基于PCR-DGGE分析不同品牌郫縣豆瓣醬真菌多樣性

朱永清，李治華，李華佳，王雪濤，董 玲，黃巧蓮

基于PCR-DGGE分析不同品牌郫縣豆瓣醬真菌多樣性

朱永清，李治華，李華佳，王雪濤，董 玲，黃巧蓮

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

以不同品牌的郫縣豆瓣醬為研究對象，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳免培養(yǎng)技術(shù)分析樣品中微生物真菌菌群結(jié)構(gòu)，并對典型條帶進(jìn)行測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明：郫縣豆瓣醬真菌菌群種類較豐富，不同品牌的郫縣豆瓣醬真菌菌群既包含共有菌群又存在一定差異。假絲酵母（Candida sp.）、曲霉（Aspergillus）、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、奧默柯達(dá)酵母菌（Kodamaea ohmeri）是優(yōu)勢種群，尤其是黃曲霉（Aspergillus f avus）共有10 個條帶，占整個測序條帶32.25%，表明郫縣豆瓣醬的生產(chǎn)應(yīng)特別注意防控黃曲霉。

郫縣豆瓣；真菌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳；多樣性

郫縣豆瓣醬因產(chǎn)于四川省成都市的郫縣而得名，已有近300年歷史，因其獨特的風(fēng)味聞名于世[1]。2008年，“郫縣豆瓣傳統(tǒng)制作技藝”被列為國家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄，是到目前為止涉及川菜的唯一的國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。郫縣豆瓣制作工藝較為復(fù)雜，主要包括制椒、制瓣、后熟等過程，制椒即紅辣椒經(jīng)鹽漬制成辣椒胚；制瓣即蠶豆制曲后制成甜豆瓣；后熟即辣椒胚和甜豆瓣按一定比例混合入缸經(jīng)較長時間（6 個月以上）的翻、曬、露后熟發(fā)酵，然后制成成品。

郫縣豆瓣醬風(fēng)味物質(zhì)的形成十分復(fù)雜，其來源主要是原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、脂類等大分子物質(zhì)經(jīng)微生物酶水解后產(chǎn)生的各種次級產(chǎn)物和小分子最終產(chǎn)物[2]。微生物對郫縣豆瓣風(fēng)味品質(zhì)的形成起著重要作用，一方面，不同種類的微生物所具有的酶系不同，代謝產(chǎn)物就有所差異，這就導(dǎo)致產(chǎn)品的風(fēng)味有所不同[3-4]；另一方面，微生物菌群新陳代謝所產(chǎn)生的揮發(fā)性成分是產(chǎn)品中香味物質(zhì)的主要來源之一[4-7]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)手段主要基于培養(yǎng)基的選擇，具有很大的局限性，而據(jù)估計大部分微生物是不可培養(yǎng)的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）作為一種有效的免培養(yǎng)方法，基于DNA分析，可以有效避免上述不足[8]。前人已將該方法應(yīng)用到泡菜[9]、豆醬[10]、醬油[11]、鎮(zhèn)江香醋[12]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物菌群的分析上。

本研究采用PCR-DGGE研究不同品牌的成品郫縣豆瓣真菌多樣性，加深對郫縣豆瓣微生物菌群的認(rèn)識，為郫縣豆瓣醬安全性及改進(jìn)生產(chǎn)工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13 個郫縣豆瓣醬樣品分別購自四川省郫縣不同廠家，均為傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)，分別編號為S1～S13。

Gel Extraction Kit試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；溶菌酶 美國Amresco公司；蛋白酶K 德國Merck公司；PCR mixture 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R冷凍高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀 美國Bio-Rad公司。1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣醬中微生物總DNA的提取

參考李治華等[13]的方法提取郫縣豆瓣醬中微生物的總DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

第1輪PCR以基因組DNA為模板擴(kuò)增18S rRNA全序列，瓊脂糖凝膠電泳膠回收之后以18S rRNA基因為模板擴(kuò)增SSU rRNA。第1輪PCR引物序列為[10]：FR1（5’-AICCATTCAATCGGTAIT-3’）、NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）；體系（50 μL）為：模板D N A 4 μ L、上下游引物各2 μ L、2×Taq PCR MasterMix（包含500 μmol/L dNTP、0.1 U/μL Taq聚合酶、20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl 和 3 mmol/L MgCl2）25 μL、ddH2O 17 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性8 min，95 ℃變性30 s，47 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。陰性對照用ddH2O作為模板。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并進(jìn)行結(jié)果分析，然后切膠回收，回收后的DNA作為第2輪PCR的模板。

第2輪PCR引物序列為[10]：FR1-GC（5’-CC CCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGCCGAICCATTCAATCGGTAIT-3’），F(xiàn)F390（5’-CGATAACGAACGAGACCT-3’）；體系（50 μL）為：模板DNA 4 μL、上下游引物各2 μL、2×Taq PCR MasterMix（包含500 μmol/L dNTP、0.1 U/μL Taq聚合酶、20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl和 3 mmol/L MgCl2）25 μL，ddH2O 17 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性8 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。陰性對照用ddH2O作為模板。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.3 DGGE及數(shù)據(jù)分析

制備8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%～65%，呈線性增加，梯度方向與電泳方向垂直，加約40 μL含有適量上樣緩沖液的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳時，溫度為60 ℃，電壓為120 V，運行6 h。電泳后用SYBR Green Ⅰ進(jìn)行染色，染料用1×TAE以1∶10 000（V/V）稀釋，每次染液用量15 mL，染色15 min，共染3 次。染色完后用凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并用Quantity One 4.6.9軟件分析結(jié)果。

測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比較。將測序結(jié)果和代表性菌株的rRNA部分序列用程序ClustalX 2.0.11[14]進(jìn)行序列比對排序，采用UPGMA算法在軟件Mega 6.06構(gòu)建進(jìn)化樹[15]，分析親緣關(guān)系及相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

13 個不同品牌樣品SSU rRNA產(chǎn)物的DGGE結(jié)果如圖1所示。郫縣豆瓣醬樣品中真菌種群多樣性較高，不同品牌的豆瓣醬樣品真菌種群結(jié)構(gòu)有所不同。整體上，13 個樣品經(jīng)DGGE后都分離出清晰的電泳條帶。相對而言，樣品S5、S7、S8、S9的條帶豐度較低，且條帶亮度較弱，說明這4 個品牌豆瓣醬中的真菌多樣性有可能較低。圖1中各條帶的相對強(qiáng)度和遷移率不完全相同，表明這些樣品中既存在一些共有的真菌種群，又存在一些特有真菌，不同樣品間在真菌種群豐度上存在一定的差別。另外，強(qiáng)度高的條帶的遷移率也不完全相同，表明每個品牌真菌的優(yōu)勢種群也不完全一樣。如條帶3、4、7、11在樣品S2中是優(yōu)勢菌群，而在S10樣品中很弱或沒有檢測到；條帶14在S11和S13中是優(yōu)勢真菌，但在S3、4、5卻很弱或沒有檢測到。

圖1 郫縣豆瓣醬真菌群落DGGE圖Fig. 1 DGGE fingerprints of fungal communities in broad bean paste

表1 郫縣豆瓣醬真菌SSU亞基DGGE條帶測序結(jié)果Table1 Sequencing results for DGGE bands of fungal SSU in broad bean paassttee

由表1可知，總共對31 條序進(jìn)行了測序，其中有9 條序列與NCBI中序列的最大相似度低于95%（未列出）。在余下的22 條序列中，除條帶7，其余23 條序列最大相似度都在98%～100%。其中有兩個及以上條帶檢測到分別為假絲酵母（Candida）、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、黃曲霉（Aspergillus f avus）。奧默柯達(dá)酵母菌（Kodamaea ohmeri）已在豆類發(fā)酵產(chǎn)品[16]、啤酒[17]、腌制蔬菜中分離得到[18]。由圖1和表1可知，A. f avus為郫縣豆瓣醬的優(yōu)勢菌種，存在于所有品牌的樣品中，盡管目前生產(chǎn)的多數(shù)郫縣豆瓣黃曲霉毒素符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但仍然有個別黃曲霉毒素B1超標(biāo)的報道[19]?？紤]到郫縣豆瓣傳統(tǒng)工藝主要在開放環(huán)境下進(jìn)行，結(jié)合本研究的結(jié)果，表明郫縣豆瓣的生產(chǎn)應(yīng)該把防控黃曲霉放在非常重要的位置，避免成品中黃曲霉毒素超標(biāo)。

2.2 聚類分析

圖2 郫縣豆瓣醬中真菌的DGGE指紋圖譜聚類分析圖Fig. 2 Cluster analysis of DGGE profiles for fungal communities of broad bean paste

從圖2可知，初步可以將13 個郫縣豆瓣樣品分為4 類：第1類（S7、S2）、第2類（S1、S4、S5、S8、S10）、第3類（S6和S11）、第4類（S3、S9、S12、S13），這與DGGE電泳圖（圖1）的直觀反映一致，即這些郫縣豆瓣樣品中既存在一些共有的真菌種群，又存在一些特有真菌，或者不同樣品間在真菌種群豐度上存在一定的差別。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 郫縣豆瓣醬中真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of fungi in broad bean paste

從圖3可知，測序序列可以分為4 個類別，類別Ⅰ將大多數(shù)的序列聚在了一起，主要為Candida、Zygosaccharomyces屬和K. ohmeri，包含條帶2、4、7、8、9、12；類別Ⅱ為Malassezia obtuse，包含條帶10；類別Ⅲ為Capnobotryella sp.，包含條帶15；類別Ⅵ為A. flavus，包含13、17、18、22、23、26、27、29、30、31。表明從系統(tǒng)發(fā)育的角度，郫縣豆瓣真菌微生物具有一定多樣性。

3 討 論

PCR-DGGE技術(shù)能有效的分析微生物菌群變化[8,16]。前人研究表明，郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌有米曲霉（A. oryzae）、淀粉絲菌（Amylomyces rouxii）、米根霉（Rhizopus oryzae）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）的近緣種[20]；董丹等[21]采用純培養(yǎng)對兩個不同發(fā)酵時期豆瓣中微生物多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Pichia、Candida、Wickerhamomyces屬是真菌的優(yōu)勢菌群。本研究發(fā)現(xiàn)Candida sp.、Aspergillus、Z. rouxii、K. ohmeri是郫縣豆瓣醬的優(yōu)勢種群，與上述結(jié)論存在一些異同，這可能與取樣時間不同有關(guān)，如汪先丁等[20]在制曲階段（1、4、7 d）和發(fā)酵初期（14 d和30 d）取樣，而本研究的樣品都在后熟發(fā)酵6個月以上，后熟時間不同導(dǎo)致真菌菌群不一樣；也有可能是生產(chǎn)的原料有差異，導(dǎo)致原料自身所帶微生物菌群不同，在發(fā)酵過程中也有可能影響優(yōu)勢真菌菌群結(jié)構(gòu)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，Candida sp.和Z. rouxii在日本魚醬和醬油中作為優(yōu)勢菌種在發(fā)酵過程中出現(xiàn)[11,22-24]，具有較強(qiáng)的耐鹽能力，能在發(fā)酵過程中促進(jìn)風(fēng)味的形成[25]，表明上述兩種酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的優(yōu)勢功能微生物菌群。張先琴等[18]在分析四川泡菜微生物多樣性時發(fā)現(xiàn)，K. ohmeri是四川泡菜的優(yōu)勢真菌，但是其功能和作用還有待進(jìn)一步研究。

聚類分析可以將13 個郫縣豆瓣樣品分為4 類，而這13 個企業(yè)盡管都坐落于郫縣鏡內(nèi)，但是分布于郫縣的不同位置，不同位置的企業(yè)成品豆瓣醬在真菌多樣性上也可聚為一類，表明外界環(huán)境對郫縣豆瓣特有真菌群落結(jié)構(gòu)的形成作用不明顯。系統(tǒng)發(fā)育分析也可以將有效測序序列分為4 個類別，其中，Candida、Zygosaccharomyces屬和K. ohmeri聚為Ⅰ類，這些真菌已在其他傳統(tǒng)發(fā)酵食品廣泛報道[11,16-17]，而A. f avus單獨歸為Ⅳ類。

特別需要注意的是，代表A. f avus的條帶有10 條，占整個測序條帶的32.25%，表明郫縣豆瓣醬樣品易受到黃曲霉菌的污染。盡管目前生產(chǎn)的多數(shù)郫縣豆瓣黃曲霉毒素符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但由于郫縣豆瓣醬的生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，包含制瓣、制椒、后熟等環(huán)節(jié)，其中多個環(huán)節(jié)都在開放的發(fā)酵環(huán)境下進(jìn)行，而且相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)抽檢發(fā)現(xiàn)存在少數(shù)廠家樣品黃曲霉毒素B1超標(biāo)的現(xiàn)象，因此，進(jìn)一步研究郫縣豆瓣生產(chǎn)中易受黃曲霉菌污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并建立相關(guān)黃曲霉污染控制模型和相關(guān)防控措施十分必要。

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Analysis of Fungal Diversity of Different Commercial Brands of Pixian Broad Bean Paste Using PCR-DGGE Method

ZHU Yongqing, LI Zhihua, LI Huajia, WANG Xuetao, DONG Ling, HUANG Qiaolian
(Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

In this study, the fungal diversity and community structures of 13 brands of Pixian broad bean paste were analyzed using polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). The typical DGGE bands were sequenced, and a phylogenetic tree was constructed. The results showed that fungal diversity was abundant in the samples and both unique and common bands were identified. Candida sp., Aspergillus, Zygosaccharomyces rouxii and Kodamaea ohmeri were the predominant fungi. Especially, a total of 10 bands, accounting for 32.25% of the entire sequenced bands, were assigned to Aspergillus flavus. Thus, special attention should be paid to the prevention and control of A. flavus in the broad-bean paste industry.

broad bean paste; fungi; polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); diversity

10.7506/spkx1002-6630-201702017

TS201.3

A

1002-6630（2017）02-0104-05

朱永清, 李治華, 李華佳, 等. 基于PCR-DGGE分析不同品牌郫縣豆瓣醬真菌多樣性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 104-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702017. http://www.spkx.net.cn

ZHU Yongqing, LI Zhihua, LI Huajia, et al. Analysis of fungal diversity of different commercial brands of Pixian broad bean paste using PCR-DGGE method[J]. Food Science, 2017, 38(2): 104-108. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702017. http://www.spkx.net.cn

2016-09-06

四川省財政創(chuàng)新能力提升專項（2016GXTZ-008）；四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項目（2016QNJJ-020）；國家自然科學(xué)基金四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院補(bǔ)助項目（2015KXJJ-012）

朱永清（1968—），男，副研究員，博士，研究方向為果蔬加工與食品發(fā)酵。E-mail：zhuyongqing68@sina.com