2 SRAP引物篩選及多態(tài)性分析

100對(duì)SRAP引物組合共篩選出39對(duì)擴(kuò)增條帶穩(wěn)定且多態(tài)性好的引物，對(duì)每對(duì)引物在參試材料中的擴(kuò)增情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，39對(duì)引物共擴(kuò)增出304條帶，其中，多態(tài)性條帶為222條，多態(tài)性條帶比例介于12.5%～100%，引物組合Me5-Em11，Me8-Em2等的多態(tài)性比例達(dá)到100%，而引物組合Me3-Em3，Me2-Em2的多態(tài)性比例僅為25%。引物不同，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)也不相同，擴(kuò)增條帶最少的為4條，最多的為16條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為7.79條；平均多態(tài)性條帶為5.69條，占73%（表3）。表明SRAP技術(shù)的多態(tài)性比較高，適合進(jìn)行遺傳多樣性分析。從圖2可以看出，材料W1與Y1以及W2與Y2之間存在有明顯的差異條帶。

表3 39個(gè)引物組合擴(kuò)增多態(tài)性

2.3 特異位點(diǎn)分析

39對(duì)引物組合對(duì)參試材料擴(kuò)增共產(chǎn)生57條特異條帶（表3）。不同引物組合對(duì)不同材料進(jìn)行擴(kuò)增，所產(chǎn)生的特異位點(diǎn)數(shù)量存在差異，特異條帶比例為0～57.1%，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生的特異條帶為1.46條，占18.9%。其中，有的引物組合沒有產(chǎn)生特異條帶，如Me5-Em3，Me2-Em1等；有的引物產(chǎn)生的特異條帶較多，可以達(dá)到5條，如Me8-Em2；其余引物擴(kuò)增產(chǎn)生的特異條帶介于1～4條。各個(gè)材料產(chǎn)生的特異條帶數(shù)也存在差異，有腺體材料擴(kuò)增產(chǎn)生的特異條帶為33條，無(wú)腺體材料擴(kuò)增產(chǎn)生的特異條帶為22條。利用這些特異條帶就可以進(jìn)一步對(duì)近等基因系進(jìn)行分析，為色素腺體基因的定位提供了依據(jù)。

2.4 遺傳相似性分析

利用軟件NTSYS對(duì)參試材料的遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果顯示，W1與Y1之間的遺傳相似系數(shù)為0.740 3，Y2與W2之間的遺傳相似系數(shù)為0.763 6（表4），均比理論值0.984 4低，可能是由于W1與Y1，W2與Y2雖然經(jīng)過(guò)多代回交，農(nóng)藝性狀上已達(dá)到一致，但在分子水平上，由于供體親本存在基因連鎖累贅現(xiàn)象，導(dǎo)致了近等基因系之間還存在比較大的差異。

表4 參試材料的遺傳相似系數(shù)（GS）

2.5 聚類分析

參試材料的聚類分析結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在GS為0.85處，將參試材料分為兩大類，材料W1與Y1由于其親緣關(guān)系比較近，歸為一類；材料W2與Y2由于是一對(duì)近等基因系，歸為另一類。

3 討論

3.1 色素腺體性狀不同棉花近等基因系近等性評(píng)價(jià)

近等基因系主要是通過(guò)回交而得[18]，它們之間除了目標(biāo)性狀外，絕大部分遺傳背景相似。課題組前期已對(duì)參試材料進(jìn)行了形態(tài)學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，參試材料除了在色素腺體性狀上存在差異外，其他農(nóng)藝性狀已基本穩(wěn)定。本研究采用SRAP對(duì)參試材料進(jìn)行了分子檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2對(duì)近等基因系遺傳多態(tài)性均比較高，W1與Y1的相似系數(shù)為0.740 3，Y2與W2的相似系數(shù)為0.763 6，但均低于理論值0.984 4，劉雅輝等[9]對(duì)23個(gè)小麥抗葉銹病近等基因系的SRAP分析結(jié)果表明，其參試材料之間的遺傳相似系數(shù)介于0.72～0.92，與本研究結(jié)果一致。理論上，近等基因系之間應(yīng)存在較低的遺傳多態(tài)性，而造成近等基因系之間遺傳多態(tài)性高的原因可能是由于分子檢測(cè)屬于一種抽樣檢測(cè)，不可能對(duì)全部位點(diǎn)進(jìn)行整體檢測(cè)，故存在一些位點(diǎn)被遺漏[19]。

3.2 SRAP技術(shù)在棉花近等基因系研究中的可行性

SRAP是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的又一種新的分子標(biāo)記[20]，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的優(yōu)點(diǎn)。伊艷杰等[21]采用240對(duì)SRAP引物對(duì)小麥感白粉病品種SF42與抗病品種ZB90進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有40%的引物組合能在抗感品種中擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。劉雅輝等[22]以Thatcher和23個(gè)以Thatcher為遺傳背景的小麥抗葉銹病的近等基因系以及Tclr與Thatcher雜交的F2植株為材料，采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)小麥抗葉銹病基因Lr19進(jìn)行研究，結(jié)果獲得了一個(gè)與小麥抗葉銹病基因相連鎖的SRAP標(biāo)記。楊在君等[23]采用SRAP標(biāo)記分析了小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出537條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)到49.5%。汪保華等[24]采用SRAP對(duì)3個(gè)黃褐棉近等基因系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，所選出的近等基因系與親本陸地棉相比，它們的遺傳背景基本相同，僅僅是在1，14，19號(hào)染色體上存在有黃褐棉的漸滲片段。本研究采用39對(duì)引物對(duì)參試材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，共擴(kuò)增出304條帶，產(chǎn)生222條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶率為73%，平均每個(gè)引物組合產(chǎn)生5.69條多態(tài)性條帶，并在參試材料中能擴(kuò)增出特異條帶，表明SRAP技術(shù)能夠揭示一些遺傳基礎(chǔ)的實(shí)質(zhì)，能夠?qū)⒋嬖诘牟町惓浞直憩F(xiàn)出來(lái)。

4 結(jié)論

本研究采用SRAP對(duì)2對(duì)色素腺體性狀不同的棉花近等基因系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，39對(duì)SRAP引物對(duì)2對(duì)近等基因系材料共擴(kuò)增出304條帶，多態(tài)性條帶達(dá)到222條，多態(tài)性條帶比率達(dá)到73%；共擴(kuò)增出57條特異條帶，特異條帶比例達(dá)到18.9%。遺傳相似度分析表明，W1與Y1遺傳相似系數(shù)為0.740 3，Y2與W2的遺傳相似系數(shù)為0.763 6。聚類分析結(jié)果表明，在GS為0.85處，將參試材料分為2個(gè)類群，W1與Y1的遺傳相似數(shù)比較大，歸為一類；W2與Y2的親緣關(guān)系比較近，歸為另一類。

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《山西農(nóng)業(yè)科學(xué)》編輯部

Genetic Analysis of Near-isogenic Lines with Different Pigment Glands on Cotton

QUYunfang，DUANYonghong，KANGNana，DUHaiye，CHENGSha，HUANGJinling
（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Near-isogenic lines with different pigment glands of cotton were analyzed by SRAP marker in this study.The result showed that a total of304 bands were amplified by39 SRAP primers combinations,5.69 bands with polymorphism were amplified by per primer combination.The ratio ofpolymorphic bands was 73%,57 bands（18.9%）were specific bands.The analysis ofgenetic similarity coefficients showed that the genetic similarity coefficient was 0.740 3 between W1 and Y1,the genetic similarity coefficient was 0.763 6 between W2 and Y2.The cluster analysis showed that the materials were divided into two groups at the similarity coefficient of 0.85,W1 and W2 were clusted firstly,because their genetic similarity was bigger,W2 and Y2 were clusted another group,because their genetic relationship was relative close.The result will provide evidence for the identification of genetic relationship from near-isogenic lines and further studyofpigment gland gene.

cotton;pigment gland;near-isogenic lines;SRAP

S562.03

：A

：1002-2481（2017）01-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.01

2016-11-24

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311004-3，20140311004-3）；棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（CB2015A20）

渠云芳（1973-），女，山西祁縣人，副教授，碩士，主要從事棉花遠(yuǎn)緣雜交與雜種優(yōu)勢(shì)利用研究工作。黃晉玲為通信作者。