基于多克隆抗體包被磁性納米粒子的ELISA法檢測西維因

張 燦，崔涵雨，韓玉鳳，王現(xiàn)平，何 銘，陳 波，劉 源

基于多克隆抗體包被磁性納米粒子的ELISA法檢測西維因

張 燦1，崔涵雨1，韓玉鳳1，王現(xiàn)平1，何 銘1，陳 波2，劉 源2

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江藥品檢驗所，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

建立一種基于抗體包被氨基化Fe3O4磁性納米粒子，建立免疫磁珠酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法用于檢測氨基甲酸酯農(nóng)藥西維因。結果表明：在最佳條件下，西維因質量濃度在1×10－3～10 mg/L范圍內(nèi)，建立的免疫磁珠ELISA法具有較好的線性關系（y=8.87lnx＋72.77，R2=0.994），抑制率最高可達90.6%；測得的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.077 mg/L，檢出限（IC15）為1.48×10－3mg/L。以質量濃度1 mg/L的西維因在相同條件下重復檢測3 次，相對標準偏差為1.67%。以大米和卷心菜為實際樣品進行西維因加標回收率實驗，通過免疫磁珠ELISA法測得的回收率為70.5%～123.1%，同時采用高效液相色譜法進行相關性驗證，結果表明，2 種方法檢測結果的相關性較好（R2=0.91）。通過一系列分析表明，所建立的抗體包被磁性納米粒子ELISA法可用于快速檢測西維因。

西維因；免疫磁珠；酶標記免疫分析；檢測；相關性

西維因，1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯，屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥，20世紀50年代以其相對低毒、高效進入市場，成為繼有機磷農(nóng)藥后應用最廣泛的農(nóng)藥[1-3]。目前，西維因的檢測方法主要包括儀器分析[4-6]，以生物抗體為識別元件的免疫分析[7-9]和傳感器技術[10-12]。其中基于抗原抗體結合反應的免疫分析檢測具有靈敏度高、特異性強、檢測快速便捷的優(yōu)點，主要的檢測形式有酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法[13-14]和試紙快速檢測技術[15-16]。

免疫磁珠（immune magnetic beads，IMB）作為一種新型免疫分析方法，具備固相化試劑的特有優(yōu)點和免疫學高度專一性的特點，在醫(yī)學檢驗、微生物檢測等方面得到了廣泛的應用與發(fā)展[17-20]。IMB對物質的檢測有2 種方式：直接法和間接法。直接IMB法具有檢測流程簡單，步驟簡化，有效縮短檢測時間，適合應用于食品安全快速檢測領域[21-22]。

本研究通過合成西維因半抗原，將其與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原免疫動物制備西維因多克隆抗體。采用一步水熱法制備氨基功能化四氧化三鐵磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs），以戊二醛為偶聯(lián)劑將西維因抗體與四氧化三鐵MNPs結合作為IMB識別元件，以辣根過氧化物酶標記西維因半抗原制備酶標抗原為信號放大器，通過直接競爭實現(xiàn)對西維因的檢測，實驗過程如圖1所示。

圖1 IMB的制備及檢測過程Fig. 1 Schematic illustration of the preparation of IMB

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米、卷心菜 市購；西維因、克百威、異丙威、速滅威、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide，NHS）、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、對硝基苯氯甲酸酯、二氯甲烷、吡啶、四氫呋喃、乙二醇、己二胺、無水醋酸鈉、FeCl3·6H2O、25%戊二醛（均為分析純）上海百靈威化工科技有限公司；血藍蛋白、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）上海西格瑪試劑公司；α-萘酚、6-氨基己酸、無水硫酸鈉、甲醇、乙醇乙酸乙酯、石油醚、Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

W2-100SP旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；XSeries Ⅱ電感耦合等離子體質譜、傅里葉變換紅外分光光度計 美國賽默飛世爾公司；Cary 100-Bio紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；HH-A恒溫磁力攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠；FA1004電子天平 上海浦東榮豐科技儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；Inf nite 200多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 西維因抗原的合成

西維因半抗原的合成參照文獻[23]，合成目標化合物6-（1-萘氧基甲酰胺基）己酸。將目標物6-（1-萘氧基甲酰胺基）己酸和1.5 mmol/L NHS溶液，溶于5 mL N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）中，冰浴磁力攪拌條件下逐滴加入1.5 mmol/L DCC溶液，攪拌過程中有混濁物產(chǎn)生，反應6 h后，轉入4 ℃冰箱過夜。次日取出離心去除沉淀，將上層活化酯液加入到10 mL質量濃度為5 mg/mL BSA溶液（溶于0.01 mol/mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS））中，放于4 ℃攪拌反應5 h后裝入透析袋，4 ℃條件下PBS透析3 d，分裝備用，得到完全抗原。

1.3.2 抗體制備

西維因多克隆抗體為實驗室自制，選擇雄性新西蘭大耳白兔，體質量約2 kg，月齡3 個月，飼養(yǎng)于標準實驗動物房，連續(xù)觀察7 d，確定身體狀況正常后開始免疫。初次免疫劑量為1 mg完全抗原溶解于0.9% NaCl溶液0.5 mL，加入等量的弗氏完全佐劑充分混合乳化，采取背部皮下多點注射免疫。加強免疫時用不完全佐劑，免疫原劑量減半，每隔2 周加強免疫一次，4 次加強免疫后，血清效價達到平臺期進行頸動脈采全血。離心分離得到的血清采用Protein A-Sepharose 4B作親和層析介質純化得到抗體蛋白，采用紫外-可見分光光度計測定吸光度經(jīng)計算質量濃度為5 mg/mL。

1.3.3 IMB的制備

IMB的制備方法參照文獻[24]，第1步合成表面氨基功能化Fe3O4磁性納米材料，第2步以戊二醛為交聯(lián)劑將氨基化Fe3O4磁性納米材料與西維因抗體偶聯(lián)制備IMB。將10 mg氨基化，MNPs溶于10 mL PBS中，加入25%戊二醛溶液2.5 mL，于25 ℃條件下攪拌反應2 h。PBS洗滌3 次后用磁石收集，定容至10 mL，加入5 μmol/L抗體于37 ℃條件下攪拌2 h。PBS洗滌3 次后用磁石收集，得到質量濃度為1 mg/mL的IMB，于4 ℃貯存。

1.3.4 酶標抗原稀釋比例

西維因酶標抗原的制備步驟同1.3.1節(jié)，將活化酯溶液與載體蛋白HRP進行偶聯(lián)，得到西維因的酶標抗原。將150 μL制得的IMB加入1.5 mL離心管，將西維因酶標抗原用PBS稀釋成不同比例（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000），分別加入離心管，每個100 μL，37 ℃條件下振蕩反應一定時間，PBS洗滌，加入底物顯色。1.25 mol/L硫酸溶液終止后，通過多功能酶標儀測定吸光度。

1.3.5 反應平衡時間

將150 μL制得的IMB加入1.5 mL離心管，選取反應時間5、10、20、30、40、50、60、70、80 min，將西維因酶標抗原與1 mg/L西維因標準液各50 μL加入管中，37 ℃條件下振蕩反應，PBS洗滌，加入底物顯色。1.25 mol/L硫酸溶液終止后，通過多功能酶標儀測定吸光度。

1.3.6 IMB檢測農(nóng)藥西維因

酶標抗原稀釋比例及反應時間優(yōu)化后，建立IMB檢測農(nóng)藥西維因，通過測定得到吸光度計算抑制率，并繪制抑制標準曲線。待測物質量濃度與抑制率呈正比關系，通過測定吸光度，計算得到抑制率帶入抑制標準曲線確定待測物質量濃度。吸光度測定條件為：檢測波長450 nm，參比波長650 nm。抑制率按下式計算。

式中：ABlank、AControl、A[C]分別為空白、不含西維因和含有西維因的吸光度；[C]為西維因的質量濃度/（mg/L）。

1.3.7 交叉反應

選取速滅威、克百威和異丙威3 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥為結構類似物，進行交叉反應實驗。將150 μL制得的IMB加入1.5 mL離心管，將優(yōu)化質量濃度后的西維因酶標抗原與一系列不同質量濃度的西維因、速滅威、克百威和異丙威標準溶液各50 μL加入孔中，PBS洗滌2 次，加入150 μL TMB底物顯色，再加入50 μL 1.25 mol/L硫酸溶液終止后，通過多功能酶標儀測定吸光度，并計算抑制率。

1.3.8 實際樣品的測定

經(jīng)高效液相色譜檢測不含西維因的大米和卷心菜樣品進行添加回收率的測定。將樣品剪切成細碎狀，各稱取2 g，樣品添加西維因含量分別為0.05、0.5、1 mg/kg。用6 mL甲醇溶液浸沒，200 r/min條件下振蕩30 min，上清液過膜稀釋后與酶標抗原各50 μL加入裝有IMB的1.5 mL離心管，按優(yōu)化的反應條件，結果通過多功能酶標儀測定。

同時采用高效液相色譜法作為對照進行檢測結果的驗證，高效液相色譜的檢測方法參照文獻[25]，采用C18柱，以乙腈-水（2∶3，V/V）溶液為流動相，流速為1 mL/min。

2 結果與分析

2.1 實驗機理的研究

通過對西維因半抗原的合成目標化合物6-（1-萘氧基甲酰胺基）己酸進行質譜分析，m/z 324.35是M＋Na峰，m/z 625.00為2M＋Na峰，質譜結果顯示合成的物質與目標半抗原分子質量一致，表明半抗原目標化合物合成成功。采用直接競爭法，將西維因待測液與西維因酶標抗原同時與IMB上西維因抗體競爭結合，形成待測液-酶標抗原-抗體-IMB復合物，在外加磁場的作用下，復合物集聚在離心管底部，目標物質量濃度越高，酶標抗原結合越少，在底物作用下，顏色越淺，顯現(xiàn)出不同深淺的變化，如圖2所示，通過多功能酶標儀測得吸光度，繪制質量濃度-抑制曲線，達到定量檢測西維因。以未結合抗體的MNPs為參照，與IMB同時檢測西維因，結果如圖3所示，未結合抗體的MNPs對西維因沒有特異性吸附，不具有規(guī)律性的抑制率變化，而IMB對西維因具有規(guī)律性變化表明IMB對西維因的特異性吸附是由MNPs表面結合的抗體造成。

圖2 IMB檢測不同質量濃度西維因的結果示意圖Fig. 2 Results of IMB detection of different concentrations of carbaryl

圖3 MNPs和IMB檢測西維因的抑制率變化Fig. 3 Inhibition rates of MNPs and IMB for carbaryl detection

2.2 氨基化Fe3O4磁性納米材料的表征

選取一步水熱法制得的氨基化MNPs，采用傅里葉紅外分光光度計及透射電鏡對其進行表征，如圖4所示。從圖4a可以看出，氨基化MNPs的特征峰：756 cm－1處的強峰表明Fe—O官能團的存在；1 701、1 402 cm－1和1 118 cm－1分別是N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動，以上說明成功合成出帶有氨基功能基團的MNPs；從圖4b可以看出，氨基化MNPs具有較好的分散性且形態(tài)較完整。

圖4 磁性納米材料的傅里葉紅外光譜圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig. 4 FT-IR spectrum (a) and transmittance electron microscopy (TEM) (b) images of MNPs

2.3 酶標抗原稀釋比例的優(yōu)化

通過多功能酶標儀讀數(shù)，選取吸光度處于0.8～1.0之間所對應的酶標抗原稀釋比例。本實驗中酶標抗原稀釋比例為1∶4 000時吸光度為0.912 6，故選取1∶4 000為反應的最佳酶標抗原稀釋比例。

2.4 反應平衡時間的優(yōu)化

采用多功能酶標儀測定不同吸附時間條件下IMB的吸光度變化。在0～40 min，吸光度逐漸升高，說明隨著時間的延長，反應逐漸達到平衡，40 min后，吸光度變化趨于平緩，表明40 min時反應基本達到平衡。故選取40 min為最佳反應時間。

2.5 交叉反應測定

選擇速滅威、克百威和異丙威3 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行交叉反應，如圖5所示，IMB對目標物西維因的抑制率變化明顯高于其他3 種結構類似物，說明制備的IMB對西維因具有較高的特異識別性。

圖5 IMB對西維因、速滅威、克百威和異丙威的交叉反應Fig. 5 Cross-reactivity of IMB for the detection of carbaryl, metolcarb, carbfuran and isoprocarb

2.6 IMB檢測農(nóng)藥西維因

在本實驗優(yōu)化的最佳條件下，IMB測得西維因質量濃度在1×10－3～10 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關系（y=8.87lnx＋72.77，R2=0.994），抑制率最高可達到90.6%，如圖6所示，測得的西維因半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.077 mg/L，檢出限（IC15）為1.48×10－3mg/L。選取1 mg/L質量濃度的西維因在相同條件下重復3 次檢測，測得相對標準偏差為1.67%。

圖6 IMB檢測不同質量濃度西維因的抑制率變化Fig. 6 Inhibition rates of different concentrations of carbaryl detected by IMB

2.7 實際樣品中的應用

為了評價本實驗建立的方法的精確性，采用高效液相色譜方法作為對照，進行加標測定回收率實驗。如表1所示，IMB回收率在70.5%～123.1%之間。與高效液相色譜法具有較好的相關性（R2=0.91），如圖7所示。表明IMB方法可以用于大米和卷心菜樣中西維因的檢測。

表1 大米和卷心菜樣品中西維因的加標回收率結果（n==33）Table1 Spiked recoveries for carbaryl in rice and Chinese cabbage (n == 33))

圖7 IMB和HPLC檢測結果的相關性Fig. 7 Correlation curve between IMB and HPLC

3 結 論

人工合成西維因半抗原，將其與載體蛋白偶聯(lián)免疫新西蘭大耳白兔得到西維因多克隆抗體，純化得到質量濃度為5 mg/mL的抗體。一步水熱法制得的氨基化MNPs，通過透射電鏡和傅里葉紅外分光光度計對其進行表征。采用戊二醛法偶聯(lián)抗體和氨基功能化MNPs，以未包被抗體的MNPs為對照，檢測不同質量濃度西維因，包被有抗體的IMB顯現(xiàn)出有規(guī)律的變化且具有較好的抑制率而未包被抗體的MNPs未顯現(xiàn)一定規(guī)律，表明成功合成具有特異性吸附能力的IMB，且對西維因的檢測是由MNPs上包被的抗體所實現(xiàn)的。

通過優(yōu)化酶標抗原稀釋比例、反應平衡時間等條件，建立的IMB-ELISA法測得西維因質量濃度在1×10－3～ 10 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關系（y=8.87lnx＋72.77，R2=0.994），抑制率最高可達到90.6%，IC50為0.077 mg/L，檢出限（IC15）為1.48×10－3mg/L。以1 mg/L質量濃度的西維因在相同條件下重復3 次檢測，測得的相對標準偏差為1.67%。另外，以大米和卷心菜為實際樣品進行加標測定回收率實驗。采用高效液相色譜法為對照，建立的IMB-ELISA法測得的回收率在70.5%～123.1%之間，與高效液相色譜法得到的結果具有較好的相關性（R2=0.91）。通過一系列的實驗，得出結論：所建立的IMB-ELISA法能夠有效實現(xiàn)對西維因的快速檢測且該方法操作簡便快捷。

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Development of Immunoagnetic Bead-Based ELISA for the Detection of Carbaryl

ZHANG Can1, CUI Hanyu1, HAN Yufeng1, WANG Xianping1, HE Ming1, CHEN Bo2, LIU Yuan2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. Zhenjiang Institute for Drug Control, Zhenjiang 212000, China)

This paper develops an immunomagnetic bead-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of carbaryl. Under optimum conditions, the method exhibited a good linear relationship in the range of 1 × 10-3-10 mg/L, with a correlation coefficient (R2) of 0.994. The maximum inhibition rate reached 90.6%, and the halfmaximum inhibitory concentration (IC50) was 0.077 mg/L. The detection limit (LOD) of this method was 1.48 × 10-3mg/L. The precision for three replicate detections of carbaryl (1 mg/L) was 1.67% (relative standard deviation, RSD). The recovery of rice and Chinese cabbage spiked with carbaryl was between 70.5% and 123.1%. Also, it was found that the detection results were highly correlated with those obtained by high performance liquid chromatography (R2= 0.91). In conclusion, the immunomagnetic bead-based ELISA can be used for rapid detection of carbaryl.

carbaryl; immunomagnetic beads; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); detection; correlation

10.7506/spkx1002-6630-201702046

TS201.6

A

1002-6630（2017）02-0296-05

張燦, 崔涵雨, 韓玉鳳, 等. 基于多克隆抗體包被磁性納米粒子的ELISA法檢測西維因[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 296-300. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702046. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Can, CUI Hanyu, HAN Yufeng, et al. Development of immunoagnetic bead-based ELISA for the detection of carbaryl[J]. Food Science, 2017, 38(2): 296-300. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702046. http://www.spkx.net.cn

2016-06-01

國家自然科學基金青年科學基金項目（31000783）；鎮(zhèn)江市科技支撐項目（SH2014019）；江蘇大學2016年大學生實踐創(chuàng)新項目（136）

張燦（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：zhangcan@mail.ujs.edu.cn