紫杉醇關(guān)鍵酶基因TwDBAT在平菇中的遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.023

摘要：通過構(gòu)建含平菇內(nèi)源gpd啟動(dòng)子、紅豆杉中TwDBAT基因的真核表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT，建立高效的平菇原生質(zhì)體制備與再生體系；采用PEG介導(dǎo)法，將真核表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph共轉(zhuǎn)化高溫型平菇菌株F7E原生質(zhì)體，獲得可以異源表達(dá)TwDBAT基因的平菇菌株。PCR和Southern雜交鑒定結(jié)果表明，TwDBAT基因整合進(jìn)平菇基因組中；經(jīng)繼代培養(yǎng)，TwDBAT基因在轉(zhuǎn)化子中可穩(wěn)定遺傳。RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子在mRNA水平上轉(zhuǎn)錄了TwDBAT基因。HPLC結(jié)果顯示，TwDBAT酶可以催化底物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-DAB）。

關(guān)鍵詞：平菇；紫杉醇；紫杉醇前體物質(zhì)；關(guān)鍵酶基因；TwDBAT基因；遺傳轉(zhuǎn)化；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0098-05

收稿日期：2016-03-31

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：NJZC14383）。

作者簡(jiǎn)介：康?。?982—），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士，講師，主要從事植物病理及遺傳育種的教學(xué)研究工作。E-mail：kang_jun@163.com。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出的1種二萜類生物堿，因具有廣譜抗癌活性和獨(dú)特抗癌機(jī)制而受到人們青睞[1-3]。自紫杉醇的抗癌功效和作用機(jī)制被確定以來(lái)，特別是獲批準(zhǔn)用于臨床治療卵巢癌、乳腺癌，以及紫杉醇生物合成過程的某些關(guān)鍵酶的發(fā)現(xiàn)、克隆和高效表達(dá)，使得實(shí)現(xiàn)紫杉醇高效、穩(wěn)定生產(chǎn)成為研究熱點(diǎn)[3-4]。

中國(guó)特有瀕危植物南方紅豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰轉(zhuǎn)移酶（10-deacetylbaccatin Ⅲ-10β-O-acetyl transferase，DBAT）是紅豆杉屬植物紫杉醇生物合成途徑中的一個(gè)重要酶類[5-6]，其作用是將10-去乙酰巴卡亭Ⅲ轉(zhuǎn)換成巴卡亭Ⅲ，而巴卡亭Ⅲ不僅是生物合成紫杉醇的直接前體，也是紫杉醇生物合成途徑中的最后1個(gè)二萜類中間體，更是目前化學(xué)半合成紫杉醇的重要前體化合物，在緩解紫杉醇資源短缺問題中起著不可替代的作用。本研究在優(yōu)化制備高濃度的平菇菌絲原生質(zhì)體的基礎(chǔ)上，采用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的方法將含有平菇內(nèi)源性gpd-fvs啟動(dòng)子和TwDBAT基因（南方紅豆杉中的DBAT基因）的真核表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化高溫型平菇突變菌株F7E原生質(zhì)體，以獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)TwDBAT基因的轉(zhuǎn)基因平菇菌株，這將為紫杉醇生物合成途徑中其他重要酶基因遺傳轉(zhuǎn)化平菇提供技術(shù)路線和依據(jù)，并為平菇組合表達(dá)紫杉醇或紫杉醇前體物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

高溫型平菇突變菌株F7E，其菌絲體可在高溫下正常生長(zhǎng)，并能夠在20 ℃以上正常發(fā)育形成子實(shí)體、生物學(xué)效率較高的平菇突變體，為筆者所在實(shí)驗(yàn)室誘變篩選出的突變株[7]；真核表達(dá)載體pgFvs-mfc[8]、克隆載體pGEM-TwDBAT[9]均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT（含有平菇內(nèi)源性gpd-fvs啟動(dòng)子和TwDBAT基因）、表達(dá)載體 pgFvs-hph（含有平菇內(nèi)源性gpd-fvs啟動(dòng)子和hph基因）為本研究構(gòu)建。

1.2酶與試劑

ExTaq酶、dNTP、Taq DNA聚合酶、PrimeScriptTM RT-PCR Kit、EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM-T Easy載體，購(gòu)自Promega公司；Plant RNAout提取試劑盒，購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；溶壁酶，購(gòu)自廣東省微生物研究所；地高辛試劑盒，購(gòu)自Roche公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA測(cè)序由華大基因完成；甘露醇（MMC） buffer（50 mL）：25 mL 1 mol/L 甘露醇溶液，12.5 mL 0.2 mol/L Maleate buffer，1.25 mL 1 mol/L CaCl2，11.25 mL無(wú)菌去離子水；0.2 mol/L Maleate buffer（馬來(lái)酸緩沖液）：將0.2 mol/L馬來(lái)酸、0.2 mol/L 馬來(lái)酸鈉按1 ∶2比例混合，調(diào)節(jié)pH值至5.5，121 ℃ 滅菌15 min；1 mol/L CaCl2：稱取7.35 g CaCl2，用ddH2O定容至50 mL，過濾除菌；山梨醇（100 mL）：稱取 18.2 g 山梨醇，分別加入1 mL 1 mol/L Tris-Cl（pH值7.5）、2.5 mL 1 mol/L CaCl2，加ddH2O定容至100 mL，121 ℃滅菌15 min；PEG buffer（20 mL）：5.0g PEG 4000，0.2 mL 1 mol/L Tris-Cl （pH值為7.5），0.5 mL 1 mol/L CaCl2，加ddH2O至20 mL，加熱至60 ℃過濾除菌，用小管分裝后于-40 ℃?zhèn)溆?；其他試劑均為?guó)產(chǎn)分析純。

1.3培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯，20 g葡萄糖，10 g瓊脂粉，加水至1 L，常規(guī)方法配制。PDB液體培養(yǎng)基：在PDA固體培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上去掉瓊脂粉。平菇原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別加入蔗糖、甘露醇、氯化鈉、氯化鉀，使其終濃度均為0.6 mol/L。

1.4引物

根據(jù)TwDBAT基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)PCR特異引物，用來(lái)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA中是否存在TwDBAT基因，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。鑒定引物對(duì)：13F1（5′-TTAGAGAGAGTGATGGTGGCT-3′）、13R1（5′-TTCTTGGGAGGTCGTATGA-3′），預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為1 184 bp；13F2（5′-ACATCCATCCTCTGGTGGTTCA-3′）、13R2（5′-CTTCATCAAATCCCAATCGCCT-3′），預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為699 bp。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1平菇表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph的構(gòu)建質(zhì)粒抽提、限制酶酶切、DNA片段回收及連接按試劑說明書進(jìn)行。用SpeⅠ、BsrGⅠ分別雙酶切質(zhì)粒pGEM-TwDBAT、pgFvs-mfc、pBgGI-hph，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后割膠，分別回收大片段、小片段，并用T4DNA連接酶分別連接大小片段，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行菌落PCR、雙酶切及測(cè)序。

1.5.2平菇原生質(zhì)體制備與再生收集液體PDB培養(yǎng)基中的平菇菌絲，分別用無(wú)菌水、穩(wěn)滲劑沖洗3次，平菇原生質(zhì)體制備與再生參照Kuo等的方法[10]，溶壁酶酶液濃度為15%，所得原生質(zhì)體最后用0.6 mol/L KCl保存。

1.5.3培養(yǎng)方式對(duì)原生質(zhì)體再生的影響將原生質(zhì)體按以下3種方式接種培養(yǎng)，以分析培養(yǎng)方式對(duì)原生質(zhì)體再生的影響，本試驗(yàn)平行進(jìn)行3次。（1）直接涂布平板培養(yǎng)法：用液體再生培養(yǎng)基將新制備的原生質(zhì)體懸液稀釋到106個(gè)/mL左右，取0.1 mL直接涂布在含2%瓊脂的再生培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d。（2）預(yù)培養(yǎng)法：用液體再生培養(yǎng)基將新制備的原生質(zhì)體懸液稀釋到106個(gè)/mL左右，25 ℃預(yù)培養(yǎng)24 h后，取 0.1 mL 涂布于含2%瓊脂的再生培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d。（3）雙層平板培養(yǎng)法：先在培養(yǎng)皿中倒1層含2%瓊脂的再生培養(yǎng)基，冷凝后，將0.1 mL原生質(zhì)體懸液（106個(gè)/mL）與預(yù)熱的含1%瓊脂的半固體再生培養(yǎng)基于40 ℃混勻，傾注于固體再生培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d。

1.5.4平菇菌絲體對(duì)潮霉素的最低敏感濃度將活化后的供試菌株接種于含有不同終濃度潮霉素的PDA平板（0、25、50、75、100、125、150 μg/mL）中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察結(jié)果，測(cè)量菌落直徑，選擇完全抑制供試菌生長(zhǎng)的最低潮霉素濃度。

1.5.5平菇原生質(zhì)體對(duì)潮霉素的最低敏感濃度將平菇原生質(zhì)體稀釋到105～106個(gè)/mL左右，取0.1 mL直接涂布于含不同終濃度潮霉素（0、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的再生培養(yǎng)基平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察結(jié)果，測(cè)量菌落直徑，選擇完全抑制供試菌原生質(zhì)體再生的最低潮霉素濃度。

1.5.6PEG法轉(zhuǎn)化平菇菌絲原生質(zhì)體將新鮮平菇原生質(zhì)體懸浮于MMC buffer中，使其終濃度為1×108個(gè)/mL；在分裝有50 μL原生質(zhì)體的管中，分別加入5 μg質(zhì)粒pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph，另設(shè)1管不加質(zhì)粒作為對(duì)照；每管中各加入12.5 μL PEG buffer，冰浴20 min；加入0.5 mL PEG buffer，混勻后于28 ℃溫育15 min；加入1.0 mL STC buffer；小心混勻后將其轉(zhuǎn)入10 mL液體再生培養(yǎng)基中，25 ℃預(yù)培養(yǎng) 48 h；預(yù)培養(yǎng)后于4 000 r/min離心10 min，棄上清，用1.0 mL液體再生培養(yǎng)基將原生質(zhì)體重新懸浮。按200～250 μL/皿的量涂布在PDSA培養(yǎng)基上（含潮霉素HmB，濃度為 40 μg/mL），25 ℃培養(yǎng)7 d；待原生質(zhì)體萌發(fā)成再生菌落后，在其上覆蓋1層含0.8%瓊脂的固體PDSA（含潮霉素HmB，濃度為75 μg/mL）；待夾層培養(yǎng)基上長(zhǎng)出再生菌落，即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.5.7陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的挑選固體平板培養(yǎng)初篩：用無(wú)菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化平板上菌落的小部分，轉(zhuǎn)接于HmB濃度為 75 μg/mL 的PDSA平板上，培養(yǎng)10 d以上觀察各陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況，同時(shí)設(shè)1管陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化平菇原生質(zhì)體）。選取接種后10 d內(nèi)可以連續(xù)生長(zhǎng)的菌絲體，作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，待做PCR鑒定。

液體搖瓶培養(yǎng)初篩：將轉(zhuǎn)化平板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的剩余部分接種于3 mL HmB濃度為75 μg/mL的PDSB試管中，同時(shí)設(shè)1管陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化平菇原生質(zhì)體），180 r/min、25 ℃搖床培養(yǎng)5 d。丟棄肉眼不可見菌體的試管，收集有菌試管內(nèi)菌體（陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子），待做PCR鑒定。

1.5.8陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR和RT-PCR鑒定以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌絲基因組DNA、cDNA為模板，用2對(duì)引物（13F1、13R1與13F2、13R2）進(jìn)行PCR、RT-PCR擴(kuò)增TwDBAT基因（1 184 bp）及其片段（699 bp）。以表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)化平菇基因組DNA、cDNA為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 60 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用TaKaRa凝膠回收試劑盒回收DNA片段，并由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的DBAT基因序列進(jìn)行對(duì)比分析。

1.5.9轉(zhuǎn)化子的Southern Blot分析用CTAB法提取PCR、RT-PCR鑒定呈陽(yáng)性的菌絲基因組DNA。每個(gè)菌株樣品取30～50 μg基因組DNA，選用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切過夜。酶切完全后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳使各片段按照分子大小依次分開，利用向下毛細(xì)管印跡法將酶切片段由凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。Southern雜交中的探針標(biāo)記、雜交等按照Roche公司生產(chǎn)的地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒操作方法進(jìn)行。

1.5.10轉(zhuǎn)化子菌絲體遺傳穩(wěn)定性分析取Southern雜交鑒定正確的轉(zhuǎn)化子菌絲體，轉(zhuǎn)接于無(wú)潮霉素選擇壓力的PDA固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5次后，再次轉(zhuǎn)入含有75 μg/mL潮霉素的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)10 d。挑選具有抗潮霉素抗性、可以正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，提取菌絲體基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。

1.5.11轉(zhuǎn)化子菌絲體TwDBAT酶活性研究按Patel等的方法[11-12]，并略加修改。將轉(zhuǎn)化子菌絲體用液氮研磨后，用TE緩沖液于4 ℃浸提60 min；6 000 r/min離心10 min，上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度為90%，充分?jǐn)嚢韬螅? ℃放置過夜；12 000 r/min離心20 min，將沉淀物轉(zhuǎn)入透析袋中，放入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值7.5）中透析過夜，其間多次更換透析液。透析后的蛋白酶液與5 mmol/L MgCl2、10-DAB （400 μmol/L）、acetyl CoA （400 μmol/L）混合，31 ℃反應(yīng)3 h。將反應(yīng)液用50 mL乙酸乙酯在30 ℃恒溫下振搖提取30 min，反復(fù)提取3次。合并乙酸乙酯，減壓蒸干，用1 mL流動(dòng)相溶解殘留物，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，待測(cè)定。HPLC條件：色譜柱Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相水 ∶甲醇 ∶乙腈=70 ∶20 ∶10，流速1.5 mL/min，平衡時(shí)間5.0 min，UV檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm，進(jìn)樣量 20 μL。

2結(jié)果與分析

2.1平菇表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph的構(gòu)建

將PCR鑒定和SpeⅠ、BsrGⅠ雙酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致的陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)BLAST比對(duì)，測(cè)序結(jié)果與公布的DBAT、hph基因的同源性為99.9%，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功，分別命名為pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph（圖1）。

2.2平菇原生質(zhì)體制備與再生率

綜合不同因素對(duì)平菇原生質(zhì)體制備的影響，選取各因素中的最優(yōu)參數(shù)，優(yōu)化平菇原生質(zhì)體制備條件。研究發(fā)現(xiàn)：液體培養(yǎng)5 d的平菇菌絲，以0.6 mol/L KCl作為穩(wěn)滲劑，加入15%溶壁酶，在25 ℃下酶解平菇菌絲3 h時(shí)，分離得到的原生質(zhì)體效果最佳，原生質(zhì)體產(chǎn)量為5×107～8×108個(gè)。

分別采用預(yù)培養(yǎng)法、直接涂抹法、雙層培養(yǎng)法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明：雙層培養(yǎng)法通過將原生質(zhì)體包埋于半固體培養(yǎng)基中，傾倒于再生培養(yǎng)基上，機(jī)械損傷較小，有利于原生質(zhì)體的再生，但操作比較繁瑣，且半固體培養(yǎng)基的溫度難以控制，稍低會(huì)使培養(yǎng)基凝固，過高容易使原生質(zhì)體失活；直接涂抹法操作簡(jiǎn)單方便，但會(huì)帶來(lái)機(jī)械損傷，破壞原生質(zhì)體；預(yù)培養(yǎng)法兼具直接涂抹法、雙層培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)，采用預(yù)培養(yǎng)法效果比較好，原生質(zhì)體再生率可達(dá)6.32%。

2.3平菇菌絲體、原生質(zhì)體對(duì)潮霉素的最低敏感濃度

將高溫型平菇突變菌株F7E接種在含不同濃度潮霉素的PDA平板上培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著潮霉素濃度的增加，菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)逐漸降低；當(dāng)潮霉素濃度為 50 μg/mL 時(shí)，菌絲在平板上可以微弱生長(zhǎng)；當(dāng)潮霉素濃度為75 μg/mL時(shí)，菌絲無(wú)法生長(zhǎng)。因此可以確定，平菇突變菌株F7E菌絲對(duì)潮霉素的最低敏感濃度為75 μg/mL。

制備高溫型平菇突變菌株F7E的原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體稀釋到106個(gè)/mL，取0.1 mL原生質(zhì)體直接涂布于含不同終濃度潮霉素再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著潮霉素濃度的增加，原生質(zhì)體的再生率降低；當(dāng)潮霉素濃度為20 μg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的再生率為0.02%；當(dāng)潮霉素濃度為30 μg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的再生率為0。因此，確定平菇突變菌株F7E原生質(zhì)體對(duì)潮霉素的最低敏感濃度為30 μg/mL。

2.4PEG法轉(zhuǎn)化平菇菌絲原生質(zhì)體

利用PEG介導(dǎo)方法，將質(zhì)粒pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph共轉(zhuǎn)化平菇原生質(zhì)體，經(jīng)潮霉素抗性平板篩選后，在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色菌落；轉(zhuǎn)化后，在含有潮霉素的再生篩選培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pgFvs-TwDBAT、pgFvs-hph的共轉(zhuǎn)化子或只轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pgFvs-hph的單轉(zhuǎn)化子才能正常生長(zhǎng)（圖2）。

2.5Southern雜交

從篩選培養(yǎng)基上挑出擬轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定篩選轉(zhuǎn)化子。通過CTAB法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA。酶切后的轉(zhuǎn)化子基因組DNA經(jīng)轉(zhuǎn)膜，與地高辛標(biāo)記的TwDBAT探針雜交后，經(jīng)分析可知：6個(gè)轉(zhuǎn)化子基因組DNA和陽(yáng)性質(zhì)粒都可與TwDBAT探針雜交在膜上顯出特異的條帶，而泳道7、空白對(duì)照非轉(zhuǎn)基因平菇菌株則沒有出現(xiàn)與TwDBAT探針雜交的信號(hào)帶（圖3）。這表明TwDBAT基因已經(jīng)整合到6個(gè)轉(zhuǎn)化子（t2、t4、t5、t7、t11、t12）的染色體基因組上，而轉(zhuǎn)化子t20則沒有被整合，推斷可能是由于PCR的假陽(yáng)性造成的。對(duì)雜交條帶的數(shù)量、信號(hào)強(qiáng)度、出現(xiàn)位置的進(jìn)行進(jìn)一步分析可知，除轉(zhuǎn)化子t7（泳道4）僅有1條微弱的雜交信號(hào)外，其余轉(zhuǎn)化子一般都有2～3條雜交信號(hào)的條帶，其信號(hào)強(qiáng)度和出現(xiàn)的位置也各不相同，其中轉(zhuǎn)化子t5、t11、t12（泳道3、5、6）雜交信號(hào)條帶位置和信號(hào)強(qiáng)度幾乎一致，它們可能為同一株轉(zhuǎn)化子。因此，根據(jù)PCR、RT-PCR結(jié)果和Southern Blot分析結(jié)果，可以得出TwDBAT基因是成功地以多拷貝隨機(jī)插入到轉(zhuǎn)化子染色體DNA中的。

2.6轉(zhuǎn)化子的RT-PCR鑒定結(jié)果

將PCR鑒定和Southern Blot分析正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（t2、t4、t5、t7、t11、t12）菌絲體提取RNA，進(jìn)行RT-PCR。由圖4可知，在對(duì)照CK-未擴(kuò)增出目的條帶的情況下，各轉(zhuǎn)化子均有與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。這表明在轉(zhuǎn)基因平菇轉(zhuǎn)化子中，TwDBAT基因已在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上得到表達(dá)。

2.7轉(zhuǎn)化子菌絲體遺傳穩(wěn)定性分析

將PCR鑒定和Southern Blot鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（t2、t4、t5、t7、t11、t12）菌絲體分別轉(zhuǎn)接10次，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子菌絲體遺傳穩(wěn)定性研究。由圖5可見，轉(zhuǎn)化子的S10代菌絲體仍對(duì)潮霉素具有一定抗性，可以在潮霉素抗性平板上正常生長(zhǎng)。對(duì)S10代的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定可知：6個(gè)轉(zhuǎn)化子中都擴(kuò)增出與表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT相同的目的基因TwDBAT特異條帶，大小約為1 184 bp，與預(yù)期理論目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相符。由此初步推斷，平菇轉(zhuǎn)化子以轉(zhuǎn)接菌絲方式，經(jīng)過10次菌絲轉(zhuǎn)接繁殖后，其基因組DNA仍含有外源TwDBAT基因。

2.8轉(zhuǎn)化子TwDBAT酶活性檢測(cè)

將提取的轉(zhuǎn)化子蛋白酶提取物與底物10-DAB混合反應(yīng)后，利用HPCL方法對(duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行檢測(cè)分析。

由圖6可知，當(dāng)添加底物10-DAB時(shí)，對(duì)照非轉(zhuǎn)化子和轉(zhuǎn)化子提取物反應(yīng)液HPLC色譜圖存在一定的差異，轉(zhuǎn)化子提取物在7.65 min時(shí)出現(xiàn)了1個(gè)明顯的分離小峰（圖 6-B），而該峰與產(chǎn)物巴卡亭Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間一致；而在同等條件下，對(duì)照非轉(zhuǎn)化子并無(wú)此峰出現(xiàn)（圖6-A），這種差異可能是轉(zhuǎn)化子表達(dá)外源TwDBAT酶蛋白催化底物 10-DAB 而生成產(chǎn)物巴卡亭Ⅲ所引起的。

3討論

隨著紫杉醇代謝途徑的逐步闡明和相關(guān)酶基因的成功克隆[12-14]，通過代謝工程，在微生物中組合表達(dá)紫杉醇生物合成重要酶基因，利用“微生物工廠”來(lái)直接生產(chǎn)紫杉醇，或者生產(chǎn)中間物質(zhì)，進(jìn)而再通過化學(xué)半合成的方法生產(chǎn)紫杉醇將是具有廣闊前景的、較為可行的途徑。目前，已在大腸桿菌和酵母中進(jìn)行紫杉醇組合表達(dá)的研究[4，6，15-16]，并生成了紫杉烷類化合物，實(shí)現(xiàn)了由非紫杉烷類產(chǎn)生菌獲得紫杉烷類化合物的突出研究成果，使人們看到了利用生物技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇前體的廣闊前景。

PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，操作簡(jiǎn)單，是食用菌遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多的一種方法，已在雙孢蘑菇、糙皮側(cè)耳、云芝、靈芝、草菇、灰蓋鬼傘、平菇[17-18]等食用菌中成功應(yīng)用。本研究成功采用PEG介導(dǎo)法，首次將含平菇內(nèi)源gpd啟動(dòng)子和紅豆杉中紫杉醇生物合成途徑中的TwDBAT基因的真核表達(dá)載體pgFvs-TwDBAT轉(zhuǎn)入高溫型平菇菌株F7E原生質(zhì)體中，其轉(zhuǎn)化結(jié)果與Kuo等的PEG原生質(zhì)體介導(dǎo)法[10，19]一致，都表明PEG原生質(zhì)體介導(dǎo)法可成功應(yīng)用于平菇遺傳轉(zhuǎn)化研究。此外，本試驗(yàn)中采用的內(nèi)源性gpd啟動(dòng)子遺傳轉(zhuǎn)化平菇結(jié)果與Cheng等研究結(jié)果[8，10，20]一致，說明內(nèi)源性gpd啟動(dòng)子有利于受體細(xì)胞調(diào)控因子的識(shí)別，可以減少甲基化，促進(jìn)外源基因整合到染色體上；平菇內(nèi)源性gpd啟動(dòng)子是平菇遺傳轉(zhuǎn)化、有效控制外源功能基因正確表達(dá)的一個(gè)重要控制元件。

遺傳轉(zhuǎn)化成功后，外源基因能否在轉(zhuǎn)基因植株的后代中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)是基因工程技術(shù)研究中備受關(guān)注的問題，外源基因整合到受體基因組后產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)是多樣的，在受體植株中的遺傳行為也是非常復(fù)雜的。楊飛蕓等在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因草菇菌絲繼代遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因草菇菌絲中afp基因已經(jīng)丟失[21-22]，可能因?yàn)椴莨骄z是多核的，在多次繼代接種過程中接種了不含目的基因的菌絲，造成細(xì)胞中外源基因的丟失。在本研究中，對(duì)平菇轉(zhuǎn)化子進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該平菇轉(zhuǎn)化子可穩(wěn)定遺傳外源基因TwDBAT， 這與

李巍等的bFGF基因遺傳轉(zhuǎn)化平菇的研究結(jié)果[23]一致。

本研究首次成功建立的平菇異源表達(dá)紅豆杉中紫杉醇生物合成途徑上的TwDBAT基因遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)研究，將為紫杉醇生物合成途徑中的其他重要酶基因（例如GGPP合酶、紫杉烯合酶、紫杉烯5α-羥基化酶、紫杉烯醇5α-乙酰氧化基轉(zhuǎn)移酶、紫杉烷10β-羥基化酶、紫杉烷7β-羥基化酶基因等）遺傳轉(zhuǎn)化平菇提供技術(shù)路線和依據(jù)，并為平菇組合表達(dá)紫杉醇或紫杉醇前體物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

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