微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)精準(zhǔn)定量檢測(cè)羊肉中摻雜豬肉

任君安，鄧婷婷，黃文勝，葛毅強(qiáng)，陳 穎,*

微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)精準(zhǔn)定量檢測(cè)羊肉中摻雜豬肉

任君安1,2，鄧婷婷2，黃文勝2，葛毅強(qiáng)1,3，陳 穎2,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045）

以羊和豬的單拷貝持家基因DNA復(fù)制蛋白A1為靶基因設(shè)計(jì)合成了適用于微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性引物和探針，通過理論推導(dǎo)獲得了單位質(zhì)量?jī)煞N肉基因拷貝數(shù)之比的固定值，并進(jìn)行了驗(yàn)證，據(jù)此將樣品中羊肉和豬肉的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而建立了羊肉中摻雜豬肉的精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法。該方法可以很好地應(yīng)用于羊肉中摻雜豬肉的含量檢測(cè)，豬肉的最低定量限為1%，在5%～80%范圍內(nèi)絕對(duì)誤差小于±1.30%，相對(duì)誤差小于±10%，定量結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性高，可以為肉類摻假的監(jiān)管工作提供有力的技術(shù)參考。

羊肉；豬肉；精準(zhǔn)定量；微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

近年來，世界各地肉制品摻假情況頻繁發(fā)生，2013年，歐洲多國在部分牛肉產(chǎn)品中檢出馬肉成分，爆發(fā)了所謂的馬肉風(fēng)波[1]。在我國，隨著生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)動(dòng)物蛋白的需求也日益增加，食用蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高的牛羊肉成了新的發(fā)展趨勢(shì)[2]。與此同時(shí)，肉類產(chǎn)品標(biāo)注信息與實(shí)際不符的情況也隨之而來，如用豬肉等營養(yǎng)價(jià)值較低的廉價(jià)肉類摻入或代替羊肉等[3]。這種摻假行為不僅擾亂肉業(yè)市場(chǎng)秩序，損害消費(fèi)者利益，甚至可能侵犯消費(fèi)者的宗教信仰[4-5]。為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，全球不同國家和地區(qū)對(duì)肉制品的標(biāo)識(shí)做了一系列規(guī)定。歐盟定量成分聲明強(qiáng)制要求肉制品需要標(biāo)識(shí)出所有成分及其凈含量，并規(guī)定肉的主要成分為骨骼肌，結(jié)締組織和脂肪等成分需單獨(dú)列出且規(guī)定了最高含量，這是最嚴(yán)格的肉類成分標(biāo)識(shí)制度[6]。目前，肉制品中動(dòng)物物種成分的檢測(cè)多集中在定性或半定量檢測(cè)方面[7-10]，然而隨著摻假手段的不斷變化，實(shí)際應(yīng)用中對(duì)肉制品真實(shí)含量的檢測(cè)需求卻越來越多，定量檢測(cè)逐漸成為了新的發(fā)展趨勢(shì)。Iwobi等[11]通過構(gòu)建哺乳動(dòng)物和禽類的內(nèi)標(biāo)基因，以物種特異基因和通用內(nèi)標(biāo)基因的Ct值比值完成對(duì)不同物種的定量檢測(cè)。López-Andreo等[12]通過構(gòu)建等質(zhì)量的多種肉混合樣品，進(jìn)行了混合樣品中各種肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的定量。然而這些方法均采用的是實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，通過擴(kuò)增獲得的Ct值推導(dǎo)出各個(gè)基因的拷貝數(shù)，并以此轉(zhuǎn)化為肉的質(zhì)量。但該Ct值受PCR擴(kuò)增效率及DNA溶液中雜質(zhì)的影響，由此值推導(dǎo)出的基因拷貝數(shù)與樣品中的實(shí)際基因拷貝數(shù)偏差較大，從而加大了定量結(jié)果的偏差。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的定量技術(shù)，可直接測(cè)得樣品中目標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)，目前已應(yīng)用于基因表達(dá)量[13]、微生物豐度[14]、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量[15]及食品成分的定量檢測(cè)[16]。René等[17]以轉(zhuǎn)基因大豆為樣品，比較了多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)與微滴數(shù)字PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)微滴數(shù)字PCR定量的不確定度低于17%，效果優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光PCR。

目前，已有學(xué)者將ddPCR應(yīng)用于肉類摻假的定量[18-19]，然而，肉類定量檢測(cè)難點(diǎn)在于如何將PCR擴(kuò)增得到的基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換成肉的質(zhì)量。這是因?yàn)椴煌N肉的細(xì)胞密度（每克組織中的細(xì)胞數(shù)量）和基因組大小不同，即便是等質(zhì)量不同肉種其DNA得率（基因拷貝數(shù)）也不同。若直接將其拷貝數(shù)之比作為質(zhì)量之比，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)較大偏差[20]。Cai Yicun[18]和苗麗[19]等采用數(shù)字PCR方法，先將基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為DNA質(zhì)量，再從DNA質(zhì)量換算為肉的質(zhì)量。由于該方法需要建立兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、工作量大，且進(jìn)行兩步轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)誤差加大。

本實(shí)驗(yàn)以單拷貝持家基因D N A復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA1）為靶基因，開展了豬肉、羊肉摻假的ddPCR定量檢測(cè)研究。通過理論推導(dǎo)獲得單位質(zhì)量?jī)煞N肉的基因拷貝數(shù)之比的固定值，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了不同含量肉種該值的穩(wěn)定性，并利用該值實(shí)現(xiàn)了基因拷貝數(shù)比與質(zhì)量比的轉(zhuǎn)換，建立了羊肉中摻雜豬肉成分的精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法，以期為肉制品摻假定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定，為肉制品市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊、牛、驢、豬、雞、鴨、鵝、火雞、兔等肉類樣品以及羊肉串、羊肉餃子、羊肉卷、醬羊蹄、羊肉腸和孜然羊肉粒 市售；狐貍、狗、馬等樣品來自本實(shí)驗(yàn)室。

擴(kuò)增預(yù)混液（ddPCRTMSupermix for probes）、微滴生成專用油、微滴生成卡 美國Bio-Rad公司；引物和探針 英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；其他常用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Rad QX200 ddPCR生成儀和讀數(shù)儀、T100 PCR儀美國Bio-Rad公司；高速離心機(jī) 美國Thermo公司；組織研磨機(jī) 美國Qiagen公司；紫外分光光度計(jì) 德國Eppendorf公司；電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；絞肉機(jī) 上海西貝樂電器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

豬羊混合樣品制備：取羊和豬的背長肌，分別用絞肉機(jī)絞碎。稱取豬肉20 g和羊肉5 g，將兩者均勻混合配制成含有80%豬肉成分的羊肉樣品；將上述樣品與羊肉按照3∶1的比例混合配制成含有60%的豬肉成分的羊肉樣品。同樣地，依次配制成含有50%、30%、10%、5%和1%豬肉成分的羊肉樣品，參照Wang Wei等[21]的方法提取DNA。

市售羊肉樣品制備：稱取羊肉串、羊肉餃子餡、羊肉卷、羊肉腸和孜然羊肉粒各20 g，用絞肉機(jī)絞碎，從中稱取200 mg，參照Wang Wei等[21]的方法提取DNA。

1.3.2 引物與探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的牛、驢、雞、鴨、鵝、火雞、兔、狐貍、狗、馬、山羊、綿羊和豬等13個(gè)物種的持家基因RPA1基因DNA序列，進(jìn)行同源序列比對(duì)，運(yùn)用Primer Express 5.0軟件，在羊和豬的特異性區(qū)域設(shè)計(jì)數(shù)字PCR引物和探針。引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列Table1 Primer and probe sequences for ddPCR assays

1.3.3 數(shù)字PCR檢測(cè)

ddPCR反應(yīng)體系為：ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），探針0.5 μL（10 μmol/L），DNA模板（10～100 ng/μL）5 μL，加雙蒸水補(bǔ)足總體積至20 μL。反應(yīng)體系充分混勻后加入微滴生成卡中，油包水微滴生成按照廠家的操作說明進(jìn)行。

將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入96 孔PCR反應(yīng)板中，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR包括3 個(gè)步驟：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，45個(gè)循環(huán)；98 ℃固化微滴10 min。最后用微滴分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.3.4 單位質(zhì)量羊肉與豬肉基因拷貝數(shù)比值的確定和驗(yàn)證

肉的質(zhì)量與樣品DNA溶液中RPA1的基因拷貝數(shù)及單位質(zhì)量的基因拷貝數(shù)有關(guān)，如式（1）所示：

式中：M為肉的質(zhì)量；Q為基因拷貝數(shù)；C為單位質(zhì)量肉的基因拷貝數(shù)。因此，不同肉種的質(zhì)量比則應(yīng)為式（2）：

式中：Mp和Mm分別為豬肉和羊肉的質(zhì)量；Qp和Qm分別為混合樣品中豬肉和羊肉的基因拷貝數(shù)；Cp和Cm分別為單位質(zhì)量豬肉和羊肉的基因拷貝數(shù)。

由于同一肉種的細(xì)胞密度和基因組大小是固定的，因此，對(duì)任何肉種而言，其Cm/Cp均為常數(shù)。只要測(cè)得混合樣品中各成分的基因拷貝數(shù)，結(jié)合Cm/Cp這一常數(shù)，即可計(jì)算出混合肉樣中各組分的比例。

為計(jì)算Cm/Cp，采用數(shù)字PCR分別定量檢測(cè)豬肉含量為1%、10%、50%、60%和80%的羊肉樣品中兩種肉的RPA1基因拷貝數(shù)，并計(jì)算Cm/Cp和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

3.身體和環(huán)境是認(rèn)知的構(gòu)成。傳統(tǒng)認(rèn)知心理學(xué)并不否認(rèn)環(huán)境在認(rèn)知過程中的作用，但具身認(rèn)知理論認(rèn)為身體和世界在認(rèn)知加工中扮演了某種構(gòu)成性的（constitutive）的角色，而不僅僅是因果作用的角色［2］，即身體和環(huán)境不僅僅是認(rèn)知的因果關(guān)系，更是認(rèn)知的構(gòu)成部分，其造就了某種認(rèn)知的結(jié)果。

為進(jìn)一步確定Cm/Cp在單一質(zhì)量下的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，稱取6 份50%豬肉含量的羊肉樣品，根據(jù)1.3.1節(jié)進(jìn)行樣品處理并提取基因組DNA，通過建立的數(shù)字PCR擴(kuò)增體系，測(cè)得豬肉和羊肉的RPA1基因拷貝數(shù)，每份混合樣品重復(fù)3 次，分別取豬肉和羊肉基因拷貝數(shù)的平均值計(jì)算其比值，并以此計(jì)算Cm/Cp和RSD。

1.3.5 定量線性范圍和方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證

采用1.3.4節(jié)確定的單位質(zhì)量下羊肉與豬肉基因拷貝數(shù)之比，將數(shù)字PCR測(cè)得的豬肉含量為1%～80%的樣品中豬肉和羊肉的拷貝數(shù)分別轉(zhuǎn)換為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以測(cè)量值和真實(shí)值做線性范圍關(guān)系曲線，并計(jì)算其相關(guān)系數(shù)R2。

以10%、5%和1%豬肉含量的羊肉樣品為模擬樣品，每個(gè)樣品重復(fù)6 次，同時(shí)檢測(cè)豬肉和羊肉RPA1基因拷貝數(shù)，并通過確定的Cm/Cp將其轉(zhuǎn)化為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算各樣品6 次重復(fù)的平均值、RSD、絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差，確定定量方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1.3.6 市售羊肉樣品的檢測(cè)

14 份市售羊肉樣品（包括羊肉串、羊肉餃子、羊肉卷、羊肉腸、孜然羊肉粒）提取DNA，用建立的ddPCR擴(kuò)增體系，測(cè)得樣品中羊和豬RPA1基因拷貝數(shù)，并通過1.3.4節(jié)確定的單位質(zhì)量下豬肉與羊肉拷貝數(shù)的比值計(jì)算其質(zhì)量百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性實(shí)驗(yàn)

圖1 羊特異性引物探針數(shù)字PCR篩選Fig. 1 Screening of mutton- and goat-specific primers and probes

圖2 豬特異性引物探針數(shù)字PCR篩選Fig. 2 Screening of pork-specific primers and probes

通過數(shù)字PCR對(duì)羊肉、豬肉等13 種肉類的DNA擴(kuò)增結(jié)果顯示，羊的引物探針特異性良好，可以同時(shí)擴(kuò)增出綿羊肉和山羊肉，且其他肉類樣品均沒有擴(kuò)增（圖1）；豬肉的引物探針只對(duì)目標(biāo)樣品豬肉有擴(kuò)增，其余12 種肉類樣品均沒有擴(kuò)增（圖2）。以上結(jié)果說明表1中的引物和探針均能有效擴(kuò)增靶標(biāo)物種的RPA1基因，且對(duì)其他非目標(biāo)物種無擴(kuò)增。兩組引物探針的特異性良好，可以用于后續(xù)的ddPCR定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

分別檢測(cè)豬肉含量為1%、10%、50%、60%和80%的5 個(gè)樣品中豬、羊肉的RPA1基因拷貝數(shù)，并計(jì)算豬肉與羊肉二者的質(zhì)量比與基因拷貝數(shù)之比的比值（表2）。結(jié)果表明，5 個(gè)不同豬肉含量樣品的Cm/Cp平均值為1.84，RSD為3.50%，Cm/Cp的穩(wěn)定性較高。因此實(shí)驗(yàn)證明，無論羊肉和豬肉含量如何變化，Cm/Cp一直為1.84穩(wěn)定不變。

表2 不同豬肉含量時(shí)的Cm與Cp及Cm/CpTable2 The ratio of copy numbers of unit mass in different pork proporttiioonnss

表 33 5500%豬肉含量時(shí)Cm和Cp及Cm/CpTable3 Copy numbers per unit mass of pork and mutton and their ratios att 5500% pork content

為進(jìn)一步驗(yàn)證Cm/Cp的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，采用建立的數(shù)字PCR體系，分別檢測(cè)6 份50%豬肉含量的平行樣品中豬肉和羊肉RPA1基因拷貝數(shù)的3 次均值，計(jì)算等質(zhì)量條件下兩種肉基因拷貝數(shù)的比值Cm/Cp，并計(jì)算6 份平行樣品的Cm/Cp均值。結(jié)果顯示，單位質(zhì)量下羊肉與豬肉拷貝數(shù)之比為1.84，6份平行樣品的結(jié)果穩(wěn)定，RSD在1%以內(nèi)，沒有顯著性差異（P＞0.05）（表3）。因此，不論羊肉與豬肉含量產(chǎn)生變化還是單一質(zhì)量多次重復(fù)，單位質(zhì)量條件下Cm/Cp均為1.84，利用該比值可以將基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 定量線性范圍、準(zhǔn)確度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 豬、羊混合模擬樣品中豬肉含量的定量線性范圍Fig. 3 Linear quantitation range of pork content in binary mixture

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，選擇豬肉含量為10%、5%和1%的豬、羊低濃度混合樣品進(jìn)行定量準(zhǔn)確度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6 次，結(jié)果見表4結(jié)果表明：豬肉含量為10%的樣品實(shí)際測(cè)量平均值為9.96%，相對(duì)誤差為－0.41%，RSD為4.59%；5%樣品豬肉含量實(shí)際測(cè)量平均值為4.62%，誤差為－7.51%，RSD為6.68%；1%樣品豬肉含量實(shí)際測(cè)量平均值為1.17%，RSD為9.73%。豬肉含量為10%和5%的樣品相對(duì)誤差低于±7.51%，1%樣品的相對(duì)誤差為16.82%，由于目前摻假行為多是經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)型摻假，摻假含量較高，因此該方法符合常見摻假事件的定量檢測(cè)。此外，3 組低含量樣品中豬肉含量的RSD均小于10%，遠(yuǎn)低于國際食品法典委員會(huì)關(guān)于食品定性和定量檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)方針中所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（＜25%）[22]，定量重復(fù)性符合食品打假執(zhí)法的需要。

表4 羊肉中摻雜豬肉成分的定量準(zhǔn)確度和重復(fù)性分析Table4 Quantitative accuracy and repeatability of pork content incorporated into mutton

2.4 市售羊肉制品的定量檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測(cè)市售羊肉串、羊肉餡、羊肉卷、羊肉餡餃子以及羊肉腸等14 份標(biāo)識(shí)為純羊肉制品中的羊肉和豬肉的相對(duì)含量，結(jié)果表明所有樣品經(jīng)DNA提取和微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增后，均能夠檢測(cè)出羊肉和/或豬肉含量（表5）。羊肉餡、羊肉串、羊肉餡餃子和羊肉腸中檢測(cè)出豬肉成分，占樣品總數(shù)的35.7%。其中，12號(hào)樣品羊肉腸中未見羊肉成分，只有豬肉，1號(hào)和7號(hào)樣品中除了羊肉，還添加有20%～60%的豬肉。11號(hào)和14號(hào)樣品檢出的豬肉含量低于本方法的定量低限，推斷可能是污染導(dǎo)致。

表5 市售羊肉制品中羊肉和豬肉成分相對(duì)含量的檢測(cè)結(jié)果Table5 The relative contents of pork and mutton in commercial samples assayed by the ddPCR method

3 討 論

數(shù)字PCR在定量檢測(cè)方面精準(zhǔn)度更高，與基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，數(shù)字PCR技術(shù)使用終點(diǎn)法檢測(cè)，不依賴于Ct值（熒光強(qiáng)度達(dá)到指定值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)），是一種可以測(cè)定絕對(duì)拷貝數(shù)的DNA精確定量技術(shù)，避免了不同樣品之間的擴(kuò)增效率變化而導(dǎo)致的定量結(jié)果不準(zhǔn)確[15]。K?ppel等[23]報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光PCR方法在最低含量為1%時(shí)的相對(duì)誤差最高為65%。與之相比，本方法能準(zhǔn)確獲得靶基因的絕對(duì)拷貝數(shù)并轉(zhuǎn)化為其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，因此在最低檢測(cè)限為1%時(shí)的相對(duì)誤差更小，低于17%，有效提高了定量的檢測(cè)低限及其準(zhǔn)確性。

本研究選擇單拷貝持家基因作為目的基因，其拷貝數(shù)不會(huì)因物種性別、年齡和部位發(fā)生變化，是良好的定量靶標(biāo)，確保了定量的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。Floren等[16]以ddPCR技術(shù)為基礎(chǔ)，分別選用線粒體cyt b基因和單拷貝持家基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物探針，發(fā)現(xiàn)多拷貝的線粒體基因在同種肉的不同組織中差異為6 倍。而Rodriguez等[24]也發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物的性別、年齡或組織器官的不同也會(huì)影響線粒體DNA豐度，而單拷貝持家基因在所有細(xì)胞中拷貝數(shù)恒定，其數(shù)量與樣品質(zhì)量有較好的線性關(guān)系。

在肉類定量檢測(cè)中，除了需要準(zhǔn)確獲得靶基因的絕對(duì)拷貝數(shù)外，將測(cè)得的靶基因相對(duì)豐度轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵之處。本研究通過理論推導(dǎo)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后得到了單位質(zhì)量下兩種肉的基因拷貝數(shù)之比為一固定值，而K?ppel等[23]學(xué)者通過實(shí)時(shí)熒光PCR得到的Ct值推測(cè)出各物種基因拷貝數(shù)與其所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果吻合。苗麗等[19]建立的ddPCR方法也可將基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為質(zhì)量，但其為兩步轉(zhuǎn)換，加大了定量誤差，最低可定量到5 mg（5%含量）樣品時(shí)，誤差最高達(dá)13.2%。本研究建立的方法利用兩種肉基因拷貝數(shù)之比這一固定值，一步實(shí)現(xiàn)了基因拷貝數(shù)之比與質(zhì)量之比的轉(zhuǎn)化，在定量5%豬肉含量時(shí)的相對(duì)誤差為－7.5%，且最低定量檢測(cè)限為1%，既簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，又提高了定量的準(zhǔn)確性和檢測(cè)低限。

ddPCR為肉制品摻假精準(zhǔn)定量提供了有力的技術(shù)手段，本研究表明通過理論推導(dǎo)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了單位質(zhì)量下豬肉與羊肉拷貝數(shù)之比，使數(shù)字PCR測(cè)得的基因拷貝數(shù)可以直接轉(zhuǎn)換為各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，定量結(jié)果準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法不僅可以定量羊肉中摻雜豬肉，也可以應(yīng)用于其他肉類及其他食品摻假的定量檢測(cè)，為執(zhí)法部門判定肉產(chǎn)品及其他食品中摻假還是無意污染、打擊食品摻假現(xiàn)象及食品安全犯罪量刑等提供技術(shù)支撐。隨著數(shù)字PCR技術(shù)的日益發(fā)展，定量檢測(cè)食品中的動(dòng)物源性成分將會(huì)成為我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展的必然趨勢(shì)，為我國肉制品摻假的市場(chǎng)監(jiān)管和相關(guān)執(zhí)法提供有力的技術(shù)保障。

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A Precise Quantitative Assay for Measuring Pork Incorporated into Mutton Products by Droplet Digital PCR

REN Jun’an1,2, DENG Tingting2, HUANG Wensheng2, GE Yiqiang1,3, CHEN Ying2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China; 3. China Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China)

The adulteration of meat products happened frequently in recent years, and authentication of meat products is necessary to protect consumers from an inferior product with a false description. Although at present, there are numerous qualitative methods for meat species identification, fewer quantitative detection methods have been reported. Herein, a droplet digital PCR method for the quantitative determination of pork incorporated in mutton products was developed. The single copy house-keeping gene encoding replication protein A1 (PRA1) was chosen as the target to design species-specific primers and probes for mutton and pig, respetively. Each assay was proved specific to the target species, respectively. The ratio constants between copy numbers and unit mass of pork and mutton were obtained by theoretical analysis and then verified by experiments. Consequently, the relative mass fractions of pork and mutton in the sample were measured based on the DNA copy numbers. The limit of quantitation (LOQ) of the method was confirmed to be 1%. The results showed that the absolute error was less than ±1.3%, and the relative error was less than ±10% in the range of pork proportion from 5% to 80%. The method developed in this paper was successfully applied to quantitate pork content incorporated into commercial mutton products and it may be useful for food administration laboratories to carry out meat species quantification in raw and processed foods.

mutton; pork; quantitative determination; droplet digital PCR (ddPCR)

10.7506/spkx1002-6630-201702049

TS207.3

A

1002-6630（2017）02-0311-06

任君安, 鄧婷婷, 黃文勝, 等. 微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)精準(zhǔn)定量檢測(cè)羊肉中摻雜豬肉[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 311-316. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702049. http://www.spkx.net.cn

REN Jun’an, DENG Tingting, HUANG Wensheng, et al. A precise quantitative assay for measuring pork incorporated into mutton products by droplet digital PCR[J]. Food Science, 2017, 38(2): 311-316. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702049. http://www.spkx.net.cn

2016-05-14

中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2014JK027）；“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0401104）

任君安（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)與控制。E-mail：renja126@126.com

*通信作者：陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全與控制。E-mail：chenyingcaiq@163.com