豆科植物多花木藍(lán)抑菌活性成分研究

蘇 生, 張 莉, 杜文林, 胡華林, 楊 華,沈 玲, 韓永芬, 李

(1.貴州省草業(yè)研究所, 貴陽 550006; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 貴陽 550025; 3. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550002; 4. 延安大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 延安 716000; 5.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 西安 710048)

豆科植物多花木藍(lán)抑菌活性成分研究

(1.貴州省草業(yè)研究所, 貴陽 550006; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 貴陽 550025; 3. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550002; 4. 延安大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 延安 716000; 5.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 西安 710048)

活性追蹤下,采用柱層析分離多花木藍(lán)籽石油醚提取物中的抑菌活性物質(zhì)。采用生長速率法和牛津杯法,選取稻瘟病菌、辣椒枯萎病菌、油菜菌核病菌、梨黑星病菌為測試真菌,青枯菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽胞桿菌為測試細(xì)菌,測試了一級柱層析各流分的抑菌活性,測試結(jié)果顯示:A-4和A-5流分對所有測試菌均具有一定的抑菌活性,對梨黑星病菌的抑制作用最好,抑制率分別達(dá)到77.66%和74.67%;對青枯菌的抑菌圈最大,分別為1.37 cm和1.66 cm。分離出2個(gè)活性化合物,經(jīng)13C、1H NMR 波譜方法鑒定,為Balansenate Ⅰ、Ⅱ,為首次從該植物中分離得到。生測結(jié)果顯示2個(gè)化合物具有較低的抑菌活性,其對金黃葡萄球菌活性最好,但最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌(MBC)濃度均只為250 mg/L和500 mg/L。

多花木藍(lán); 抑菌活性; 活性化合物

病蟲草鼠害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大,故農(nóng)藥已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要生產(chǎn)資料,我國則已成為農(nóng)藥生產(chǎn)使用的世界第二大國。但是,隨著化學(xué)合成農(nóng)藥的使用,農(nóng)藥的負(fù)面效應(yīng)越來越嚴(yán)重,如環(huán)境污染、對人體健康的影響、“三R”問題等。從植物中提取的具有農(nóng)用活性的化合物與環(huán)境相容性好、對非靶標(biāo)生物安全,可用于解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中出現(xiàn)的病蟲害等問題[1],故其研究與開發(fā)已經(jīng)成為研發(fā)新農(nóng)藥的熱點(diǎn)之一[2]。

多花木藍(lán)IndigoferaamblyanthaCraib為豆科木藍(lán)屬植物,別名野藍(lán)枝、馬黃消、野綠豆樹(羅田)等,廣泛分布于我國南北方各省,生于海拔1 000 m以下山坡或灌叢中[3-4],對土壤要求不嚴(yán),具有較強(qiáng)的抗逆性,且未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的病蟲害,是邊坡恢復(fù)的良好物種。本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了多花木藍(lán)籽石油醚提取物具有良好的抑菌活性,并對其粗提物的化學(xué)成分進(jìn)行了分析[5],但具體的抑菌活性物質(zhì)一直未見報(bào)道。故本文在此基礎(chǔ)上,采用活性追蹤法,提取分離了多花木藍(lán)籽中的抑菌活性物質(zhì),并鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu),測試了其抑菌活性,以期為開發(fā)多花木藍(lán)為植物源抑菌劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物樣品

多花木藍(lán)于2013年10月采自貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山試驗(yàn)基地,經(jīng)貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室顧瑋副研究員鑒定為本品,陰干備用。

1.1.2 供試菌株

真菌:稻瘟病菌Magnaporthegrisea(Hebert) Barrnov.、辣椒枯萎病菌Fusariumoxysporum、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary、梨黑星病菌Venturiapyrina,均由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

細(xì)菌:青枯菌Ralstoniasolanacearum、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃葡萄球菌Staphylococcusaureus、綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis,均由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯土豆培養(yǎng)基(PDA):20%馬鈴薯,2%蔗糖,2%瓊脂,水100 mL,pH 6.0。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BPA):0.5%牛肉膏,1%蛋白胨,0.5%NaCl,水100 mL,pH 7.0～7.2,2%瓊脂。

Mueller-Hinton 肉湯培養(yǎng)基(MHB):牛肉粉 2.0 g,可溶性淀粉 1.5 g, 酸水解酪蛋白 17.5 g,pH 7.4±0.2,水 1 000 mL。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

RE 52-99型亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);BIC-250型人工氣候箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);XH-C渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);FA2204B萬分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);Agilent-NMR-inova400超導(dǎo)核磁共振譜儀;HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)。

1.2.2 試劑

石油醚(60～90℃)、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、二甲亞砜(DMSO)均為市售分析純試劑,薄層層析硅膠、柱層析硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品,重蒸水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取分離方法

將多花木藍(lán)籽1.0 kg粉碎(過20目篩),用5 000 mL石油醚超聲提取2 h,過濾,濾渣重復(fù)用5 000 mL石油醚提取2次,合并提取液,回收溶劑后得浸膏153.0 g。稱取150 g樣品進(jìn)行一級柱層析,硅膠(100～200目),柱層析(80 mm×1 200 mm),以石油醚∶二氯甲烷(10∶0,9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,0∶10)為流動(dòng)相梯度洗脫,每300 mL收集1份,TLC檢測,合并后得到A-1(1.345 2 g)、A-2(4.365 4 g)、A-3(14.368 4 g)、A-4(5.351 0 g)、A-5(6.315 2 g)、A-6(18.321 0 g)、A-7(33.234 1 g)、A-8(32.651 2 g)、A-9(5.324 6 g)、A-10(3.624 5 g)、A-11(2.369 4 g)、A-12(3.365 4 g)、A-13(1.365 2 g)?；钚詼y試結(jié)果顯示A-4和A-5具有抑菌活性,故采用二級柱層析分離A-4和A-5流分。準(zhǔn)確稱取A-4流分5.000 0 g,硅膠(200～300目),柱層析(20 mm×450 mm),以石油醚∶乙酸乙酯10∶1為流動(dòng)相,每30 mL收集1份,TLC檢測,得到化合物1(1.635 2 g)。準(zhǔn)確稱取A-5流分6.000 g,硅膠(200～300目),柱層析(20 mm×450 mm),以石油醚∶丙酮10∶2為流動(dòng)相,每30 mL收集1份,TLC檢測,得到化合物2(1.534 6 g)。測試化合物1和 2的抑菌活性。

1.3.2 抑菌活性測試方法

抑制真菌活性測試:將一級柱層析各流分樣品用一定量的DMSO溶解,再以PDA滅菌培養(yǎng)基稀釋成 2 000 mg/L的濃度,采用生長速率法測定其活性[6]。用十字交叉法測量菌落直徑,計(jì)算菌絲生長抑制率。

菌落生長直徑(mm)=3次直徑平均值 -

菌餅直徑(4.0 mm);

菌絲生長抑制率(%)=

抑制細(xì)菌活性測試:將一級柱層析各流分樣品溶解在適量DMSO中,加入少許吐溫-80,加水稀釋使DMSO含量為2.5%,使各流分濃度為2 000 mg/L,采用牛津杯法測試各流分抑制細(xì)菌活性[7]。用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

采用96孔板微量稀釋法測試純品抑制細(xì)菌的活性[8-9]：將供試樣品以DMSO溶解,再以水稀釋至2 000 mg/L的質(zhì)量濃度,MHB肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行2倍稀釋,使得DMSO含量為2.5%,以無菌水為陰性對照。無菌培養(yǎng)液和2.5% DMSO溶液為空白對照。微孔板振蕩混合后,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果,肉湯沒有渾濁的孔中的最低藥液質(zhì)量濃度為樣品對供試細(xì)菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC),取沒有渾濁的孔中的肉湯,接種于未加藥的培養(yǎng)基平板上,37℃培養(yǎng)12 h后取出觀察,沒有細(xì)菌生長的最低藥液質(zhì)量濃度為樣品對供試菌的最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)。所有活性測定均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 一級柱層析各流分抑菌活性測試結(jié)果

一級柱層析各流分抑制真菌生長活性測試結(jié)果顯示A-4、A-5對測試菌具有一定的抑制作用,其余流分均沒有顯示出抑制活性。A-4、A-5流分對真菌生長的抑制活性結(jié)果見表1。當(dāng)樣品濃度為2 000 mg/L時(shí),2個(gè)樣品在3 d 和7 d 后的抑菌活性沒有明顯的區(qū)別,其中對梨黑星病菌的活性最高,3 d 的抑制率分別為77.66%和75.29%,7 d 的抑制率分別為74.67%和73.41%,對其他植物病原菌的活性在不同時(shí)間段的活性均相當(dāng)。

表1 A-4和A-5流分對真菌生長的抑制活性1)

Table 1 Fungistatic activity of A-4 and A-5 fractions of the chromatography

菌種 Fungus抑制率/%(3d) Inhibitionratio(3d)A-4A-5抑制率/%(7d) Inhibitionratio(7d)A-4A-5稻瘟病菌Magnaporthegrisea61.24±0.0665.28±0.0663.88±0.0665.29±0.12辣椒枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum63.61±0.0663.61±0.1259.13±0.0664.52±0.10油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum68.19±0.0666.34±0.1565.94±0.0664.00±0.06梨黑星病菌Venturiapyrina77.66±0.1575.29±0.1074.67±0.7573.41±0.17

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。 Data are mean±SE from 3 replications.

一級柱層析各流分抑制細(xì)菌活性測試結(jié)果與抑制真菌生長活性相似,A-4、A-5具有一定的抑菌活性,其余流分均沒有顯示出抑制活性。A-4、A-5流分對細(xì)菌的抑制活性見表2。當(dāng)樣品濃度為2 000 mg/L時(shí),A-5流分對青枯菌的抑菌圈直徑最大,為1.66 cm,A-4流分對金黃葡萄球菌的抑菌圈直徑最小,為1.16 cm。

表2 A-4和A-5流分對細(xì)菌的抑制活性1)

Table 2 Antibacterial activity of A-4 and A-5 fractions of the chromatography

菌種Bacterialstrain抑菌圈直徑/cmDiameterofinhibitionzoneA-4A-5青枯菌Ralstoniasolanacearum1.37±0.151.66±0.12大腸桿菌Escherichiacoli1.37±0.061.37±0.12金黃葡萄球菌Staphyloccocusaureus1.16±0.151.20±0.17綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa1.43±0.151.27±0.21枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis1.33±0.061.47±0.21

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)之平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。 Data are mean±SE of 3 replications.

2.2 化合物1和2抑制細(xì)菌活性測試結(jié)果

化合物1和2抑制細(xì)菌活性測試結(jié)果見表3,由表可知,化合物1和2均具有較弱的抑菌和殺菌活性。2個(gè)化合物對金黃葡萄球菌的活性均最好,MIC和MBC值均為250 mg/L和500 mg/L,對其他測試菌的MIC和MBC值均為500 mg/L和1 000 mg/L。

2.3 化合物1和2的結(jié)構(gòu)

表3 化合物1和2對細(xì)菌的抑制活性測試結(jié)果

Table 3 The antibacterial activity of compound 1 and 2

菌種Bacterialstrain硫酸慶大霉素Gentamicinsulphate最小抑菌濃度/mg·L-1Minimuminhibitoryconcentration最小殺菌濃度/mg·L-1Minimumbactericidalconcentration化合物1Compound1最小抑菌濃度/mg·L-1Minimuminhibitoryconcentration最小殺菌濃度/mg·L-1Minimumbactericidalconcentration化合物2Compound2最小抑菌濃度/mg·L-1Minimuminhibitoryconcentration最小殺菌濃度/mg·L-1Minimumbactericidalconcentration青枯菌Ralstoniasolanacearum255050010005001000大腸桿菌Escherichiacoli1.563.1250010005001000金黃葡萄球菌Staphyloccocusaureus3.126.24250500250500綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa1.563.1250010005001000枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis1.566.2450010005001000

化合物1結(jié)構(gòu)見圖1,其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[10], 名稱為6,8,11-三甲基十二酸(2E)-3′-甲基-十六-2-烯酯,分子式為C32H62O2,該化合物首次從多花木藍(lán)中分離得到。

圖1 化合物1和2的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of compounds 1 and 2

化合物2結(jié)構(gòu)見圖1,其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[10], 名稱為17,18,19-三甲基十六酸(2E)-3′-甲基-十六-2-烯酯,分子式為C36H70O2,該化合物首次從多花木藍(lán)中分離得到。

3 討論

多花木藍(lán)籽石油醚提取物濃度為4 000 mg/L時(shí),其對多種植物病原真菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性,抑制率均可達(dá)到70%以上[5]。一級柱層析后,當(dāng)A-4、A-5流分濃度為2 000 mg/L時(shí),除梨黑星病菌外,對其他測試菌的抑制率均低于70%。一級柱層析后,活性化合物集中于A-4和A-5流分,然而其活性并未有顯著的提高。另外,2個(gè)酯類的活性化合物的MIC和MBC值也主要集中在500 mg/L和1 000 mg/L,其抑菌活性較弱。推測可能多花木藍(lán)籽石油醚提取物中存在一些具有增效作用的化合物,隨著分離程度的提高,增效物質(zhì)的含量降低,故其抑菌活性也降低,但是其具體的原因還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)前期曾報(bào)道了豆科植物多花木藍(lán)籽石油醚提取物具有一定的抑菌活性[5],在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)室在活性追蹤下分離出2個(gè)酯類活性化合物,它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)較簡單,但其表現(xiàn)出的抑菌活性較弱,故改造其化學(xué)結(jié)構(gòu),以期提高抑菌活性,是本課題組下一步將要研究的內(nèi)容。

[1] 徐蘇酩. 天然產(chǎn)物源農(nóng)藥和農(nóng)藥先導(dǎo)物[J]. 農(nóng)藥譯叢,1994(2):18-24.

[2] 單承鶯,馬世宏,張衛(wèi)明. 我國植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源,2011, 30(6):14-23.

[3] 中國科學(xué)院西北植物研究所編著. 秦嶺植物志[M].北京:科學(xué)出版社, 1981:34-35.

[4] 傅書遐. 湖北植物志[M]. 武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社, 2002:276-280.

[5] 毛心瑩,蘇生,曹紅旗,等. 多花木藍(lán)抑菌活性及其化學(xué)成分研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(15):48-52.

[6] Li Yan, Shen Binbin, Li Jun, et al. Antimicrobial potential and chemical constituent ofMikaniamicranthaH.B.K.[J]. African Journal of Microbiology Reasearch, 2013, 7(20): 2409-2415.

[7] 劉冬梅, 李理, 楊曉泉, 等. 用牛津杯測定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究與開發(fā)雜志, 2006(3): 110-111.

[8] Jorgensen J H.Invitroactivity of daptomycin against vancomycin-resistant enterococci of various van types and comparison of susceptibility testing methods [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2003, 47(12): 3760-3763.

[9] 李健強(qiáng), 李六金. 獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)[M]. 西安: 陜西科學(xué)技術(shù)出版社, 1999: 29-30.

[10]Yeh-Hsin Tsai, Ih-Sheng Chen, Ian-Lih Tsai. New long-chain esters and adenine analogs from the leaves of formosanBrideliabalansae[J]. Helvetica Chimica Acta,2003,86:2452-2457.

(責(zé)任編輯：田 喆)

Antimicrobial constituents ofIndigoferaamblyantha

Su Sheng1, Zhang Li1, Du Wenlin2, Hu Hualin3, Yang Hua4, Shen Ling5, Han Yongfen1, Li Yan3

(1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 2.SchoolofPharmacyofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 3.TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China; 4.SchoolofChemical&ChemicalEngineering,Yan’anUniversity,Yan’an716000,China; 5.SchoolofEnvironmentalandChemicalEngineering,Xi’anPolytechnicUniversity,Xi’an710048,China)

Antimicrobial constituents of the seeds ofIndigoferaamblyanthaCraib were isolated by using bioactivity-guided fractionation. The antimicrobial activity assays were designed against the fungiMagnaporthegrisea,Fusariumoxysporum，SclerotiniasclerotiorumandVenturiapyrinaby using the hyphal growth inhibition method and the bacteriaRalstoniasolanacearum,Escherichiacoli,Staphyloccocusaureus,PseudomonasaeruginosaandBacillussubtilisby using the disc method. The results showed that A-4 and A-5 fractions had higher bioactivity than others. Their inhibition ratios againstV.pyrinawere 77.66% and 74.67 %, respectively. The diameters of inhibition zone againstR.solanacearumwere 1.37 cm and 1.66 cm, respectively. Two compounds with antimicrobial activity were isolated and elucidated as Balansenate Ⅰ and Ⅱ mainly by1H and13C NMR spectral data. The results of bioassay showed that the MIC values and the MBC values of the two compounds againstS.aureuswere 250 and 500 mg/L, respectively.

Indigoferaamblyantha; antimicrobial activity; antimicrobial compound

2016-02-22

2016-03-29

貴州省自然科學(xué)基金(黔科合J字[2013]2154號);西安工程大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(BS1310)

S482.2 92

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.020

* 通信作者 E-mail:liyan1612@163.com